Durchflusszytometrische Analyse von apoptotischen Biomarkern in Actinomycin-D-behandelten SiHa-Gebärmutterhalskrebszellen

Die Durchflusszytometrie ist eine leistungsfähige Technik, die eine multiparametrische Analyse einzelner Zellen ermöglicht. Es kann Biomarker für frühe und späte Apoptose genau und schnell identifizieren, indem es Millionen von Zellen analysiert. Mehrere Zellmoleküle werden angefärbt und gleichzeitig detektiert.

Insbesondere die Bench-Top-Durchflusszytometrie ermöglicht die Analyse und Interpretation durch nicht-fachkundige Durchflusszytometristen. Esther Zhou, eine Doktorandin aus der Vitamin-D-Krebsgruppe, demonstriert das Verfahren. Beginnen Sie damit, die Zellkulturen in einer befeuchteten CO2-Umgebung bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 zu züchten.

Stellen Sie sicher, dass die Zellkultur zu etwa 70 % im Mutterkolben konfluent ist, bevor Sie die Zellen für Experimente passieren. Nehmen Sie das Medium aus dem Kolben und waschen Sie die Zellen mit 1X PBS. Fügen Sie dann einen Milliliter Trypsin hinzu, um die Zellen abzulösen.

Nachdem sich die Zellen abzulösen beginnen, neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie etwa fünf Milliliter frisches Nährmedium hinzufügen, das mit 10%igem fötalem Kälberserum ergänzt ist, bevor Sie die Zellen zählen. Samenzellen mit 15.000 Zellen pro Milliliter in drei Millilitern Zellkulturmedium in einer Sechs-Well-Zellkulturplatte. Inkubieren Sie die Kulturplatten über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2, damit die Zellen am Boden der Vertiefung befestigt werden können.

Am nächsten Tag werden die Versuchskulturen mit 100 Nanogramm pro Milliliter Actinomycin-D und die Medium- und Lösungsmittelkontrollen 24 Stunden lang mit frischem Nährmedium bzw. DMSO behandelt. Entnehmen Sie das Medium aus den Vertiefungen und sammeln Sie das verbrauchte Medium in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie die Zellen mit 1X PBS.

Fügen Sie 500 Mikroliter Trypsin hinzu, um die Zellen abzulösen. Pipettieren Sie zwei- bis dreimal vorsichtig einen Milliliter des Mediums zurück, um die verbleibenden Zellen, die noch am Boden der Vertiefung haften, mechanisch zu entfernen. Geben Sie die Lösung aus den Vertiefungen in ein 15-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie dann fünf Milliliter frisches Nährmedium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren.

Pipettieren Sie 450 Mikroliter Reagenz mit DNA-bindenden Farbstoffen in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 50 Mikroliter der Zellsuspension in das Mikrozentrifugenröhrchen. Inkubieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Zählen Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie. Verdünnen Sie alle Proben auf eine Konzentration von einmal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter mit Zellkulturmedium, bevor Sie mit den Apoptose-Assays fortfahren. Um die Externalisierung von Phosphatidylserin mit einem Annexin V nachzuweisen, werden 100 Mikroliter Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben.

Fügen Sie dazu 100 Mikroliter einer 1:1-Mischung aus fluoreszierendem konjugiertem Annexin V und 7-AAD-Reagenz hinzu. Bei Raumtemperatur 20 Minuten lichtgeschützt inkubieren. Um die Depolarisation der mitochondrialen Membran zu analysieren, werden zunächst fünf Minuten lang 100 Mikroliter der Zellsuspension bei 300 mal G zentrifugiert und dann der Überstand verworfen.

Resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter 1X PBS. Fügen Sie jeder Probe 100 Mikroliter TMRE-Färbelösung hinzu und mischen Sie die Suspension durch sanftes Rückpipettieren. Wickeln Sie die Proben in saubere Aluminiumfolie ein, um sie vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang in einer befeuchteten CO2-Umgebung bei 37 Grad Celsius.

Am Ende der Inkubation wird die 7-AAD-Arbeitslösung in die Probe gegeben und gemischt. Um aktivierte terminale Caspase-3 und 7 nachzuweisen, verdünnen Sie zunächst das DEVE-gebundene DNA-bindende Peptid in DMSO auf ein Verhältnis von 1:8 mit sterilem 1X PBS, damit der Caspase-Nachweis funktioniert. Lagern Sie die Lösung auf Eis oder fügen Sie zwei bis acht Grad Celsius vor Licht geschützt hinzu.

Fügen Sie zwei Mikroliter einer 7-AAD-Stammlösung zu 148 Mikrolitern 1X PBS hinzu, um die 7-AAD-Arbeitslösung herzustellen. Lagern Sie die Lösung lichtgeschützt auf Eis oder bei zwei bis acht Grad Celsius. Zentrifugieren Sie 50 Mikroliter der Zellsuspension fünf Minuten lang bei 300-fachem G und entsorgen Sie den Überstand.

Resuspendieren Sie die Zellen in 50 Mikrolitern 1X PBS, gefolgt von fünf Mikrolitern der Caspase-Detektionsarbeitslösung und mischen Sie sie gründlich. Lösen Sie die Kappe der Röhrchen und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang in einer befeuchteten CO2-Umgebung bei 37 Grad Celsius, die vor Licht geschützt ist. Zu jeder Probe 150 Mikroliter der 7-AAD-Arbeitslösung geben und mischen.

Fünf Minuten bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren. Zum Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen und DNA-Gesamtschäden zentrifugieren Sie zunächst 50 Mikroliter der Zellsuspension für fünf Minuten bei 300-fachem G und verwerfen den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern 1X PBS und fügen Sie 500 Mikroliter eines Fixierungspuffers auf Formaldehydbasis hinzu und mischen Sie.

Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 300-fachem G und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 90 Mikrolitern 1X PBS in einem Mikrozentrifugenröhrchen.

Geben Sie 10 Mikroliter der Antikörperlösung in das Mikrozentrifugenröhrchen. Bei Raumtemperatur 30 Minuten im Dunkeln inkubieren. Fügen Sie 100 Mikroliter 1X PBS hinzu und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 300 Mal G. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern 1X PBS.

Mischen Sie die Probe, indem Sie sie vorsichtig zurückpipettieren, bevor Sie die Probe in das Durchflusszytometer laden. Überprüfen Sie die analytische Leistung des Durchflusszytometers, indem Sie das System-Check-Kit des Geräts ausführen, und fahren Sie nicht mit dem Ausführen von Proben fort, bis alle Prüfungen abgeschlossen und bestanden sind. Laden Sie zunächst eine Negativkontrollprobe in das Durchflusszytometer und wählen Sie Ausführen, Einstellungen anpassen, damit das Gerät mit dem Absaugen der Probe beginnt und eine Echtzeitvorschau der erkannten Ereignisse bietet.

Passen Sie in der Live-Vorschau die Schwellenwerte für Fluoreszenz und Zellengröße an. Zeichnen Sie ein rechteckiges Gate um die Zellpopulation, ziehen Sie die Schwellenwertmarkierung, um zelluläre Trümmer auszuschließen, und wählen Sie Weiter, Apoptoseprofil festlegen aus, um fortzufahren. Tippen und ziehen Sie die Quadrantenmarkierungen, um die Zellpopulationen zu trennen und erkannte Ereignisse in Echtzeit darzustellen.

Verwenden Sie diese Diagramme, um den Endbenutzer bei der richtigen Platzierung der Quadrantenmarkierungen zu unterstützen. Wählen Sie Weiter, Einstellungen überprüfen, um fortzufahren, damit das Gerät eine Zusammenfassung der Einstellungen anzeigt. Nachdem Sie die Einstellungen überprüft haben, wählen Sie Weiter, Einstellungen beenden aus, um diese Einstellungen auf alle Stichproben innerhalb des Experiments anzuwenden.

Mischen Sie die erste Probe durch vorsichtiges Rückpipettieren und laden Sie die erste Probe auf das Durchflusszytometer. Wählen Sie Weiter aus, benennen Sie das Beispiel, und wählen Sie Ausführen aus, damit das System mit der Ausführung des Beispiels beginnt. Führen Sie bei Bedarf eine Feinabstimmung der Gates oder Quadrantenmarker nach der Erfassung durch.

Suchen Sie das Experiment, das angepasst werden muss, indem Sie im Dateibrowser des Systems navigieren und das Experiment öffnen. Tippen Sie auf die Miniaturvorschau des Plots, um ihn zu vergrößern. Um die Quadrantenmarkierungen anzupassen, klicken Sie auf den Schnittpunkt der vertikalen und horizontalen Linien, um die Markierungen so zu verschieben, wie sie sind, und passen Sie den Winkel jeder Linie an, indem Sie auf die Linie klicken und den Griff ziehen.

Um das Zellen-Gating zu verfeinern, klicken Sie auf die Registerkarte Gate und passen Sie die Abmessungen des Gates. Passen Sie die Markierungen wie gewünscht an und wenden Sie diese Einstellungen auf alle Samples im Experiment an, indem Sie das Häkchensymbol auswählen, alle Samples markieren und Akzeptieren auswählen. Führen Sie Tests in dreifacher Ausführung durch und führen Sie eine Varianzanalyse mit einem Post-hoc-Bonferroni-Test durch, um signifikante Unterschiede zwischen den Stichproben und den Kontrollen zu bewerten.

Die Ergebnisse der Zellzahl und Viabilität zeigten, dass 95,2 % der Zellen in der Probe lebend und 4,8 % tot waren. Die Zellkonzentration betrug 5,90 mal 105 Zellen pro Milliliter. Der Annexin-V- und Zelltod-Assay zeigte einen signifikanten Anstieg der apoptotischen Zellen in SiHa-Zellen, die mit 100 Nanogramm pro Milliliter Actinomycin D behandelt wurden, im Vergleich zu den Kontrollen.

Der mitochondriale elektrochemische Transmembranpotential-Assay zeigte eine signifikante Abnahme der Zellgesundheitsprofile zwischen Actinomycin-D, Medium-Kontrolle und Lösungsmittel-Kontrolle, was darauf hindeutet, dass 100 Nanogramm pro Milliliter Actinomycin-D eine mitochondriale Depolarisation in SiHa-Zellen induzierten. Der Caspase-3- und der Caspase-7-Assay zeigten eine signifikante Aktivierung terminaler Caspasen in SiHa-Zellen, die mit 100 Nanogramm Actinomycin D pro Milliliter behandelt wurden, im Vergleich zu den Kontrollen. Actinomycin D induzierte signifikant DNA-Schadensmarker, ATM und H2A.

X in SiHa-Zellen, was auf eine signifikante Zunahme der DNA-Schäden hindeutete. Um die Genauigkeit zu verbessern, stellen Sie sicher, dass Sie die gesamte Zellpopulation ernten. Halten Sie sich auch an die vom Hersteller empfohlenen Zellkonzentrationen und Färbezeiten.

Der Schutz der gefärbten Proben vor Licht vermeidet Photobleichung oder Fluorophore. Die biochemische Analyse der Apoptose mittels Durchflusszytometrie sollte durch die Mikroskopie unterstützt werden. Dadurch werden morphologische Merkmale der klassischen Apoptose identifiziert.

Zu den Merkmalen gehören Kernkondensation, Zellmembranmischung, apoptotische Körper und Karyorrhexis.