Name: Bestimmung der Toxizität von UV-Strahlung und Chemikalien auf primären und immortalisierten humanen Hornhautepithelzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Erfahren Sie, wie UV-Strahlung und Chemikalien die Toxizität auf primären und immortalisierten humanen Hornhautepithelzellen bestimmen. Diese in-vitro-Methode reduziert Tierversuche bei der Sicherheitsbewertung ophthalmologischer Produkte effektiv.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren erhielten für diese Arbeit keine Förderung.

1. Kultivierung von pHCECs und iHCECs
<ol><li>Züchten Sie die pHCECs und iHCECs in humanem okulärem Epithelmedium (HOEM) mit den folgenden Nahrungsergänzungsmitteln: 6 mM L-Glutamin, 0,002 % Zellmedienergänzung O (Materialtabelle), 1,0 μM Epinephrin, 0,4 % Zellmedienergänzung P (Materialtabelle), 5 μg/ml rh Insulin, 5 μg/ml Apotransferrin und 100 ng/ml Hydrocortisonhemisuccinat in Kollagen-1-beschichteten Kulturflaschen (18 ml in einem 75 cm2 Kulturkolben).</li>
	<li>Wechseln Sie das Medium in den Kolben alle 2-3 Tage, indem Sie das Medium entfernen, nachdem die Zellen auf ~80% Konfluenz gewachsen sind. Dissoziationslösung ohne Phenolrot zugeben und den Kolben bei 37 °C inkubieren, bis sich die Zellen vollständig gelöst haben. Neutralisieren Sie die Dissoziationslösung mit DMEM/F12 mit Serum und zentrifugieren Sie die Zellen anschließend bei 500 × g. Entfernen Sie das überstehende Medium und resuspendieren Sie die Zellen in HOEM-Medium.</li>
</ol>2. Bestimmung der Zellgröße mittels konfokaler Mikroskopie
<ol><li>Säen Sie sowohl pHCECs als auch iHCECs auf kollagenbeschichtete Petrischalen mit Glasbodendeckgläsern in einer Konzentration von 1 × 105 mit 1 ml HOEM. Kultivieren Sie pHCECs und iHCECs, einen Satz Kulturen für 24 Stunden und einen anderen Satz Kulturen für 48 Stunden, in einem Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2.</li>
	<li>Nach der Inkubationszeit werden die Zellen mit 500 μl Annexin-Färbepufferlösung, die Calcein (4 μM), Ethidiumhomodimer-1 (8 μM) und Annexin V (5 μl in 500 μl Puffer-Alexa Fluor 647-Konjugat) enthält, für 20 min bei 37 °C gefärbt. Nach der Färbung der Zellen ist das Mikroskop so einzustellen, dass es die Anregungs-/Emissionswellenlängen von 488/515 nm für Calcein-AM, 543/600 nm für Ethidiumhomodimer-1 und 633/665 nm für Annexin V mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop erfasst.</li>
	<li>Erhalten Sie die Bilder und nehmen Sie Z-Stapel auf, um die Zellgröße in drei Dimensionen zu bestimmen.<ol><li>Um die zweidimensionalen (2D) und dreidimensionalen (3D) Bilder aufzunehmen, suchen Sie den abzubildenden Bereich mit einem apochromatischen 40x/1,2-Wasserobjektiv. Scannen Sie mit den Lasern Argon (488) (erster Scan), HeNe1 (543) (zweiter Scan) und HeNe2 (633) (dritter Scan) in drei separaten Kanälen mit den Strahlteilern HFT 488/543/633, NFT 635 Vis und NFT 545 LP560, LP505.</li>
		<li>Verwenden Sie mehrspuriges sequenzielles Scannen, um Übersprechen zu reduzieren. HINWEIS: LP505 wird für Kanal 2 mit dem 488-Laser verwendet, um die Emission des Calcine-Farbstoffs zu erfassen. LP560 wird in Kanal 3 mit dem Laser 543 verwendet, um die Emission des Ethidium-Homodimers 1 zu erfassen. NFT 635 wird mit dem Laser 633 verwendet, um die Emission des Annexins V zu erfassen. Der Zweck des HFT ist es, das Anregungs- und Emissionslicht zu trennen. NFT spaltet Licht, indem es Licht < bestimmten Wellenlänge in einen separaten Kanal reflektiert, während Licht > einer bestimmten Wellenlänge zu einem zweiten Kanal durchgelassen wird. LP-Filter blockieren kürzere Wellenlängen als die angegebene Wellenlänge und lassen die längeren Wellenlängen durch.</li>
		<li>Um in 3D zu fotografieren, stellen Sie den Konfokal auf Z-Stapel ein und scannen Sie mindestens 20 Bilder.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Exposition der Zellen gegenüber UV-Strahlung
<ol><li>Die Zellen werden mit 5 × 104/ml HOEM in jede Vertiefung einer 24-Well-Kollagen-1-beschichteten Kulturplatte ausgesät und bei 37 °C mit 5 % CO2 für 3 h inkubiert. Nach der Inkubationszeit ist das Volumen des Mediums in den Vertiefungen auf 300 μl zu reduzieren. Als nächstes werden die Zellen in einem 37 °C-Inkubator in separaten Experimenten 5 und 20 Minuten lang UV-Strahlung ausgesetzt (sowohl UVA bei 6,48 W/m2 als auch UVB bei 1,82 W/m2, da sowohl UVA- als auch UVB-Röhren gleichzeitig im Inkubator eingeschaltet sind).</li>
