Name: Synthese und Charakterisierung multimodaler Phasenwechsel-Porphyrintröpfchen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-15T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Erfahren Sie die Synthese und Charakterisierung multimodaler Phasenwechsel-Porphyrintröpfchen durch einfache Kühlung und Schwenkung ohne Druck. Diese Methode ermöglicht die Kondensation von Mikroblasen zu Tröpfchen für biophysikalische Anwendungen.

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Die Autoren danken Dr. Brandon Helfield für die Unterstützung beim Bau des Gasaustauschers und Dr. Miffy Hok Yan Cheng für technische Diskussionen. Die Autoren danken den folgenden Finanzierungsquellen: Ontario Graduate Scholarship, Canadian Institutes of Health Research, Terry Fox Research Institute und Princess Margaret Cancer Foundation.

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<li>Goertz, D. E., de Jong, N., vander Steen, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+and+size+distribution+measurements+of+Definity+and+manipulated+Definity+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Attenuation and size distribution measurements of Definity and manipulated Definity populations.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (9), 1376(2007).</li>
<li>Pellow, C., Acconcia, C., Zheng, G., Goertz, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold-dependent+nonlinear+scattering+from+porphyrin+nanobubbles+for+vascular+and+extravascular+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Threshold-dependent nonlinear scattering from porphyrin nanobubbles for vascular and extravascular applications.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (21), 215001(2018).</li>
<li>Kwan, J. J., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+monolayer+collapse+and+microbubble+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid monolayer collapse and microbubble stability.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 183, 82-99 (2012).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Ultraschallbildgebung ist eine nicht-invasive, nichtionisierende Form der medizinischen Bildgebung, die akustische Wellen nutzt. Während Ultraschallgeräte tragbarer sind und Echtzeitbilder liefern können, kann die Ultraschallbildgebung unter einem geringen Kontrast leiden, was es für Sonographen schwierig macht, ähnlich echogene pathologische Merkmale zuverlässig zu unterscheiden. Um dieser Einschränkung entgegenzuwirken, können Mikroblasen in den Wirt injiziert werden, um den Gefäßkontrast zu verbessern. Mikroblasen sind mikrometergroße gasgefüllte Kontrastmittel, die sehr echogen zu akustischen Wellen sind und einen verbesserten Gefäßkontrast1,2bieten können. Die Schalen und Gaskerne von Mikroblasen können für verschiedene Anwendungen wie Bildgebung, Thrombolyse, Zellmembranpermeabilisierung oder transiente Gefäßöffnung angepasst werden2.
Ein Nachteil von Mikroblasen ist ihre kurze Zirkulationshalbwertszeiten. Zum Beispiel haben klinisch verfügbare Perflutren-Lipid-Mikrosphären nur eine Halbwertszeit von 1,3 Minuten3. Für lange Bildgebungssitzungen sind mehrere Injektionen von Mikroblasen erforderlich. Ein weiterer Nachteil von Mikroblasen sind ihre großen Durchmesser. Während Perflutren-Lipid-Mikrosphären etwa 1 bis 3 μm Durchmesser haben, klein genug, um in Gefäßen zu zirkulieren, sind sie zu groß, um zu extravasieren und sich passiv in interessanten Geweben wie Tumorenanzusammeln 4. Eine Strategie, um diese Einschränkungen zu überwinden, besteht darin, die Gaskern-Mikroblasen zu kleineren Flüssigkerntröpfchen zu kondensieren5,6. Während Tröpfchen in ihrem flüssigen Zustand nicht echogen sind, können sie bei Ultraschall mit ausreichend hohem Spitzenunterdruck zu Mikroblasen verdampft werden, wodurch ihre Fähigkeit, Kontrast zu liefern, wiedererlangt wird. Dies ermöglicht es dem Tröpfchen, die günstigere Pharmakokinetik eines kleinen Flüssigkeitskerns zu nutzen, während die Fähigkeit erhalten bleibt, Kontrast zu liefern, wenn er insoniert ist und ohne die chemische Zusammensetzung zu verändern4,7.
