Name: Verwendung einer zeitaufgelösten proteininduzierten Fluoreszenzverstärkung zur Identifizierung stabiler lokaler Konformationen jeweils α-Synuclein-Monomer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Erfahren Sie die zeitaufgelöste proteininduzierte Fluoreszenzverstärkung zur Identifizierung stabiler lokaler Konformationen von α-Synuclein-Monomeren. Diese Methode erfasst ortsspezifische Strukturunterpopulationen und ergänzt FRET-Messungen.

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Das pT-t7-Plasmid, das für A56C α-Syn-Mutant kodiert, wurde uns von Dr. Asaf Grupi, Dr. Dan Amir und Dr. Elisha Haas geschenkt. Dieses Papier wurde von den National Institutes of Health (NIH, Grant R01 GM130942 an E.L. als Unterpreis), der Israel Science Foundation (Grant 3565/20 im Rahmen des KillCorona - Curbing Coronavirus Research Program), dem Milner Fund und der Hebrew University of Jerusalem (Startfonds) unterstützt.

Alle Autoren teilen keinen Interessenkonflikt.

Umfangreiche biochemische und biophysikalische Studien wurden durchgeführt, um die strukturellen Eigenschaften von α-Syn und seine ungeordnete Natur zu untersuchen33,34,35,36,37,38. Mehrere Arbeiten haben bereits frei diffundierendes smFRET verwendet, um die intramolekulare Dynamik des bindungsfreien α-Syn-Monomers zu untersu...

In den letzten zwei Jahrzehnten haben sich Einzelmolekül-Fluoreszenz-basierte Methoden zueinemleistungsfähigen Werkzeug zur Messung von Biomolekülen 1 ,2entwickelt,um zu untersuchen, wie sich verschiedene biomolekulare Parameter verteilen und wie sie dynamisch zwischen verschiedenen Subpopulationen dieser Parameter mit einer Auflösung von submillisekunden3,4,5interkonvertieren. Die Parameter in diesen Techniken umfassen die Energieeffizienz in den FRET-Messungen 6,7, Fluoreszenzanisotropie8,9, Fluoreszenzquantenausbeuten undLebensdauern 10,11, als Funktion verschiedener Fluoreszenzlöschungsmechanismen12 oderVerstärkung 13. Einer dieser Mechanismen, besser bekannt als proteininduzierte Fluoreszenzverstärkung (PIFE)14, führt die Verbesserung der Fluoreszenzquantenausbeute und -lebensdauer als Funktion der sterischen Obstruktion der freien Isomerisierung des Fluorophors im angeregten Zustand ein, verursacht durch Proteinoberflächen in der Nähe des Farbstoffs14,15,16,17,18,19 . Sowohl FRET als auch PIFE gelten als spektroskopische Lineale oder Näherungssensoren, da ihr gemessener Parameter direkt mit einer räumlichen Messung innerhalb des markierten zu messenden Biomoleküls verbunden ist. Während die FRET-Effizienz mit dem Abstand zwischen einem Farbstoffpaar in einem Bereich von 3-10 nm20zusammenhängt, verfolgt PIFE Erhöhungen der Fluoreszenzquantenausbeuten oder Lebensdauern in Bezug auf den Abstand zwischen dem Farbstoff und einer Oberfläche eines nahe gelegenen Proteins im Bereich von 0-3 nm19.
Einzelmolekül-FRET wurde häufig verwendet, um strukturelle Einblicke in viele verschiedene Proteinsysteme zu geben, einschließlich intrinsisch ungeordneter Proteine (IDPs)21,wie α-Synuclein (α-Syn)22. α-Syn kann nach Bindung an verschiedene Biomoleküle und unter verschiedenenBedingungen geordneteStrukturen bilden 23,24,25,26,27,28,29,30. Wenn es jedoch ungebunden ist, zeichnet sich das α-Syn-Monomer durch eine hohe Konformationsheterogenität mit schnell ineinander überlagernden Konformationenaus 31,32.
Die Konformationen von α-Syn wurden zuvor mit verschiedenen Techniken untersucht, die bei der Identifizierung der Konformationsdynamik solcher hochheterogenen und dynamischen Proteinsystemehelfen 33,34,35,36,37,38,39. Interessanterweise ergaben Einzelmolekül-FRET-Messungen (smFRET) von α-Syn im Puffer eine einzelne FRET-Population39,40, die ein Ergebnis der Zeitmittelung von Konformationen ist, die sich manchmal viel schneller als die typische Diffusionszeit von α-Syn durch den konfokalen Punkt dynamisch interkonvertieren (mal so schnell wie wenige Mikrosekunden und sogar schneller als das, relativ zu typischen Millisekunden-Diffusionszeiten)40, 41. Die Verwendung eines SPEKT-SPEKT-Lineals mit der Entfernungsempfindlichkeit von 3-10 nm berichtet jedoch manchmal nur über allgemeine strukturelle Veränderungen in einem kleinen Protein wie α-Syn. Einzelmolekülmessungen mit spektroskopischen Näherungssensoren mit kürzeren Entfernungsempfindlichkeiten haben das Potenzial, über die Dynamik lokaler Strukturen zu berichten. Hierin führen wir Einzelmolekül-PIFE-Messungen von α-Syn durch und identifizieren verschiedene Subpopulationen von Fluoreszenzlebenszeiten, die auf verschiedene lokale Strukturen mit Übergängen zwischen ihnen von bis zu 100 ms abgebildet sind. Diese Arbeit fasst zeitaufgelöste smPIFE-Messungen von frei diffundierenden α-Syn-Molekülen einzeln, in Puffer und gebunden an SDS-basierte Membranen als SDS-basierten Einzelmolekül-Näherungssensor mit kurzer Reichweite zusammen.