	<li>Nach der UV-Bestrahlung werden 200 μl frisches HOEM in jede Vertiefung gegeben und 20 h bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert.</li>
	<li>Nach der Inkubation wird der Zellüberstand in jeder Vertiefung gesammelt und in sterile 2-ml-Polypropylenröhrchen überführt. Bei -80 °C einfrieren. Um die Zytokinspiegel zu bestimmen, die von den pHCECs und iHCECs nach UV-Exposition freigesetzt werden, verwenden Sie einen Multiplex-Zytokin-Assay und befolgen Sie die Anweisungen des Kits zur Quantifizierung der folgenden vier Zytokine: IL-6, IL-8, IL-1β und TNF-α.</li>
	<li>Fügen Sie den Zellen in den Vertiefungen ein metabolisches Assay-Reagenz hinzu.</li>
	<li>Bereiten Sie ein 10%iges metabolisches Assay-Reagenz in DMEM/F12 vor. Ersetzen Sie das Nährmedium in jeder Vertiefung durch 1 ml der 10%igen metabolischen Assay-Lösung und inkubieren Sie es bei 37 °C mit 5 % CO2 für 4 h.</li>
	<li>Messen Sie die Fluoreszenz jeder Lösung mit einem Fluoreszenzplatten-Lesegerät bei Anregungs-/Emissionswellenlängen von 530/590 nm.</li>
</ol>4. Exposition der Zellen gegenüber chemischen Toxinen
<ol><li>Die Keimzellen werden mit 5 × 104/ml HOEM in jede Vertiefung einer 24-Well-Kollagen-1-beschichteten Kulturplatte gegeben und bei 37 °C mit 5 % CO2 3 h lang inkubiert. Entfernen Sie nach der Inkubationszeit das Medium und setzen Sie die Zellen 5 und 15 Minuten lang 1 ml chemischen Toxinen (BAK 0,001 %, H2O2 0,01 % und SDS 0,0025 % in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)) aus.</li>
	<li>Entfernen Sie nach dem Kontakt mit den chemischen Toxinen die Toxine aus den Vertiefungen, spülen Sie sie mit 1 ml PBS und geben Sie 1 ml HOEM in jede Vertiefung. Nach 20 h Inkubation wird ein metabolischer Assay durchgeführt, indem das Medium durch 1 ml einer 10%igen metabolischen Assay-Lösung ersetzt und 4 h lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert wird. Messen Sie die Fluoreszenz mit einem Fluoreszenz-Multiwell-Plattenlesegerät bei Anregungs-/Emissionswellenlängen von 530/590 nm.</li>
	<li>Die Zellüberstände werden nach der 20-stündigen Inkubation aus den Vertiefungen in separate sterile 2-ml-Polypropylenröhrchen überführt und bei -80 °C eingefroren. Quantifizierung der Zytokine, die von den pHCECs und iHCECs nach Exposition gegenüber den Chemikalien freigesetzt werden. Verwenden Sie die gleiche Multiplex-Plattform, die auch zur Beurteilung der Zytokine der UV-behandelten Zellen verwendet wird. Verwenden Sie einen Multiplex-Zytokin-Assay gemäß den Anweisungen des Kits, um die folgenden vier Zytokine zu quantifizieren: IL-6, IL-8, IL-1β und TNF-α.</li>
</ol>5. Untersuchung von Zellen, die verschiedenen Konzentrationen von BAK ausgesetzt waren
<ol><li>Die Keimzellen werden mit 1 × 10 5/ml HOEM in jede Vertiefung einer 24-Well-Kollagen-1-beschichteten Kulturplatte gegeben und bei 37 °C mit5 % CO2 für 24 h inkubiert. Entfernen Sie nach der Inkubationszeit das Medium und setzen Sie die Zellen 5 Minuten lang 1 ml chemischen Toxinen (BAK 0,001 %, BAK 0,005 % und BAK 0,01 % in PBS) aus.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Exposition die chemischen Toxine, spülen Sie die Vertiefungen mit 1 ml PBS aus und geben Sie 1 ml HOEM in jede Vertiefung. Nach 20 h Inkubation werden die Zellen mit 500 μl Annexin-Färbepufferlösung, die Calcein (4 μM), Ethidiumhomodimer-1 (8 μM) und Annexin V (5 μL in 500 μL Puffer-Alexa Fluor 647-Konjugat) enthält, für 20 min bei 37 °C gefärbt. Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass die Intensitäten der Annexin-V-, Calcinein-AM- und Ethidium-1-Färbung bei Anregungs-/Emissionswellenlängen von 630/675 nm, 495/515 nm bzw. 528/617 nm gemessen werden. Bildgebung der Zellen mit dem Fluoreszenzmikroskop</li>
</ol>6. Datenanalyse
<ol><li>Führen Sie einen Normalitätstest und einen Test auf gleiche Varianzen durch, bevor Sie eine Varianzanalyse (ANOVA), eine Welch-ANOVA oder einen Kruskal-Wallis-Test durchführen. Verwenden Sie den entsprechenden Post-hoc-Test , um jede getestete Gruppe zu vergleichen. Legen Sie p < 0,05 fest.</li>
</ol>