Decafluorbutan ist eine ideale Perfluorkohlenstoffverbindung zur Phasenverschiebung zwischen gasförmigen und flüssigenZuständen5,6,7. Decafluorbutan ermöglicht die Kondensation von Mikroblasen zu Tröpfchen mit Temperaturreduktion allein, während weniger dichte Perfluorkohlenwasserstoffe eine zusätzliche Druckbeauftauung erfordern5. Dieses schonende Verfahren minimiert die Zerstörung von Blasen während der Kondensation7,8,9. Da ihre Kerne flüssig sind, sind Tröpfchen nicht echogen und für Ultraschall unsichtbar. Bei Anwendung ausreichender akustischer oder thermischer Energie können die Flüssigkeitskerne jedoch wieder in einen gasförmigen Zustand verdampfen und echogene Mikroblasen erzeugen8. Diese Verdampfung ermöglicht die Kontrolle darüber, wann und wo Mikroblasen erzeugt werden sollen.
Während Tröpfchen für die passive Akkumulation, In-situ-Verdampfung oder Verbesserung der Zellpermeabilität4nützlich sind, können Tröpfchen (und ihre Fragmente) ex vivonicht abgebildet oder quantifiziert werden. Daher werden quantifizierbare Begleitdiagnostika, wie fluoreszierende4,10,11,magnetische Partikel12,optisch absorbierende Mittel13,als Analogon verwendet, um die Tröpfchenabgabe an gewebe von Interesse zu messen. Zum Beispiel verwendeten Helfield et al. eine Co-Injektion von fluoreszierenden Nanoperlen zur histologischen Bildquantifizierung von Mausorganen, da Tröpfchen nicht fluoreszierend nachgewiesen werden konnten4. Der Nachteil von Begleitdiagnostika besteht darin, dass die verfolgbare Komponente abhängig von ihrem individuellen pharmakokinetischen Profil unabhängig vom Tröpfchen wirken kann.
Glücklicherweise kann die Hülle aus Mikroblasen und Tröpfchen angepasst werden. Zum Beispiel demonstrierten Huynh et al. Ultraschallkontrastmittel mit Porphyrin-Lipid-Schalen, wodurch multimodale Mikroblasen erzeugt wurden14. Porphyrine sind eine Klasse organischer Verbindungen mit einer aromatischen Makrozyllstruktur14,15. Sie sind optisch absorbierend, fluoreszierend und können zu einer Vielzahl von Metallen für die Strahlentherapie, radionuklidbasierte Bildgebung oder spurenmetallbasierte Quantifizierung chelatisiert werden14. Ein Beispiel für Porphyrin ist Pyropheophorbid (Pyro). Durch die Konjugation von Pyro auf Lipide und die Einarbeitung von Pyro-Lipiden in Mikroblasen oder Tröpfchen können sie durch mehrere Modalitäten abgebildet und verfolgt werden: akustisch, fluoreszierend und durch Absorption14. Dieses multimodale Kontrastmittel könnte verwendet werden, um die Akkumulation zu verfolgen und zu quantifizieren. Dies könnte die Notwendigkeit von Begleitdiagnostika eliminieren, da die quantifizierbare Komponente jetzt auf die Schale konjugiert ist, was eine genauere Lieferquantifizierung ermöglicht16.
Hierin wird ein Protokoll zur Erstellung multimodaler Phasenwechsel-Porphyrintröpfchen beschrieben. Da Ultraschallkontrastmittel als Plattform für die Verabreichung von Medikamenten an interessante Gewebe wie Tumore2,4verwendet werden können, könnte sich die Erweiterung ihrer Nachweisbarkeit über den Ultraschall hinaus als nützlich für die Quantifizierung der Wirksamkeit der Verabreichung erweisen. Der Zweck dieser Tröpfchen besteht darin, verfolgbare Ultraschallkontrastmittel bereitzustellen, die in der Lage sind, passive Akkumulation in vivo, In-situ-Verdampfung und Akustik zu erzeugen und die Bioverteilung oder Akkumulation von Ex-vivo-Organen zu quantifizieren, ohne auf sekundäre Sensoren angewiesen zu sein. Charakterisierungsmethoden werden auch beschrieben, um das Potenzial von Porphyrintröpfchen als Bioverteilungssensoren aufzuzeigen. Die Auswirkungen der Pyro-Lipid-Belastung in der Schale (0% bis 50% durch molares Verhältnis) werden ebenfalls diskutiert.