<table><tbody><tr><td>Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheiten</td><td>Merc</td><td>C7715</td><td>Cutoff: 100 kDa</td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Cysteamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>Dialysebeutel - MEGA GeBaFlex-Tube</td><td>Gene Bio-Application</td><td>MEGA320</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Schnelle SeeBand-Färbelösung</td><td>Gen-Bio-Anwendung</td><td>SB050</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Entsalzung 5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1408</td><td></td></tr><tr><td>6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure (TROLOX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3152</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>MonoQ-Säule</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54807</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Röhrchen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EP0030108094</td><td>0,5 mL</td></tr> Spülen <tr><td>eines &Mikro;-Objektträgers 18</td><td>Ibidi</td><td>81816</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Monobasisches Natriumphosphat-Monohydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71507</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Zellspachtel, Drigalski Spatel</td><td>mini-plast</td><td>815-004-05-001</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycinsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-Cy3&nbsp; Maleimid</td><td>abcam</td><td>ab146493</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75259</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93363</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625</td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung einer zeitaufgelösten proteininduzierten fluoreszenzverstärkung zur identifizierung stabiler lokaler konformationen jeweils α-synuclein-monomer

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Die Verwendung spektroskopischer Lineale zur Verfolgung mehrerer Konformationen einzelner Biomoleküle und ihrer Dynamik hat das Verständnis der Strukturdynamik und ihrer Beiträge zur Biologie revolutioniert. Während das FRET-basierte Lineal über Interfarbstoffabstände im Bereich von 3-10 nm berichtet, berichten andere spektroskopische Techniken, wie die proteininduzierte Fluoreszenzverstärkung (PIFE), über die Nähe zwischen einem Farbstoff und einer Proteinoberfläche im kürzeren Bereich von 0-3 nm. Unabhängig von der gewählten Methode ruft seine Verwendung bei der Messung frei diffuser Biomoleküle einzeln Histogramme des experimentellen Parameters ab, die separate zentral verteilte Teilpopulationen von Biomolekülen ergeben, wobei jede Teilpopulation entweder eine einzelne Konformation darstellt, die innerhalb von Millisekunden unverändert blieb, oder mehrere Konformationen, die viel schneller als Millisekunden ineinander übergehen, und damit eine gemittelte Teilpopulation. Bei Einzelmolekül-FRET, bei dem der in Histogrammen berichtete Parameter die Interfarbstoff-FRET-Effizienz ist, wurde zuvor berichtet, dass ein intrinsisch ungeordnetes Protein, wie das α-Synuclein-Monomer im Puffer, eine einzige gemittelte Teilpopulation mehrerer Konformationen aufweist, die sich schnell ineinander überlagern. Während diese früheren Ergebnisse vom 3-10 nm-Bereich des FRET-basierten Lineals abhängen, haben wir versucht, dieses Protein mit Einzelmolekül-PIFE zu testen, wo wir die Fluoreszenzlebensdauer von ortsspezifischen sCy3-markierten α-Synuclein-Proteinen nacheinander verfolgen. Interessanterweise zeigt der sCy3-markierte α-Synuclein mit diesem spektroskopischen Näherungssensor mit kürzerer Reichweite mehrere lebenslange Subpopulationen mit deutlich unterschiedlichen mittleren Lebenszeiten, die sich in 10-100 ms interkonvertieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass α-Synuclein zwar global ungeordnet ist, aber dennoch stabile lokale Strukturen erreicht. Zusammenfassend heben wir in dieser Arbeit den Vorteil der Verwendung verschiedener spektroskopischer Näherungssensoren hervor, die lokale oder globale Strukturveränderungen jeweils ein Biomolekül nach dem anderen verfolgen.