<ol><li>McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+human+corneal+epithelial+cell+line+for+screening+the+safety+of+contact+lens+care+solutions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%26+Contact+Lens%22%5BJournal%5D)">Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro.</a> Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).</li>
<li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li>
<li>Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+ultraviolet-induced+damage+in+human+corneal%2C+lens%2C+and+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells.</a> Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).</li>
<li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li>
<li>Spurr, S. J., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+corneal+epithelium+with+Dispase+II+or+EDTA.+Effects+on+the+basement+membrane+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).</li>
<li>Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+corneal+epithelial+primary+cultures+and+cell+lines+with+extended+life+span%3A+in+vitro+model+for+ocular+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).</li>
<li>Araki-Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li>
<li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li>
<li>Toouli, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+mammary+epithelial+cells+immortalized+by+simian+virus+40+T-Antigen+or+by+the+telomerase+catalytic+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit.</a> Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).</li>
<li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%3A+Valuable+tools+or+useless+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li>
<li>Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+corneal+cell+cultures+in+cytotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Altex%22%5BJournal%5D)">Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing.</a> Altex. 21 (3), 129-134 (2004).</li>
<li>Huhtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+an+immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+rabbit+corneal+epithelial+cell+culture+in+cytotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).</li>
<li>Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effects+of+preserved+and+unpreserved+formulations+of+timolol+on+the+ocular+surface+of+albino+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits.</a> Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).</li>
<li>Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactant+and+UV-B-induced+damage+of+the+cultured+bovine+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+vitro%22%5BJournal%5D)">Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens.</a> Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).</li>
<li>Hughes, R., Kilvington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+hydrogen+peroxide+contact+lens+disinfection+systems+and+solutions+against+Acanthamoeba+polyphaga%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).</li>
<li>Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damaging+effects+of+ultraviolet+radiation+on+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea.</a> Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).</li>
<li>Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SV40+large+T+antigen+targets+multiple+cellular+pathways+to+elicit+cellular+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation.</a> Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).</li>
<li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pin1+inhibits+PP2A-mediated+Rb+dephosphorylation+in+regulation+of+cell+cycle+and+S-phase+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage.</a> Cell Death & Disease. 6, 1640(2015).</li>
<li>Muller, P. A., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+mutations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 mutations in cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).</li>
<li>Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase%3A+PP2A+structural+importance%2C+regulation+and+its+aberrant+expression+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer.</a> Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).</li>
<li>Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+Calpha+regulates+proliferation%2C+migration%2C+and+metastasis+of+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+nvestigation%3B+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells.</a> Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).</li>
<li>Xie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+and+inactivation+of+the+PP2A+complex+promotes+the+proliferation+and+angiogenesis+of+hemangioma+endothelial+cells+through+activating+AKT+and+ERK%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK.</a> Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).</li>
<li>Mallet, J. D., Rochette, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-dependent+ultraviolet+induction+of+cyclobutane+pyrimidine+dimers+in+the+human+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).</li>
<li>Cejkova, J., Cejka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxidative+stress+in+corneal+diseases+and+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).</li>
<li>Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoprotection%3A+a+review+of+the+current+and+future+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Photoprotection: a review of the current and future technologies.</a> Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).</li>
<li>Svobodova, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+after+acute+exposure+of+mice+skin+to+physiological+doses+of+UVB+and+UVA+light%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Dermatological+Research%22%5BJournal%5D)">DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light.</a> Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).</li>
<li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+irradiation+induces+the+production+of+multiple+cytokines+by+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).</li>
<li>Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+cigarette+smoke+on+oxidative+stress+and+proinflammatory+cytokine+release+in+primary+human+airway+epithelial+cells+and+in+a+variety+of+transformed+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells.</a> Respiratory Research. 7, 132(2006).</li>
<li>Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+biomarkers+of+inflammation+in+response+to+benzalkonium+chloride+on+corneal+and+conjunctival+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).</li>
</ol>

Der Autor, Lyndon W. Jones, hat in den letzten 3 Jahren über CORE Forschungsunterstützung oder Lehraufträge von den folgenden Unternehmen erhalten: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J&J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage und Visioneering. Lyndon Jones ist außerdem Berater und/oder Mitglied eines Beirats für Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis und Ophtecs. Die anderen Autoren haben nichts zu verraten.

Mögliche Unterschiede in der Verwendung von zwei Arten von HCECs wurden bewertet. Die Zellen wurden in das gleiche Medium (HOEM) mit identischen Zellkonzentrationen eingebracht und dann kurzen und langen Perioden von UV-Strahlung und drei Augentoxinen ausgesetzt. Die Dosen von UV-Strahlung und Chemikalien wurden auf der Grundlage ihrer physiologischen Wirkungen ausgewählt, die für die Zellen schädlich genug waren, um Zwischenreaktionen hervorzurufen, die verglichen werden konnten. Expositionszeiten von 5 und 20 min für U...