<table><tbody><tr><td>1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(Polyethylenglykol)-5000] (Ammoniumsalz)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>880220</td><td>Auch bekannt als "DSPE-PEG5K"</td></tr><tr><td>1-Stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholin</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>855775</td><td>auch bekannt als "DSPC"</td></tr> <tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Aluminiumdichtungen aller Marken</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Tear-Off</td><td>VWR</td><td>16171-840</td><td>Standard Aluminium, 13 mm Außendurchmesser</td></tr><tr><td>Bad-Ultraschallgerät</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Kann beschallen und erhitzen bis zu 70 Grad; </td></tr><tr><td>C,Bio-Stor Fläschchen mit Schraubverschluss</td><td>National Scientific</td><td>BS20NABP</td><td>Kunststoff, 2 mL mit Rand, mit O-Ring</td></tr><tr><td>Borosilikatglas klare Serumfläschchen</td><td>VWR</td><td>16171-285</td><td>3 ml, 7 mm Innenmunddurchmesser, 13 mm Außenmunddurchmesser</td></tr><tr><td>Borosilikatglas Probenfläschchen mit Phenol-Schraubverschluss</td><td>VWR</td><td>66011-020</td><td>1,85 ml, kurze Form, 12 mm Außendurchmesser, 35 mm Höhe, 8-425 Kappengröße</td></tr><tr><td>Fläschchen aus Borosilikatglas mit Schraubverschluss</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Größen hängen von den gewünschten Volumina ab</td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coulter Counter Elctrolyte Verdünnungsmittel</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Kompatibel mit Coulter Counter</td></tr><tr><td>Decafluorbutan (C4F10)</td><td>FluoroMed</td><td>355-25-9</td><td></td></tr><tr><td>Deionisiertes Wasser</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trockeneis (Kohlendioxid)</td>Jede <td>Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynamische Lichtstreuung (DLS) Partikelanalysator</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Geeignet für die Temperaturregelung</td></tr><tr><td>E-Z Crimpzange, 13 mm</td><td>Wheaton</td><td>W225302</td><td>13 mm Standard-Aluminiumdichtungen</td></tr><tr><td>E-Z Decapper, 13 mm</td><td>Wheaton</td><td>W225352</td><td>13 mm Standard Aluminiumdichtungen</td></tr><tr><td>Fluoreszierendes Spektrophotometer</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Geeignet für 400 bis 600 Anregung und 300 bis 800 nm Emissionsdetektion, Detektor senkrecht zur Laserquelle</td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Spektrophotometer-kompatible Küvette</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Kann mindestens 2 ml aufnehmen, kann 300 bis 800 nm aufnehmen, alle vier Seiten sind &nbsp; optische Fenster&nbsp;</td></tr><tr><td>Gaswechsler</td><td>aus eigener</td><td></td> Herstellung <td>Montageanleitungen finden Sie unter "Ergänzende Informationen - "Sonstige Protokolle und Daten".</td></tr><tr><td>Glasspritzen</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Größen hängen von den gewünschten Volumina</td></tr><tr><td>ab GLWR Custom Aperture Tube 10 um</td><td>Beckman Coulter</td><td>B42812</td><td>10 &micro; m Öffnung, kompatibel mit Beckman Coulter MultiSizer 4e</td></tr><tr><td>Glycerinol</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolierte Styrofaom-Behälter mit Deckel</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lyophilisations-Gummistopfen</td><td>VWR</td><td>71000-060</td><td>7 mm Innendurchmesser der Mündung, 13 mm Durchmesser der äußeren Mündung, 2-Fuß, Chlorbutylmembran</td></tr><tr><td> Membran-Vakuumpumpe</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16694-1-60-06</td><td>Metallzange mit einstellbarem Druck</td></tr><tr><td></td><td>Jede Marke</td> Methanol Jede Marke <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS250 21 MHz Linear Array Ultraschallwandler</td><td>VisualSonics</td><td></td><td>21 MHz, Geeignet für B-Modus und nichtlineare Bildgebung.</td></tr><tr><td>MultiSizer 4e</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Kann Größen von 0,2 & Mikro messen; m bis 6 &micro; m</td></tr><tr><td>Nalgene Sterile Einweg-Vakuumfiltereinheiten mit schnellem Durchfluss</td><td>Thermo Scientific</td><td>567-0010</td><td>Polyethersulfon (PES)-Membran, 0,1&mu; m Porengröße, 1000 mL Volumen. Da Isoton II unsteril ist, kann es mehrmals verwendet werden Filtereinheiten</td></tr><tr><td>Nadeln, konventionelles</td><td>BD</td><td>305176</td><td>20 Gauge, 1,5 Zoll Länge</td></tr><tr><td>Stickstoffgas</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Stellen Sie sicher, dass Regelventile und Schläuche vorhanden sind, um den Durchfluss zu leiten. Die Einrichtung hängt von der Marke und der Quelle ab.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>wird im Protokoll als "Wachsfilm" bezeichnet.</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td>Jede <td>Marke</td><td></td><td>1X, 7,4 pH</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Die Größen hängen von den gewünschten Volumina</td></tr><tr><td>ab Pipettenspitzen</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Die Größen hängen von den gewünschten Volumina</td></tr><tr><td>ab Kunststoffspritzen</td><td>Von jeder Marke</td><td></td><td>1 ml, 3 ml und 30 ml. Mit Luer-Lock-Anschlüssen</td></tr><tr><td>Polyethersulfon (PES) Membranfilter</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>0,2 & Mikro; m Porengröße</td></tr><tr><td>Propylenglykol</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyropheophorbid konjugiert 1-Stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholin</td><td>Hergestellt im eigenen Haus</td><td></td><td>Auch bekannt als "Pyro-SPC". Zur Synthese siehe "Ergänzende Informationen - Andere Protokolle und Daten".</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>Jede Marke</td><td></td> <td>(-20 bis 100 &Grad; C)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Auch bekannt als "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol"</td></tr><tr><td>Reinstwasser</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Typ 1 Reinheit</td></tr><tr><td>Ultraviolett&ndash; Spektralphotometer für den sichtbaren Bereich (UV-Vis)</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Absorptionsfähig von 300 bis 800 nm, mindestens 0,5 nm Auflösung</td></tr><tr><td>Ultraviolett&ndash; Kompatibles Küvette für sichtbares (UV-Vis) Spektralphotometer, 1 cm Weglänge</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Kann mindestens 2 ml aufnehmen, unterstützt 300 bis 800 nm</td></tr><tr><td>Vakuum-Exsikkator</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 Ultraschall-Bildgebungsplattform</td><td>VisualSonics Präklinisches</td><td></td><td>Ultraschall-Bildgebungssystem</td></tr><tr><td>Vialmix</td><td>Bristol-Myers-Squibb</td><td></td><td>Im Protokoll als "mechanisches Rührwerk" bezeichnet. Rührt 45 s lang.</td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

