Eine effiziente Methode zur gerichteten Hepatozyten-ähnlichen Zellinduktion aus menschlichen embryonalen Stammzellen

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen (hESCs) in funktionelle hepatozytenähnliche Zellen (HLCs) durch kontinuierliche Ergänzung von Activin A und CHIR99021 während der hESC-Differenzierung zu definitivem Endoderm (DE).

Humane embryonale Stammzellen-abgeleitete Hepatozyten-ähnliche Zellen sind nützlich bei der Krankheitsmodellierung und beim Drogenscreening. Dies ist eine effiziente und reproduzierbare Methode, um die Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen in funktionelle hepatozytenähnliche Zellen effektiv zu induzieren. Ein undifferenzierter Status und ein angemessener Zusammenfluss menschlicher embryonaler Stammzellen sind entscheidend für eine erfolgreiche Differenzierung zu hepatozytenähnlichen Zellen.

Für die Stammzellpflege sterile Sechs-Well-Gewebekultur-behandelte Platten mit einem Milliliter 1X humanem embryonalem Stammzell-qualifiziertem Matrigel pro Vertiefung beschichten und über Nacht bei vier Grad Celsius lagern. Lassen Sie die Platten vor Gebrauch 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Die kryokonservierten HESEs in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad drei Minuten ohne Schütteln auftauen und dann die Stammzellen sofort durch Pipettieren in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit vier Millilitern vorgewärmtem, 37 Grad Celsius mTESR-Medium übertragen.

Zentrifugieren Sie die HESEs und saugen Sie den Überstand an, dann suspendieren Sie die Zellen vorsichtig in einem Milliliter mTESR-Medium. Saugen Sie das DMEM F-12 Medium von der Platte ab. Säen Sie die Zellen in eine Sechs-Well-Platte mit einer Dichte von 1 x 10 bis zur 5. Zellen in zwei Milliliter mTESR und inkubieren Sie sie in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator.

Pflegen Sie die Zellen, indem Sie das Medium täglich durch vorgewärmtes mTESR-Medium ersetzen. Passage der Zellen bei etwa 70 bis 80% Konfluenz oder wenn die Zellkolonien beginnen, Kontakt aufzunehmen. Für Die Passaging-Zellen das Medium absaugen und die Zellen mit einem Milliliter pro Vertiefung Enzymlösung fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Übertragen Sie die Zellen, indem Sie sie in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit vier Millilitern DMEM F-12 vorgewärmt auf 37 Grad Celsius geben. Bereiten Sie 24-Well-Platten vor, indem Sie sie mit 250 Mikrolitern 1X hESC-qualifiziertem Matrigel-Medium beschichten. Samen-hESCs mit einer Dichte von 1 bis 1,5 mal 10 bis zur 5. Zellzahl pro Vertiefung in 500 Mikroliter mTESR-Medium.

Fügen Sie sowohl Activin A zu einer Endkonzentration von 100 Nanogramm pro Milliliter als auch CHIR99021 zu einer Endkonzentration von drei Mikromolaren in einem geeigneten Volumen des vorgewärmten Differenzierungsgrundmediums der Stufe eins hinzu. Nach drei Tagen der Differenzierung sollten differenzierte Zellen Marker definitiver Endodermzellen wie FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 und FOXA1 exprimieren. Am dritten Tag der Differenzierung das Medium absaugen, durch Medium der zweiten Stufe ersetzen und 24 Stunden lang inkubieren.

Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag an den Tagen vier bis acht. Nach acht Tagen der Differenzierung sollten differenzierte Zellen geeignete Marker von hepatischen Vorläuferzellen wie HNF4 alpha, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA exprimieren. Am achten Tag saugen Sie das Medium der zweiten Stufe aus den Zellen ab und ersetzen Sie es durch das Medium der stufe drei.

Lassen Sie die Zellen 10 Tage lang bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator inkubieren und wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag mit frisch hinzugefügten Differenzierungsfaktoren. Nach 18 Tagen der Differenzierung sollten differenzierte Zellen charakteristische Marker von Hepatozyten wie AAT, ALB, TTR, HNF4 alpha, NTCP, ASGR1, CYP3A4 exprimieren. Das schematische Diagramm von Hepatozyten-ähnlichen Zellen aus hESCs und Hellfeldbilder jeder Differenzierungsstufe werden gezeigt.

Im ersten Stadium wurden Activin A und CHIR99021 drei Tage lang zugegeben, um Stammzellen zur Bildung von Endodermzellen zu induzieren. Im zweiten Stadium differenzierten sich die Endodermzellen zu hepatischen Vorläuferzellen, nachdem sie fünf Tage lang mit einem Differenzierungsmedium behandelt worden waren. Im dritten Stadium, nach 10 Tagen, waren frühe Hepatozyten gereift und differenzierten sich zu Hepatozyten-ähnlichen Zellen im Hepatozytenwachstumsfaktor und Oncostatin.

In der letzten Phase der Differenzierung zeigten die Zellen einen typischen Hepatozytenphänotyp. RT-PCR, Immunfluoreszenzfärbung und Western Blotting wurden verwendet, um Marker von Endodermzellen, Lebervorläuferzellen und reifen Hepatozyten nachzuweisen. Die differenzierten Zellen zeigten in jedem Stadium hohe Expressionsniveaus an differenzierungsbezogenen Genen und Proteinen, wie die Endodermmarker SOX17 am dritten Tag, der Lebervorläufermarker HNF4 alpha am achten Tag, AFP am Tag 14 und der reife Hepatozytenmarker ALB am Tag 18.

Die HLCs wiesen eine grüne Färbung und eine ausgedehnte Zytoplasmasäureverschiebung auf. Die Hepatozyten zeigten eine typische zweikernige Morphologie. Die enzymatische Aktivität von CYP3A4, dem essentiellen metabolischen CYP in der Leber in HLCs, wurde mit einem Enzymassay bestätigt.

Die Ansiedlung menschlicher embryonaler Stammzellen in einer angemessenen Dichte und die beginnende Differenzierung zum folgenden Datum sind entscheidend. Berühren Sie im ersten Stadium das Medium vorsichtig, da die Zellen dazu neigen, nach oben zu schweben. Die Kombination von Aktivin A und anderen kleinen Molekülen kann die Differenzierungseffizienz weiter verbessern und bei diesem Verfahren reifere hepatozytenähnliche Zellen produzieren.

Diese Technik kann eine Plattform bieten, um Hepatozytentransplantation, Lebergewebe-Engineering, biokünstliche Lebern und Krankheitsmodellierung zu erforschen.