In-vitro-toxikologische Studien werden durchgeführt, um die toxischen Wirkungen von Chemikalien und anderen Wirkstoffen vorherzusagen, die Zellen schädigen können. Bei der Bewertung der Toxizität für die Hornhaut wurden humane Hornhautepithelzellen (HCECs) in Modellen zur Bewertung dieser Effekte verwendet 1,2,3,4. Diese Modelle bewerten in der Regel physiologische Effekte wie Veränderungen der Stoffwechselaktivität der Zelle, Zellproliferation und andere Zellfunktionen wie die Produktion und Freisetzung von entzündlichen Zytokinen. Für diese toxikologischen Studien wurden Zellen aus verschiedenen Quellen ausgewählt, um die schädlichen Auswirkungen von Chemikalien und UV-Strahlung auf HCECs zu bewerten 2,3. pHCEC-Linien sind von Unternehmen erhältlich, die diese Zellen aus Spendergewebe von Erwachsenen liefern. Primärzellen können mit Dispase behandelt und für die Kultur schonend von der Hornhaut abgekratzt werden5. Die Zellen werden dann auf Viren und Verunreinigungen getestet und dann kryokonserviert in 10% Dimethylsulfoxid verschickt.
Der Vorteil von primären Zelllinien besteht darin, dass die Zellen genetisch identisch mit den Zellen des Spenders sind. Dies ist ideal, da ein In-vitro-Modell das In-vivo-Gewebe so weit wie möglich nachahmen sollte. Der Nachteil von primären Zelllinien besteht darin, dass sie eine begrenzte Anzahl von Zellteilungen oder -passagenaufweisen 6. Die begrenzte Anzahl der verfügbaren Zellen schränkt die Anzahl der Experimente ein, die mit einer einzigen Primärkultur durchgeführt werden können, was die Kosten der Experimente erhöht.
Immortalisierte Zelllinien wurden auch in Toxizitätsmodellen für Zellkulturen verwendet. Im Gegensatz zur primären Zelllinie, die aus In-vivo-Gewebe gewonnen wird, wurde die immortalisierte Zelllinie jedoch genetisch verändert. Immortalisierte Zellen entstehen, indem die Gene eines Virus in die DNA von Primärzellen eingebautwerden 6,7,8. Zellen mit erfolgreicher viraler Geninkorporation werden für die immortalisierte Zelllinie ausgewählt. Der Vorteil der Immortalisierung besteht darin, dass sie eine unbegrenzte schnelle Proliferation ermöglicht und eine unbegrenzte Anzahl von Zellen zur Verfügung stellt, um mehrere Experimente mit derselben Zelllinie durchzuführen. Dies ermöglicht Konsistenz zwischen den Experimenten und senkt die Kosten.
Zusätzlich zu den Veränderungen in den Genen, die die Zellproliferation einschränken, können auch Veränderungen in der Expression von Genen mit kritischer Funktionalität auftreten9. Der Nachteil der Verwendung von immortalisierten Zellen besteht daher darin, dass sie in Bezug auf ihre Reaktion auf verschiedene äußere Reize möglicherweise nicht mehr die ursprünglichen In-vivo-Zellen darstellen10. Bei den Vergleichen wurden die toxischen Wirkungen von Chemikalien auf primäre und immortalisierte menschliche Hornhautkeratozyten11 sowie auf immortalisierte HCECs und Kaninchen-Hornhautepithel-Primärzellen12 beobachtet. Der Vergleich zwischen den Effekten von Toxinen auf primäre humane Keratozyten und immortalisierte Keratozyten zeigte keine signifikanten Unterschiede11. Mit den in diesem Artikel beschriebenen Methoden wird die Wirksamkeit dieser Assays zur Beurteilung der Toxizität von UV-Strahlung und Augentoxinen auf pHCECs und iHCECs bestimmt.
Es wurden drei okuläre Toxine ausgewählt, die üblicherweise in In-vitro-Assays verwendet werden: BAK,H2O2und SDS. BAK ist ein kationisches Konservierungsmittel, das häufig in ophthalmologischen Lösungen verwendet wird 13,14,H2O2wird häufig zur Desinfektion von Kontaktlinsen 15 verwendet, und SDS ist ein anionisches Tensid, das in Waschmitteln und Shampoos 14 vorkommt. Ähnlich wie Augentoxine kann auch UV-Strahlung HCECs erheblich schädigen3. Darüber hinaus kann eine übermäßige UV-Strahlung eine Augenerkrankung verursachen, die als Photokeratitis bekannt ist und durch Symptome wie Tränenfluss, Lichtempfindlichkeit und ein Gefühl der Körnigkeit gekennzeichnet ist16.
Es gibt eine unbegrenzte Anzahl von primären Zellkulturen, die verwendet werden können, und verschiedene immortalisierte Zelllinien, die entwickelt wurden. Daher wurde eine Untersuchung durchgeführt, um primäre HCECs mit einer immortalisierten HCEC-Linie zu vergleichen, um Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen Modellen zu ermitteln, die diese Zelltypen enthalten.
Diese Untersuchung nutzte die Mikroskopie, um mögliche Unterschiede zwischen pHCECs und iHCECs in Bezug auf die physiologische Reaktion der Zellen auf UV-Strahlung und Toxine zu bewerten. Die Auswirkungen von UV-Strahlung und Chemikalien auf die Zellstoffwechselaktivität und die inflammatorische Zytokinfreisetzung für die beiden Zelllinien wurden ebenfalls untersucht. Die Bedeutung der Bestimmung der Unterschiede zwischen den beiden Zelllinien besteht darin, die optimale Verwendung dieser Zelllinien für die Bewertung zu verstehen: 1) die Wirkung von UV-Strahlung auf Zellen, 2) die Auswirkungen von Toxinen auf Zellen und 3) die daraus resultierenden Veränderungen des Stoffwechsels, der Zelllebensfähigkeit und der Zellzytokinfreisetzung für zukünftige Studien.