synthese und charakterisierung multimodaler phasenwechsel-porphyrintröpfchen

Synthesis and Characterization of Multi-Modal Phase-Change Porphyrin Droplets

Phasenwechseltröpfchen sind eine Klasse von Ultraschallkontrastmitteln, die sich bei Anwendung ausreichender akustischer Energie in echogene Mikroblasen in situ umwandeln können. Tröpfchen sind kleiner und stabiler als ihre Mikroblasen-Gegenstücke. Herkömmliche Ultraschallkontrastmittel sind jedoch nicht über akustische Rückkopplungsmessungen hinaus verfolgbar, was die Quantifizierung der Bioverteilung oder Akkumulation von Kontrastmitteln ex vivo erschwert. Forscher müssen sich möglicherweise auf fluoreszierende oder optisch absorbierende diagnostische Begleitpartikel verlassen, um auf die Bioverteilung zu schließen. Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, die Schritte zur Erstellung multimodaler Phasenwechsel-Porphyrintröpfchen mit einer Kondensationsmethode detailliert zu beschreiben. Porphyrine sind fluoreszierende Moleküle mit unterschiedlichen Absorptionsbändern, die auf Lipide konjugiert und in Tröpfchen eingebaut werden können, um die Vielseitigkeit der Tröpfchen zu erweitern und eine robustere Bioverteilung zu ermöglichen und gleichzeitig die akustischen Eigenschaften beizubehalten. Sieben Formulierungen mit unterschiedlichen Porphyrin-Lipid- und Basenlipidgehalten wurden hergestellt, um Mikroblasen- und Tröpfchengrößenverteilungen zu untersuchen. Charakterisierungen, die für porphyrinhaltige Strukturen geeignet sind, werden ebenfalls im Protokoll beschrieben, um ihre analytische Vielseitigkeit in lösungshaltig zu demonstrieren. Die Dimensionierung zeigte, dass die nachkondensierten mittleren Durchmesser 1,72 bis 2,38 Mal kleiner waren als die Vorläuferpopulationen. Die Absorptionscharakterisierung zeigte, dass intakte Baugruppen einen Q-Band-Peak von 700 nm aufwiesen, während gestörte Proben einen Absorptionspeak bei 671 nm aufwiesen. Die Fluoreszenzcharakterisierung zeigte, dass intakte 30% Porphyrin-Lipid-Anordnungen fluoreszierend abgeschreckt wurden (>97%), wobei die Fluoreszenzrückgewinnung bei Störung erreicht wurde. Die akustische Verdampfung zeigte, dass Porphyrintröpfchen bei niedrigeren Drücken nicht echogen waren und bei ausreichenden Drücken in echogene Mikroblasen umgewandelt werden konnten. Diese Charakterisierungen zeigen das Potenzial für Porphyrintröpfchen, die Notwendigkeit von Absorptions- oder fluoreszenzbasierten begleitenden diagnostischen Strategien zur Quantifizierung der Bioverteilung von Ultraschallkontrastmitteln für die Verabreichung oder therapeutische Anwendungen in vivo oder ex vivozu eliminieren.