Als IDP, wenn es nicht an ein anderes Biomolekül gebunden ist, zeigt α-Syn strukturelle Dynamik zwischen mehreren Konformationen, mit Übergängen bei wenigen Mikrosekunden40 und sogar bei Hunderten von Nanosekunden41. Wenn α-Syn den konfokalen Punkt kreuzt, kann er Tausende von Übergängen zwischen konformationen durchlaufen. In der Tat war dies der Fall, als smFRET verwendet wurde39,40. Hier führen wir smPIFE-Messung...

Die zeitaufgelöste Einzelmolekül-Protein-induzierte Fluoreszenzverstärkung ist ein nützlicher fluoreszenzspektroskopischer Näherungssensor, der empfindlich auf lokale Strukturveränderungen in Proteinen reagiert. Hier zeigen wir, dass es verwendet werden kann, um stabile lokale Konformationen in α-Synuclein aufzudecken, das auch als globulär unstrukturiert und instabil bezeichnet wird, wenn es mit dem FRET-Lineal mit größerer Reichweite gemessen wird.

Verwendung einer zeitaufgelösten proteininduzierten Fluoreszenzverstärkung zur Identifizierung stabiler lokaler Konformationen jeweils α-Synuclein-Monomer

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Die proteininduzierte Fluoreszenzverstärkung von Einzelmolekülen kann einzelmolekulare FRET-Messungen ergänzen, wenn proteinstrukturelle Subpopulationen und Konformationen untersucht werden, insbesondere in Fällen, in denen unterschiedliche strukturelle Subpopulationen über stabile lokale Strukturen berichten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie unterschiedliche ortsspezifische strukturelle Subpopulationen erfasst, die auf der Nähe der Farbstoffmarkierungsstelle zu den Proteinoberflächen basieren. Die proteininduzierte Einzelmolekül-Fluoreszenzverstärkung kann auf jedes biomolekulare System von Interesse angewendet werden, um unterschiedliche, lokale, strukturelle Subpopulationen zu untersuchen.Beginnen Sie mit der Herstellung von 25 Picomolar-Sulfo-Cy3-markiertem alpha-Synuclein im Messpuffer in einem proteinarmen Bindungsröhrchen. Geben Sie 100 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter BSA auf den 18-Kammer-Mikroskopie-Objektträger und inkubieren Sie für eine Minute, dann verwerfen Sie den BSA. 100 Mikroliter 25 Picomolar Sulfo-Cy3-markierte Alpha-Synuclein-Probe in die Kammer des Abdeckschlittens geben.Als nächstes fügen Sie für die Datenerfassung einen Tropfen Reinstwasser auf die Oberseite der Wasserimmersionslinse mit hoher numerischer Apertur hinzu, befestigen Sie den Abdeckungsschieberschieber in der Bühnenkammer und installieren Sie dann die Baugruppe auf der Oberseite des Mikroskoptisches. Bringen Sie die Objektivlinse nach oben, bis der Wassertropfen oben auf der Objektivlinse an der Unterseite des Abdeckungsrutschens verschmiert, und öffnen Sie den Laserverschluss. Wenn sich das Objektiv nach oben bewegt, untersuchen Sie das Muster der luftigen Ringe auf einer CCD-Kamera.Der erste Ring stellt den Fokus an der Wasser/Glas-Grenzfläche dar, und der zweite Ring stellt den Fokus an der Grenzfläche zwischen dem Glas und der Probenlösung dar. Erhöhen Sie die Höhe der Objektivlinse um 75 Mikrometer, um den Laserfokus tief in die Lösung zu bringen, um die Autofluoreszenz von der Glasoberfläche des Deckschlupfes zu minimieren. Stellen Sie die Laserleistung an der Objektivlinse auf ca. 100 