<table><tbody><tr><td>75 cm2 Belüftete Flasche</td><td>Corning</td><td>354485</td><td>Dies ist die BioCoat-Marke, kollagenbeschichtete 96-Well-Platte</td></tr><tr><td></td><td>costar</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>dal 1025</td><td></td></tr><tr><td>Annexin Staining Pufferlösung</td><td>Invitrogen, Burlington, ON, Kanada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Annexin V</td><td>Invitrogen, Burlington, ON, Kanada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 Mikroskop mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop von Zeiss 510 System</td><td>Carl Zeiss Inc., Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning 48 Well Platten</td><td>Corning</td><td>354505</td><td>Dies ist die Marke BioCoat, kollagenbeschichtete</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td>CYT5MPV</td><td>Kann Fluoreszenz von 280 - 700 nm lesen (für Assay 540/590)</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Hycone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser mit Glasboden</td><td>MatTek Corporation, Ashland, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Menschliche Hornhautepithelzellen</td><td>University of Ottawa</td><td>N/A</td><td>SV40-immortalisierte menschliche Hornhautepithelzellen von Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Kanada) und wurden charakterisiert Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Funktionelle menschliche Hornhautäquivalente, die aus Zelllinien konstruiert werden. Wissenschaft. 1999;286:2169-72.</td></tr><tr><td>Human Ocular Epithelia Media (HOEM) mit den folgenden Ergänzungen:</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>SCMC001</td><td>Epigro Basismedium ergänzt mit 6 mM L-Glutamin, 0,002% EpiFactor O (Zellmedienergänzung O im Artikel), 1,0 &mu; M Epinephrin, 0,4% EpiFactor P (Zellmedienergänzung P im Artikel), 5 &mu; g/mL rh Insulin, 5 &mu; g/ml Apo-Transferrin und 100 ng/ml Hydrocortison-Hemisuccinat in Kollagen-1-beschichteten Kulturflaschen (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).</td></tr><tr><td>Lebendes totes Calcien- und Ethidium-Homodimer</td><td>Invitrogen, Burlington, ON, Kanada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 Instrument</td><td>Rockville, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex Assay</td><td>Rockville, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100-fache Konzentration, also 1 mL zu jedem 99 mL Medium hinzufügen</td></tr><tr><td>Primäre Hornhautepithelzellen</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>SCCE016</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Fluoreszenz-Multiwell-Plattenleser</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (Zelldissoziationslösung)</td><td>Fisher</td><td>Scientific 12605036</td><td></td></tr></tbody></table>

bestimmung der toxizität von uv-strahlung und chemikalien auf primären und immortalisierten humanen hornhautepithelzellen

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

Dieser Artikel beschreibt die Methoden zur Messung der Toxizität von ultravioletter (UV) Strahlung und Augentoxinen auf primären (pHCEC) und immortalisierten (iHCEC) humanen Hornhautepithelzellkulturen. Die Zellen wurden UV-Strahlung und toxischen Dosen von Benzalkoniumchlorid (BAK), Wasserstoffperoxid (H2O2) und Natriumdodecylsulfat (SDS) ausgesetzt. Die metabolische Aktivität wurde mit einem metabolischen Assay gemessen. Die Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen wurde mit einem Multiplex-Interleukin (IL)-1β-, IL-6-, IL-8- und Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α)-Assay gemessen, und die Zellen wurden mit Fluoreszenzfarbstoffen auf ihre Lebensfähigkeit untersucht.
Die schädigenden Auswirkungen von UV-Strahlung auf die Stoffwechselaktivität und die Freisetzung von Zytokinen traten bei 5 min UV-Exposition für iHCEC und 20 min für pHCEC auf. Ähnliche prozentuale Abnahmen der metabolischen Aktivität von iHCEC und pHCEC traten nach Exposition gegenüber BAK,H2O2 oder SDS auf, und die signifikantesten Veränderungen in der Zytokinfreisetzung traten für IL-6 und IL-8 auf. Die Mikroskopie von fluoreszenzgefärbten iHCEC- und pHCEC-BAK-exponierten Zellen zeigte den Zelltod bei 0,005% BAK-Exposition, obwohl der Grad der Ethidiumfärbung bei den iHCECs größer war als bei pHCECs. Unter Verwendung mehrerer Methoden zur Beurteilung toxischer Wirkungen mittels Mikroskopie, Bewertung der Stoffwechselaktivität und Zytokinproduktion konnte die Toxizität von UV-Strahlung und chemischen Toxinen sowohl für primäre als auch für immortalisierte Zelllinien bestimmt werden.