Vorkondensierte, größensele selected Microbubble-Proben (n = 3) und postkondensierte Tröpfchenproben ( n = 3)wurden auf einem Coulter Counter (CC) mit einer 10 μm-Öffnung dimensioniert. Eine Einschränkung der 10 μm-Öffnung besteht darin, dass partikel kleiner als 200 nm nicht gemessen werden können, was die mittlere Größe und Konzentration verzerren kann. Abbildung 4 zeigt die Größendaten für jede der Formulierungen mit Pyrolipidgehalt. Tabelle 1 zeigt Statistiken basierend auf den Größendaten. Unter Verwendung eines Verhältnisses von vor- und nachkondensierten mittleren Durchmessern zeigten die Ergebnisse, dass die 0% Pyro-Lipid-Formulierung mit 1,72 ± 0,02 die kleinste mittlere Durchmesserverschiebung aufwies. Die 50% Pyro-Lipid-Formulierung hatte mit 2,38 ± 0,08 den größten mittleren Durchmesser. Die 1%ige Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe hatte die höchste beobachtete Konzentration bei (2,71 ± 0,13) × 1010 /ml, während die 40%ige Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe die niedrigste beobachtete Konzentration bei (7,36 ± 0,81) × 109 /ml aufweist. Größendaten zeigten, dass die 10% Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe mit 261 ± 13 nm das kleinste Peakdimeter hatte, während die 50% Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe mit 390 ± 55 nm die größte hatte. Im Allgemeinen nahm mit zunehmendem Pyro-Lipidgehalt die Konzentration ab und der mittlere Durchmesser nahm zu. Da die nachkondensierten Proben auf der Vorläufer-Mikroblasenprobe basieren, trat der Trend für beide Arten von Ultraschallkontrastmitteln auf. Als der Pyro-Lipidgehalt zunahm, begann sich eine Mikroblasen-Subpopulation (mit einer Spitzengröße von etwa 2000 μm) zu bilden. Dieser sekundäre Peak war in der 0% Pyro-Lipid-Mikroblasenprobe nicht vorhanden und am deutlichsten in den 40% und 50% Pyro-Lipid-Populationen.
Abbildung 5 zeigt repräsentative Absorptionsmessungen der 30% Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe. Der Peak der intakten Probe in PBS betrug 700 nm, während die gestörte Probe in Triton den Peak auf 671 nm verschob. Dabei zeigte sich, dass die intakten Baugruppen im Vergleich zu den einzelnen, unmontierten Lipidkomponenten unterschiedliche optische Eigenschaften aufweisen.
Abbildung 6A zeigt repräsentative Fluoreszenzmessungen der vorkondensierten Mikroblasenprobe, während Abbildung 6B eine nachkondensierte Tröpfchenprobe mit 30% Pyrolipid zeigt. Die intakte Probe in PBS hatte einen Fluoreszenzpeak bei 704 nm, während die gestörte Form einen Peak bei 674 nm aufweist. Subtrahiert man den gestörten Bereich unter der Kurve mit dem intakten Bereich unter der Kurve und dividiert man die Differenz durch den gestörten Bereich unter der Kurve, ergibt sich die Quenching-Effizienz, die für die 30% Pyro-Lipid-Mikroblasenprobe bzw. Tröpfchenprobe 98,61% bzw. 98,07% beträgt.
Um zu demonstrieren, dass Tröpfchen in Mikroblasen umgewandelt werden, wurden verdünnte Tröpfchen abgebildet und in einem 37 °C Strömungsphantom mit einem Ultraschallsystem verdampft. Abbildung 7 zeigt repräsentative Ultraschallbilder der 30% Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe, die bei unterschiedlichen Drücken aufgenommen wurde. Bei niedrigen Drücken (Abbildung 7A) gab es sehr wenig Signal, nur Hintergrundsignal von Luftblasen, die von der Agarsynthese klebten. Dies liegt daran, dass Tröpfchen nicht echogen sind und keinen Ultraschall streuen. Bei einer etwas hohen Leistung wurden einige Mikroblasen erzeugt (Abbildung 7B), wie das Auftreten von hellen Flecken zeigt. Mit zunehmendem Druck wurden mehr Mikroblasen erzeugt (Abbildung 7C und 7D). Dabei zeigte sich auch, dass die Tröpfchen bei 37 °C nicht spontan verdampfen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Bilder der Schritte zur Bildung der 30% igen Pyrolipidlösung. A)Lipidpulver plus Pyro-SPC in Chloroform. B) Lösung zum Auflösen hinzugefügt. C)Lipidfilm getrocknet und auf die Innenwand der Durchstechflasche beschichtet. D)Lipid-Durchstechflasche mit Aluminiumfolie umwickelt (Außenfolie zur Wiederverwendung geklebt). E)Hydratisierte Lipidlösung. F)Lipidlösung in Serumfläschchen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Der Gasaustauscher mit 10 Verteilern. Die Ventile, auf die im Protokoll verwiesen wird, sind beschriftet. Anweisungen zum Zusammenbau des Gasaustauschers finden Sie in der Zusatzdatei "Andere Protokolle und Daten". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig03.jpg"> Abbildung 3: A) Die Lipidlösungen der 7 Formulierungen (0% bis 50% Pyro-SPC) in Probenfläschchen. Die Abbildungen B bis D zeigen Bilder der Schritte, die unternommen wurden, um 30% Pyro-Lipid-Tröpfchen herzustellen. B)30% ige Pyro-Lipid-Lösung in einer Probendurchstechflasche. C) Nach der Agitation. D) 15 min Größe ausgewählt. E) Untere Trennwand auf Decafluorbutan-Durchstechflasche übertragen. D) Nachkondensation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig04.jpg"> Abbildung 4: Coulter Counter (CC) Größendaten der von der Größe ausgewählten Mikroblasen- und Tröpfchenproben mit unterschiedlichem Pyrolipidschalengehalt(n = 3). Die durchgezogenen grünen Linien stellen Mikroblasen und die gepunkteten Cyanlinien Tröpfchen dar. A) 0% Pyro-SPC. B)1% Pyro-SPC. C) 10% Pyro-SPC. D)20% Pyro-SPC. E)30% Pyro-SPC. F)40% Pyro-SPC. G)50% Pyro-SPC. H)Die insgesamt beobachteten Konzentrationen von Mikroblasen- und Tröpfchenproben aus dem CC basierend auf dem Pyro-SPC-Gehalt in der Schale. Alle Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Alle Messungen wurden mit einer 10 μm Apertur durchgeführt, die einen Größenbereich von 200 nm bis 6000 nm aufweist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig05.jpg"> Abbildung 5: Repräsentative ultraviolett-sichtbare (UV-Vis) Spektroskopie-Absorptionsmessungen von 300 bis 800 nm der nachkondensierten 30% Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe, verdünnt in PBS und in 1% Triton. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig06.jpg"> Abbildung 6: Repräsentative Fluoreszenzemission von 600 bis 750 nm angeregt bei 410 nm. A)Größengewählte, vorkondensierte 30% Pyro-Lipid-Mikroblasenprobe in PBS und in 1% Triton. B)Nachkondensierte 30% Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe in PBS und in 1% Triton. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig07.jpg"> Abbildung 7: Repräsentative Ultraschallbilder eines 37 °C Agar-Strömungsphantoms, aufgenommen mit einem präklinischen 21-MHz-Linear-Array-Wandler im B-Modus (siehe Materialtabelle). Die linke Spalte (Abbildungen A, C, E, &amp; G) zeigt PBS-Steuerelemente. Die rechte Spalte (Abbildungen B, D, F, &amp; H) zeigt 20 μL nachkondensierte 30% Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe, verdünnt in 50 ml 37 °C PBS. Jede Zeile repräsentiert Freifeld-Spitzennegpressumdrücke, die aus der Arbeit von Sheeran et al. geschätzt wurden8 Die gelben Dreiecke zeigen die Fokustiefe an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Methode</td>
			<td>Agent</td>
			<td>Pyro Schale %</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>30</td>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Blasen</td>
			<td>Konz. [/mL]</td>
			<td>(2,76 ± 0,28) × 10^10</td>
			<td>(3.04 ± 0.15) × 10^10</td>
			<td>(2.02 ± 0.11) × 10^10</td>
			<td>(1,91 ± 0,22) × 10^10</td>
			<td>(1.47 ± 0.05) × 10^10</td>
			<td>(8,47 ± 0,95) × 10^9</td>
			<td>(9.89 ± 0.15) × 10^9</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Blasen</td>
			<td>Peak [nm]</td>
			<td>329 ± 6</td>
			<td>297 ± 15</td>
			<td>305 ± 21</td>
			<td>273 ± 14</td>
			<td>310 ± 40</td>
			<td>266 ± 33</td>
			<td>393 ± 89</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Blasen</td>
			<td>Mittelwert [nm]</td>
			<td>609 ± 2</td>
			<td>603 ± 15</td>
			<td>635 ± 6</td>
			<td>690 ± 8</td>
			<td>812 ± 1</td>
			<td>935 ± 22</td>
			<td>950 ± 55</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Blasen</td>
			<td>Median [nm]</td>
			<td>450 ± 6</td>
			<td>421 ± 6</td>
			<td>414 ± 6</td>
			<td>432 ± 5</td>
			<td>490 ± 2</td>
			<td>596 ± 37</td>
			<td>695 ± 41</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Tröpfchen</td>
			<td>Konz. [/mL]</td>
			<td>(2.18 ± 0.07) × 10^10</td>
			<td>(2.71 ± 0.13) × 10^10</td>
			<td>(1.75 ± 0.18) × 10^10</td>
			<td>(1,72 ± 0,13) × 10^10</td>
			<td>(1.09 ± 0.01) × 10^10</td>
			<td>(7.36 ± 0.81) × 10^9</td>
			<td>(7.38 ± 0.28) × 10^9</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Tröpfchen</td>
			<td>Peak [nm]</td>
			<td>292 ± 0</td>
			<td>297 ± 17</td>
			<td>261 ± 13</td>
			<td>280 ± 9</td>
			<td>268 ± 17</td>
			<td>287 ± 38</td>
			<td>390 ± 55</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Tröpfchen</td>
			<td>Mittelwert [nm]</td>
			<td>353 ± 5</td>
			<td>350 ± 5</td>
			<td>347 ± 1</td>
			<td>347 ± 4</td>
			<td>397 ± 1</td>
			<td>399 ± 6</td>
			<td>400 ± 7</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Tröpfchen</td>
			<td>Median [nm]</td>
			<td>318 ± 4</td>
			<td>318 ± 4</td>
			<td>310 ± 1</td>
			<td>315 ± 2</td>
			<td>340 ± 0</td>
			<td>367 ± 5</td>
			<td>370 ± 9</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Größendatenstatistik der Mikroblasen- und Tröpfchenproben mit unterschiedlichem Pyro-SPC-Gehalt von Coulter Counter (CC) (n = 3). Alle Fehler weisen auf eine Standardabweichung hin.
Ergänzende Informationen - Lipid Formula Sheet: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/Supplementary%20Information%20-%20Lipid%20Formula%20Sheet.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Informationen - Andere Protokolle und Daten: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/Supplementary%20Information%20-%20Other%20Protocols%20and%20Data.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