Mikrowatt ein.Starten Sie die Erfassung der detektierten Photonen für eine vordefinierte Zeit. Öffnen Sie die Jupyter Notebooks, und öffnen Sie dann das Beispielnotizbuch. Laden Sie die FRETBursts- und Photon-HDF5-Datendatei.Verwenden Sie das Histogramm der Interphotonenzeiten, um die Hintergrundraten für alle 30 Sekunden der Datenerfassung zu berechnen. Verschieben Sie ein Zeitfenster von jeweils einem Photon für 20 aufeinanderfolgende Photonen und sammeln Sie die Photonendaten, wenn die momentane Photonenrate F mindestens 11-mal größer ist als die Hintergrundrate für diesen Zeitraum der Datenerfassung. Berechnen Sie die Burstgröße und die Menge der Photonen in einem Burst, die Burstdauer, die Zeitdifferenz zwischen der letzten und der ersten Photonendetektionszeit in einem Burst, die Bursthelligkeit, den größten Wert der momentanen Photonenrate in einem Burst und die Burst-Trennung, das Zeitintervall zwischen aufeinanderfolgenden Bursts.Zeichnen Sie das Histogramm der Bursthelligkeitswerte mit der Ereignisachse in einer logarithmischen Skala. Definieren Sie den Bursthelligkeitsschwellenwert als den minimalen Bursthelligkeitswert, ab dem das Histogramm ein abklingendes Muster aufweist, und wählen Sie die Bursts mit Helligkeitswerten aus, die größer als der Bursthelligkeitsschwellenwert sind. Für die Messung der mittleren Fluoreszenzlebensdauer des Bursts zeichnen Sie das Histogramm der Photonennanozeit für alle Photonen in den ausgewählten Bursts mit der Photonenzählachse in einer logarithmischen Skala auf.Definieren Sie den Nanozeitschwellenwert als den minimalen Nanozeitwert, ab dem das Histogramm der Photonennanozeiten ein zerfallendes Muster aufweist. Wählen Sie nur die Photonen aus, deren Nanozeit größer als der Nanozeitschwellenwert ist. Berechnen Sie den algebraischen Durchschnitt aller ausgewählten Photonen-Nanozeiten.Subtrahieren Sie den Nanozeitschwellenwert vom algebraischen Mittelwert der Photonennanozeit. Der erhaltene Wert ist die mittlere Photonen-Nanozeit des Bursts, direkt proportional zur mittleren Fluoreszenzlebensdauer. Zeichnen Sie das Histogramm aller geplatzten mittleren Fluoreszenzlebensdauern auf.Die zentral verteilten Subpopulationen der Fluoreszenzlebensdauer können auftreten. Die Subpopulationen mit niedrigwertigen Durchschnittswerten repräsentieren die molekularen Spezies mit Sulfo-Cy3, die nicht sterisch behindert wurden, während die Subpopulationen mit höherwertigen Durchschnittswerten die Molekülspezies mit S-Cy3 darstellen, die sterisch stärker behindert waren. Für die langsame Bewertung der Dynamik zwischen den Bursts zeichnen Sie das Histogramm der Burst-Trennzeiten mit einer Separationszeitachse in einer logarithmischen Skala auf.Wählen Sie diese Option aus, um alle Paare der aufeinanderfolgenden Bursts zu speichern, die durch weniger als eine maximale Trennzeit getrennt sind, die die Subpopulation desselben Moleküls definiert. Zeichnen Sie ein Histogramm oder ein Streudiagramm der mittleren Fluoreszenzlebensdauer des ersten und zweiten Bursts für alle Paare der Bursts auf, die unterhalb einer bestimmten Trennzeitschwelle aufgetreten sind. Die Histogramme der mittleren Fluoreszenzlebensdauer eines einzelnen, S-Cy3-markierten Alpha-Synuclein-56-Moleküls