Zellengröße Die primären und immortalisierten HCECs wurden mit drei Fluoreszenzfarbstoffen visualisiert, die drei verschiedene Stadien der Zellviabilität widerspiegeln. Lebende Zellen sind grün (Calcein-AM), tote Zellen rot (Ethidium-Homodimer-1) und apoptotische Zellen gelb (Annexin-V-Computer-angepasste Farbe zur besseren Visualisierung des Fluoreszenzsignals). Lebende Zellen enthalten Esterasen im Zellzytoplasma und wandeln Calcein-AM in Calcein um. Tote Zellen haben Zellmembranen, die für Ethidium...

Dieser Artikel beschreibt die Verfahren zur Bewertung der Toxizität von UV-Strahlung und chemischen Toxinen auf einer primären und immortalisierten Zelllinie.

Bestimmung der Toxizität von UV-Strahlung und Chemikalien auf primären und immortalisierten humanen Hornhautepithelzellen

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Mit dieser Methode kann die Toxizität neuer ophthalmologischer Produktformulierungen in vitro bewertet werden. Durch die Verfeinerung der Konzentrationen von Chemikalien und Produktformulierungen unter Verwendung von Augenzellen in vitro kann der Einsatz von Tieren zur Beurteilung der Sicherheit neuer Produkte minimiert werden. In-vitro-Assays bewerten Toxizitätsendpunkte, die in vivo nicht bewertet werden können, wie z. B. die Bestimmung der Wirkung einer Chemikalie auf die mitochondriale Funktion, die Integrität der Zellmembran und die Enzymaktivität.Die Bewertung der Zelltoxizität in vitro ist der Schlüssel zum Verständnis potenzieller Toxizitätsmechanismen. Dies ist wichtig, um eine maximal tolerierbare Dosis therapeutischer Chemikalien im Auge zu erreichen. Das Verfahren wird von Nijani Nagaarudkumaran, einem Forscher des Jones Laboratory, demonstriert.Beginnen Sie damit, sowohl pHCECs als auch iHCECs auf kollagenbeschichtete Petrischalen mit Deckgläsern mit Glasboden in einer Konzentration von 1 x 10 bis 5 mit 1 Milliliter humanem Augenepithelmedium (HOEM) zu setzen. Züchten Sie pHCECs und iHCECs, 1 Satz Kulturen für 24 Stunden und ein weiteres Set für 48 Stunden in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Nach der Inkubation werden die Zellen mit 500 Mikrolitern Annexin-Färbepufferlösung, die 4 mikromolare Calcein, 8 mikromolare Ethidiumhomodimer 1 und Annexin 5 enthält, 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius gefärbt.Nachdem Sie die Zellen gefärbt haben, stellen Sie das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop so ein, dass es die Anregungs- und Emissionswellenlängen erfasst, wie im Textmanuskript beschrieben. Besorgen Sie sich die zweidimensionalen und dreidimensionalen Bilder gemäß den Anweisungen im Manuskript. Die Zellen werden mit 5 x 10 bis 4 pro Milliliter HOEM in jede Vertiefung einer 24-Well-Kollagen-1-beschichteten Kulturplatte ausgesät und bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid 3 Stunden lang inkubiert.Nach der Inkubation wird das Volumen des Mediums in den Vertiefungen auf 300 Mikroliter reduziert. Als nächstes setzen Sie die Zellen in separaten Experimenten 5 und 20 Minuten lang UVA-Strahlung mit 6,48 Watt pro Quadratmeter und UVB-Strahlung mit 1,82 Watt pro Quadratmeter bei 37 Grad Celsius aus. Nach UV-Bestrahlung 200 Mikroliter frisches HOEM in jede Vertiefung geben und 20 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren.Am nächsten Tag wird der Zellüberstand in jeder Vertiefung gesammelt und in sterile 2-Milliliter-Polypropylenröhrchen umgefüllt. Den Überstand bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Um die Zytokinspiegel zu bestimmen, die von den pHCECs und iHCECs nach UV-Exposition freigesetzt werden, verwenden Sie einen Multiplex-Zytokin-Assay und befolgen Sie die Anweisungen des Kits zur Quantifizierung von Interleukin 6, Interleukin 8, Interleukin-1 beta und TNF-alpha.Bereiten Sie ein 10%metabolisches Assay-Reagenz in DMEM und F12 vor. Ersetzen Sie das Nährmedium in jeder Vertiefung durch 1 Milliliter der 10%igen metabolischen Assay-Lösung und inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius mit 5%Kohlendioxid für 4 Stunden. Messen Sie die Fluoreszenz jeder Lösung mit einem Fluoreszenzplatten-Lesegerät bei 530 Nanometern Anregung und 590 Nanometern Emissionswellenlänge.Samenzellen bei 5 x 10 bis zum Viertel pro Milliliter HOEM in jeder Vertiefung einer 24-Well-Kollagen-1-beschichteten Kulturplatte. Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid 3 Stunden inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium und setzen Sie die Zellen 5 und 15 Minuten lang 1 Milliliter chemischen Toxinen aus, zu denen 0,001 % Benzalkoniumchlorid oder BAK, 0,01 % Wasserstoffperoxid und 0,0025 % Natriumdodecylsulfat in PBS gehören.Entfernen Sie nach dem Kontakt mit den chemischen Toxinen die Giftstoffe aus den Vertiefungen, spülen Sie sie mit 1 Milliliter PBS ab und geben Sie 1 Milliliter HOEM in jede Vertiefung. Führen Sie nach 20 Stunden Inkubation einen metabolischen Assay durch, indem Sie das Medium durch 1 Milliliter einer 10%igen metabolischen Assay-Lösung ersetzen und 4 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5%igem Kohlendioxid inkubieren. Messen Sie die Fluoreszenz jeder Lösung mit einem Fluoreszenzplatten-Lesegerät bei einer Anregung von 530 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 590 Nanometern.Nach der 20-stündigen Inkubation werden die Zellüberstände aus den Vertiefungen in separate sterile 2-Milliliter-Polypropylenröhrchen überführt und bei minus 80 Grad Celsius eingefroren. Verwenden Sie dieselbe Multiplex-Plattform, die zur Bestimmung der Zytokine aus den UV-behandelten Zellen verwendet wird, gemäß den Anweisungen des Kits zur Quantifizierung von Interleukin 6, Interleukin 8, Interleukin-1 beta und TNF-alpha. Samenzellen bei 1 x 10 bis 5 pro Milliliter HOEM in jede Vertiefung einer 24-Well-Kollagen-1-beschichteten Kulturplatte und inkubieren bei 37 Grad Celsius mit 5%Kohlendioxid für 24 Stunden.Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium und setzen Sie die Zellen 5 Minuten lang 1 Milliliter chemischen Toxinen aus, einschließlich 0,001 % BAK, 0,005 % BAK und 0,01 % BAK in PBS. Entfernen Sie nach der Exposition die chemischen Giftstoffe, spülen Sie die Vertiefungen mit 1 Milliliter PBS aus und geben Sie 1 Milliliter HOEM in jede Vertiefung. Nach 20 Stunden Inkubation werden die Zellen mit 500 Mikrolitern Annexin-Färbepufferlösung, die Calcein, Ethidiumhomodimer und Annexin 5 enthält, 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius gefärbt.Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass Intensitäten bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 630 und 675 Nanometern für Annexin 5, 495 und 515 Nanometer für Calcinein AM und 528 und 617 Nanometer für die Ethidium-1-Färbung gemessen werden. Nehmen Sie dann mit dem Fluoreszenzmikroskop Bilder der Zellen auf. Es stellte sich heraus, dass es sich bei den iHCECs um kleine Zellen handelte, die zwischen 10 und 20 Mikrometer groß waren, und die pHCECs lagen nach 24 Stunden Wachstum im Bereich von 20 bis 50 Mikrometern.Ähnliche Unterschiede im Größenbereich wurden für iHCECs und pHCECs nach 48 Stunden Wachstum beobachtet. Im Vergleich zu den nicht UV-exponierten Zellen war die Stoffwechselaktivität der bestrahlten pHCECs nach 20 Minuten Exposition signifikant reduziert. Bei iHCECs nahm die metabolische Aktivität für Zellen, die sowohl nach 5 als auch nach 20 Minuten bestrahlt wurden, ab.Daher dauerte es eine längere Expositionszeit, um die metabolische Aktivität der pHCECs zu reduzieren als die der iHCECs. Die maximale Zytokinfreisetzung durch die iHCECs lag bei 5 Minuten UV-Exposition. Die maximale Zytokinfreisetzung für pHCECs erfolgte bei 20 Minuten UV-Exposition.Gemessen an der Gesamtmenge der freigesetzten inflammatorischen Zytokine setzten die pHCECs wesentlich mehr Interleukin-1 beta, Interleukin 8 und TNF-alpha frei als die iHCECs, während die iHCECs mehr Interleukin 6 freisetzten. Sowohl pHCECs als auch iHCECs zeigten eine Veränderung in der Freisetzung von Interleukin 6 nach Exposition gegenüber allen drei Chemikalien. BAK verursachte eine Abnahme der Freisetzung von Interleukin 6 im Vergleich zur Kontrollgruppe sowohl für primäre als auch für immortalisierte HCECs.Wasserstoffperoxid bewirkte eine erhöhte Freisetzung von Interleukin 6 aus iHCECs und eine Abnahme der Freisetzung aus pHCECs. Sowohl pHCECs als auch iHCECs waren mit 0,005 % und 0,1 % des BAK signifikant geschädigt. Nach der Durchführung von In-vitro-Bewertungen der Toxizität von Augenzellen könnten weitere Tiermodelle zur Augentoxizität durchgeführt werden, um die Wirkung eines Augenprodukts auf die Hornhautnerven oder das okuläre Immunsystem zu bestimmen.Diese Techniken sind unerlässlich, um die Mechanismen der Toxizität von Chemikalien und Produktformulierungen für das Auge zu bestimmen, und tragen dazu bei, den Einsatz von Tieren für Produktentwicklungstests zu minimieren.

determining-toxicity-uv-radiation-chemicals-on-primary-immortalized

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video beschreibt einen fluorometrischen In-vitro-Assay zur Bewertung der Auswirkungen von künstlichen Tränenformulierungen auf die zelluläre Stoffwechselaktivität von Hornhautepithelzellen unter Verwendung von Resazurin-basierter Alamarblau-Lösung. Eine ungiftige Formulierung hält die Zellen in einem gesunden, metabolisch aktiven Zustand und erleichtert die Reduktion von Resazurin in ein stark fluoreszierendes Resorufin.

alamarBlue Assay: Eine empfindliche fluorometrische Methode zum Screening der zytotoxischen Wirkungen künstlicher Tränenformulierungen auf die Stoffwechselaktivität menschlicher Hornhautepithelzellen

Epidermale Keratinozyten bilden eine funktionelle Hautbarriere und sind an der Frontlinie der Wirtsverteidigung gegen äußere Umweltbeleidigungen positioniert. Hier beschreiben wir Methoden zur Isolierung und Primärkultur von epidermalen Keratinozyten aus neonataler und erwachsener Maushaut und Induktion der terminalen Differenzierung und UVB-ausgelösten Entzündungsreaktionen von Keratinozyten.