In diesem Protokoll werden Methoden zur Synthese und Charakterisierung multimodaler Phasenwechsel-Porphyrintröpfchen beschrieben.

Synthese und Charakterisierung multimodaler Phasenwechsel-Porphyrintröpfchen

Phase-change droplets are a class of ultrasound contrast agents that can convert into echogenic microbubbles in situ with the application of sufficient ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es das vollständige Verfahren zur Herstellung von Tröpfchen aus dem Lipidfilm über die Lipidlösung bis hin zu Mikroblasen und dann zu Tröpfchen bietet. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Einfachheit der Kondensation von Mikroblasen zu Tröpfchen. Allein durch Abkühlen und Verwirbeln können Tröpfchen ohne Druckbeaufdruckung hergestellt werden.Eine visuelle Demonstration ist wichtig, da ein einfacher Test, um zu sehen, ob die Mikroblasen erfolgreich kondensiert wurden, darin besteht, die Änderung der Transluzenz visuell zu überprüfen. Kimoon Yoo, ein Masterstudent im Gang Zheng Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Entfernen Sie mit einem Decapper die Aluminiumdichtung auf der Serumdurchstechflasche und übertragen Sie einen Milliliter der Lipidlösung auf eine 1,85-Milliliter-Borosilikatglas-Probendurchstechflasche mit einem Phenol-Schraubverschluss, indem Sie die Lipidlösung die Innenwand hinunterfließen lassen, ohne Blasen zu erzeugen.Mit der 1,85 Milliliter Probenfläschchen können Sie sich darauf vorbereiten, mit dem Gasaustauscher Dekafluorbutangas in den Kopfraum der Probenfläschchen zu fließen. Stellen Sie sicher, dass alle Ventile am Gastauscher ordnungsgemäß geschlossen und die Pumpe ausgeschaltet ist. Öffnen Sie das Verteilerventil und entfernen Sie vorsichtig die entsprechende Nadel aus dem Verteiler.Öffnen Sie Druckventil A und Druckventil B und drehen Sie das Gasflaschenventil ca. 1/16 bis 1/8 gegen den Uhrzeigersinn, um es teilweise zu öffnen. Öffnen Sie das T-Griffventil und entkappen Sie die Probenfläschchen mit der Lipidlösung. Legen Sie die Verteilernadel über die Flüssigkeitsluftschnittstelle der Durchstechflasche, drehen Sie das Luftreglerventil langsam im Uhrzeigersinn, bis sich die Luftreglernadel leicht aus ihrer Ruheposition bewegt, und lassen Sie das Perfluorkohlenstoffgas 30 Sekunden lang sanft in den Kopfraum der Durchstechflasche fließen, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen entstehen.Stellen Sie bei Bedarf das Luftreglerventil ein. Nach 30 Sekunden die Probenfläschchen sorgfältig und schnell aufbewahrt, ohne die Durchstechflasche zu sehr zu bewegen. Sowohl das Gasflaschenventil, das T-Griffventil, das Luftreglerventil, das Druckventil A, das Druckventil B und das Verteilerventil.Ummanteln Sie die Nadel vorsichtig, beschriften Sie dann die Probenfläschchen und versiegeln Sie den Hals mit Wachsfolie im Uhrzeigersinn. Lagern Sie die Probenfläschchen im Dunkeln und bei vier Grad Celsius für mindestens 10 Minuten oder bis zu 24 Stunden. Legen Sie etwa 100 Gramm Trockeneis in einen isolierten Behälter und legen Sie normales Eis in einen anderen isolierten Behälter.Holen Sie sich eine zuvor vorbereitete Decafluorbutan-Serumdurchstechflasche auf 1,5-Zoll-20-Gauge-Nadeln, eine Ein-Milliliter-Kunststoffspritze, einen 200-Milliliter-Behälter, eine Metallzange und ein Thermometer. Legen Sie die Probendurchstechflasche mit der Lipidlösung in das mechanische Rührwerk und rühren Sie 45 Sekunden lang. Es sollte eine Veränderung der Farbe und Transluzenz geben.Stellen Sie nach dem mechanischen Rühren die Probendurchstechflasche rechts vor Licht abgeschirmt auf und starten Sie einen 15-minütigen Countdown, um die Durchstechflasche abzukühlen und die Mikroblasen auszuwählen. Wenn der Countdown 10 Minuten erreicht hat, füllen Sie einen Behälter mit etwa 200 Millilitern Isopropanol und kühlen Sie ihn mit einer Metallzange auf minus 20 Grad Celsius mit Trockeneis ab. Nachdem die Mikroblasen 15 Minuten lang ausgewählt wurden, suchen Sie in der Beispielfläschchen nach der ausgewählten Partition.Halten Sie die Probendurchstechflasche rechts oben, entkappen Sie die Probendurchstechflasche vorsichtig und ziehen Sie etwa 0,7 Milliliter der unteren Trennwand mit einer 1,5 Zoll 20-Gauge-Nadel, die an einer Ein-Milliliter-Kunststoffspritze befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass keine der oberen Trennwände zurückgezogen ist, und bewegen Sie die Spritze nicht, um Lufteinschlüsse zu entfernen. Wenn Sie auf den Mittelkreis des Gummistopfens zielen, führen Sie eine andere 20-Gauge-Nadel in eine Decafluorbutan-Serumdurchstechflasche ein, während Sie die Nadel in der Nähe der Oberseite der Serumdurchstechflasche halten, um sie zu entlüften, und führen Sie dann die Nadel mit den ausgewählten Mikroblasen ein.