zeigten, dass die erste Subpopulation eine charakteristische Fluoreszenzlebensdauer von 1,6 Nanosekunden aufwies und Alpha-Synuclein-Konformationszustände mit wenigen Proteinoberflächen in der Nähe von Rest 56 darstellte.Die zweite Subpopulation hatte eine charakteristische Fluoreszenzlebensdauer von 3,5 Nanosekunden und repräsentierte Alpha-Synuclein-Konformationszustände mit mehr Proteinoberflächen in der Nähe von Rest 56. Es ist bekannt, dass die Nicht-Amyloid-Beta-Komponentensegmente von Alpha-Synuclein-Molekülen bei der Bindung an SDS-Vesikel eine helikale Haarnadelstruktur annehmen, die als einzelne Blütenstandslebenspopulation mit einer charakteristischen Lebensdauer von etwa drei Nanosekunden und abwesenheit der Subpopulation mit der charakteristischen Lebensdauer von 1,6 Nanosekunden bestätigt wurde. Das Histogramm der Trennzeiten zwischen aufeinanderfolgenden Einzelmolekül-Bursts meldet wiederkehrende Moleküle für die Trennungszeiten schneller als 100 Millisekunden, wobei der erste und der zweite Burst aus demselben Molekül entstehen.Das mittlere Fluoreszenzlebensdauerhistogramm aller einzelnen Molekülausbrüche zeigte Subpopulationen mit einer kurzen charakteristischen Lebensdauer sowie mit einer langen charakteristischen Lebensdauer, was darauf hindeutet, dass einzelne Moleküle Übergänge zwischen verschiedenen durchschnittlichen Lebensdauerwerten langsamer durchlaufen könnten als burst-Dauerzeiten. Innerhalb von Burst-Trennzeiten von höchstens 100 Millisekunden gab es einen Bruchteil von Molekülen, die als erster Burst in der kurzlebigen Subpopulation begannen und als zweiter Burst innerhalb der langlebigen Subpopulation wiederholten. Während der Anteil der Moleküle, die als erster Burst in der langlebigen Subpopulation begannen und als zweiter Burst innerhalb der kurzlebigen Population wieder auftraten, die Übergänge zwischen den beiden Subpopulationen innerhalb von 10 bis 100 Millisekunden anzeigt.Das Wichtigste, woran man sich bei der Analyse der experimentellen Ergebnisse erinnern sollte, ist, Einzelmolekül-Fluoreszenzsignale richtig vom Hintergrund zu trennen und Bursts mit genügend Photonen-Nanozeiten zu analysieren. Die Entwicklung von smPIFE ebnete den Forschern den Weg, Nukleinsäureprotein-Wechselwirkungen auf Einzelmolekülebene zu erforschen. Dieser Fortschritt legt den Grundstein für die Untersuchung der lokalen Strukturdynamik in Proteinen.

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Die Funktionen von Proteinen der Dynamin-Superfamilie hängen von Konformationsänderungen ab, die mit der GTP-Hydrolyse gekoppelt sind. Es wird ein System beschrieben, das die Einzelmolekül-FRET-Technik (smFRET) verwendet, um die Konformationsdynamik von Dynamin-ähnlichem GTPase-Atlastin in verschiedenen Nukleotid-Beladungszuständen zu überwachen.

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Verwendung einer zeitaufgelösten proteininduzierten Fluoreszenzverstärkung zur Identifizierung stabiler lokaler Konformationen jeweils α-Synuclein-Monomer (Video) | JoVE Journal

Verwendung einer zeitaufgelösten proteininduzierten Fluoreszenzverstärkung zur Identifizierung stabiler lokaler Konformationen jeweils α-Synuclein-Monomer

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