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

Hoher Durchsatz kleine hemmende RNA-Screening ist ein wichtiges Instrument, das dazu beitragen könnten, um die molekularen Mechanismen der chemischen Hornhaut epithelialen Verletzungen schneller zu erhellen. Hier präsentieren wir Ihnen die Entwicklung und Validierung der Expositionsmodelle und Methoden für das Hochdurchsatz-Screening von Fluorwasserstoff und Chlorpikrin induzierte Hornhaut epitheliale Schädigung.

Hoher Durchsatz SiRNA Screening für Chlorpikrin und Fluorwasserstoff-induzierte Hornhaut Epithelzelle Verletzungen

Dieses Protokoll stellt eine einfache zweistufige Methode zur Differenzierung von Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Xeno und Feeder zellfreie Kulturbedingungen. Die Zelle Kulturmethoden hier vorgestellten ermöglichen kosteneffiziente, groß angelegte Produktion von klinische Qualität Zellen auf Hornhaut Zelle Therapie Verwendung anwendbar.

Effiziente und skalierbare gerichtete Differenzierung von klinisch kompatibel Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll demonstriert den gleichzeitigen Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), lebenden Zellen und abgestorbenen Zellen in lebenden Primärkulturen aus Maus-Augenoberflächenzellen. 2',7'-Dichlorfluoresceindiacetate, Propidiumiodid und Hoechst-Färbung werden verwendet, um die ROS,, abgestorbene Zellen und lebende Zellen zu bewerten, gefolgt von Bildgebung und Analyse.

Bewertung von oxidativen Schäden in den primären Maus-Augen-Oberflächenzellen/Stammzellen als Reaktion auf Uv-C-Schäden (UV-C)

Ziel dieses Protokolls ist es zu bewerten, ob verschiedene künstliche Tränenformulierungen menschliche Hornhautepithelzellen mit einem In-vitro-Modell vor der Austrocknung schützen können. Nach der Exposition gegenüber künstlichen Tränenformulierungen und Dericcation werden menschliche Hornhautepithelzellen auf metabolische Aktivität untersucht.

Wirkung künstlicher Tränenformulierungen auf die Metabolische Aktivität menschlicher Hornhautepithelzellen nach Exposition gegenüber Dericcation

Hier werden Tiermodelle auf der Basis von Maus und Kaninchen für mechanische und chemische Verletzungen des Hornhautepithels entwickelt, um neue Therapeutika und den zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen.

Ex vivo und in vivo Tiermodelle für mechanische und chemische Verletzungen des Hornhautepithels

Wir haben ein Rattenmodell für schwere Hornhautentzündungen durch Hornhautepithelkürettage in Kombination mit Hornhautnähten entwickelt. Die Studie untersuchte Entzündungsmuster der Hornhaut, die epitheliale Proliferation und Veränderungen der limbalen Stammzellen unter entzündlichen Bedingungen.

Etablierung eines Modells für schwere Hornhautentzündungen bei Ratten auf der Grundlage einer Hornhautepithelkürettage in Kombination mit Hornhautnähten

Die ex vivo-Organkultur der Schweinehornhaut und die epitheliale Wundheilung bieten ein wirtschaftliches, ethisches, reproduzierbares und quantitatives Mittel zur Prüfung der Augentoxizität von Chemikalien. Sie helfen auch bei der Aufklärung von Mechanismen, die der Regulation der Epithelisierung und Gewebereparatur zugrunde liegen, sowie bei der Bewertung von Therapeutika zur Behandlung von diabetischer Keratopathie und verzögerter Wundheilung.

Bewertung der therapeutischen und chemischen Toxizität anhand von organgezüchteten Schweinehornhäuten und der Heilung von Epithelwunden

Hier beschreiben wir eine detaillierte Verfahren zur Züchtung von primären humanen bronchialen Epithelzellen aus Explantaten des menschlichen bronchialen Atemwege Gewebe einschließlich differenzierter Wachstum auf einer Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche. Diese Methode bietet eine reichhaltige Quelle von primären Zellen zur Untersuchung der Rolle der Atemwegsepithel in der menschlichen Lunge Gesundheit und Krankheit.

Primären humanen bronchialen Epithelzellen aus Explantaten Grown

Erfahren Sie, wie UV-Strahlung und Chemikalien die Toxizität auf primären und immortalisierten humanen Hornhautepithelzellen bestimmen. Diese in-vitro-Methode reduziert Tierversuche bei der Sicherheitsbewertung ophthalmologischer Produkte effektiv.

Bestimmung der Toxizität von UV-Strahlung und Chemikalien auf primären und immortalisierten humanen Hornhautepithelzellen

Weitere Videos entdecken