Übertragen Sie langsam die Größe der ausgewählten Mikroblasen. Lassen Sie die Flüssigkeit vorsichtig die Innenwand der Decafluorbutan-Serumdurchstechflasche hinuntergleiten. Sobald die gesamte ausgewählte Mikroblasenlösung übertragen wurde, entfernen Sie die Nadel mit der Spritze, aber lassen Sie die Entlüftungsnadel drin, um den Unterdruck zu lindern.Fügen Sie dem Isopropanolbad kleine Mengen Trockeneis oder Isopropanol bei Raumtemperatur hinzu, um sicherzustellen, dass die Badtemperatur zwischen minus 15 und minus 17 Grad Celsius liegt. Mit der 20-Gauge-Entlüftungsnadel, die in der Nähe der Oberseite der Serumdurchstechflasche eingeführt wurde, legen Sie die Serumfläschchen und das Isopropanolbad, wobei die Mikroblase unter dem Niveau des Isopropanols gehalten wird, aber der Fläschchenhals darüber und intermittierend die Serumfläschchen für zwei Minuten verwirbelt, um die Mikroblasen zu kondensieren. Schwenken Sie die Serumfläschchen nicht kontinuierlich im Isopropanol und lassen Sie die Lösung nicht einfrieren.Etwa fünf Sekunden schwenken und die Serumfläschchen aus dem Isopropanol heben. Überprüfen Sie die Eiskeimbildung und setzen Sie dann das Wirbeln in Isopropanol fort. Wenn sich Eisbildung abnäht, schwenken Sie die Serumfläschchen in der Luft, bis sie sich auflöst.Nach der zweiminütigen Kondensation die Serumfläschchen aus dem Isopropanolbad entfernen und die Entlüftungsnadel entfernen. Die Mikroblasen sollten zu Tröpfchen kondensiert sein, wie die Änderung der Transluzenz zeigt. Wischen Sie die Serumdurchstechflasche ab, beschriften Sie sie und legen Sie sie auf normales Eis in einen dunklen isolierten Behälter, bis sie einsatzbereit ist.Ungeöffnete Tröpfchen mit intakter Aluminiumdichtung sollten bis zu sechs Stunden stabil sein, solange das geschmolzene Eis bei Bedarf ausgetauscht wird. Wenn Sie gebrauchsfertig sind, entfernen Sie die Aluminiumdichtung mit dem Decapper. Nach der Verwendung dieses Protokolls wurden vorkondensierte, größengewählte Mikroblasen und nachkondensierte Tröpfchen auf einem Coulter-Zähler mit einer 10-Mikron-Öffnung dimensioniert.Die Größendaten für die 30%ige Pyrolipidformulierung werden gezeigt. Die Statistiken, die auf den Größendaten basieren, werden hier angezeigt. Unter Verwendung eines Verhältnisses von vor- und nachkondensierten mittleren Durchmessern zeigten die Ergebnisse, dass mit zunehmendem Pyrolipidgehalt die Konzentration abnahm und der mittlere Durchmesser zunahm.Die repräsentativen Absorptionsmittelmessungen der 30%igen Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe werden gezeigt. Dabei zeigte sich, dass die intakten Baugruppen im Vergleich zu den einzelnen unmontierten Lipidkomponenten unterschiedliche optische Eigenschaften aufweisen, die sich in unterschiedlichen Peaks widerspiegeln. Repräsentative Blütenstandsmessungen der vorkondensierten Mikroblasen-, postkondensierten Tröpfchenprobe mit 30% Pyrolipid werden hier gezeigt und zeigen unterschiedliche Fluoreszenzpeaks für intakte Proben in der gestörten Form.Es werden repräsentative Ultraschallbilder der 30%igen Pyro-Lipid-Tröpfchen-Probe gezeigt, die bei unterschiedlichen Drücken abgebildet wurden. Bei niedrigen Drücken wurde nur ein Hintergrundsignal von Luftblasen beobachtet, die von der Agarsynthese festhielten. Bei einer etwas höheren Leistung wurden einige Mikroblasen erzeugt, was durch das Auftreten von hellen Flecken demonstriert wird.Mit zunehmendem Druck wurden mehr Mikroblasen erzeugt. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Kondensationstemperatur hier für diese spezifische Tröpfchenschalenformulierung optimiert ist. Unterschiedliche Schalenformulierungen können eine andere Temperatur erfordern.

synthesis-characterization-multi-modal-phase-change-porphyrin

Research

Forschung

JoVE Journal

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Erfahren Sie die Synthese und Charakterisierung multimodaler Phasenwechsel-Porphyrintröpfchen durch einfache Kühlung und Schwenkung ohne Druck. Diese Methode ermöglicht die Kondensation von Mikroblasen zu Tröpfchen für biophysikalische Anwendungen.

Synthese und Charakterisierung multimodaler Phasenwechsel-Porphyrintröpfchen

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