Name: Wachstum, Reinigung und Titration des onkolytischen Herpes-Simplex-Virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Lernen Sie die Kultivierung, Reinigung und Titration des onkolytischen Herpes-Simplex-Virus für präklinische Studien. Diese Methode ermöglicht die Herstellung hochwertiger Virusstämme in Biosicherheitsstufe 2 Laboratorien.

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Die Forschung im Saha-Labor wurde teilweise durch Mittel des DOD (W81XWH-20-1-0702) und der Dodge Jones Foundation-Abilene unterstützt. Samuel D. Rabkin und Melissa R.M. Humphrey wurden teilweise von NIH unterstützt (R01 CA160762).

1) oHSV-Wachstum
HINWEIS: Stellen Sie die Genehmigung des institutionellen Biosicherheitsausschusses sicher, bevor Sie mit oHSV zusammenarbeiten. Diese Studie wurde unter dem genehmigten IBC-Protokoll Nr. 18007 durchgeführt. Halten Sie die BSL2-Vorsichtsmaßnahmen ein: Bleichen Sie alle Pipetts, Spitzen, Röhrchen und andere Materialien, die mit dem Virus in Kontakt kommen. Sprühen Sie Handschuhe mit 70% Isopropylalkohol, bevor die Hände die BSL2-Zellkulturhaube verlassen. Waschen Sie die Hände nach der Arbeit mit einem Virus immer gründlich mit Seife.
<ol><li>Am Tag -1 Vero-Zellen mit niedriger Passage in 20 T-150 cm2 Kolben mit einer Dichte von 7-8 × 10 6 Zellen/Kolben in normalem Vero-Zellmedium aussäen. HINWEIS: Vero Medium wird durch Ergänzung von Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM) mit 10% hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum (IFCS) hergestellt.</li>
	<li>An Tag 0 (Zellen sind zu 80-90% konfluent), fügen Sie oHSV-Inoculum auf die Vero-Zellen hinzu.<ol>
<li>Herstellung von Virus inoculum<ol>
<li>Verwenden Sie eine Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,01 (MOI kann je nach Replikationskapazität des Virus von 0,01 bis 0,1 variieren) für die Virusverstärkung. Verwenden Sie Formel (1), um die Virusmenge (ml) für 20 Kolben zu berechnen. Virusmenge (ml) für 20 Kolben = benötigte Virusmenge (pfu)/Titer Virusvorrat (pfu/ml)(1)</li>
			<li>Verwenden Sie die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 1% IFCS, um das Virusinoculum (7 ml pro T-150 cm2-Kolben, dh ~ 140 ml für 20 Kolben) vorzubereiten. Fügen Sie die erforderliche Menge oHSV zu 140 ml DPBS/1% iger IFCS-Lösung mit hohem Glukosegehalt hinzu, Wirbel für 1 minute und halten Sie die Mischung bereit für die Zugabe zu Vero-Zellen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Waschen Sie die T-150 cm2 Kolben 2x mit DPBS mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 1% IFCS (10 ml /Waschen). Saugen Sie den DPBS/1% IFCS an und fügen Sie 7 ml Virus inoculum/T-150 cm2 Kolben hinzu.</li>
		<li>Die Kolben vorsichtig für 5 min mit einer Kolbenwippe schaukeln, um das Inokält über die Vero-Monoschicht richtig zu verteilen, und dann die Kolben bei 37 ° C für 1,5-2 h inkubieren. Stellen Sie sicher, dass das Inkubatorregal eben ist.</li>
		<li>Entfernen Sie das Inokum und fügen Sie DMEM mit 1% IFCS (25 ml / Kolben) hinzu. Inkubieren Sie die Kolben für 2-4 Tage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Überprüfen Sie die Flaschen täglich auf 90-100% CPE (siehe Abbildung 2).</li>
	<li>Ernten Sie die oHSV-infizierten Vero-Zellen.<ol>
<li>Sammeln Sie den Kulturüberstand (~ 20 ml) aus jedem Kolben (lassen Sie ~ 5 ml in jedem Kolben) in 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen oder Medienbehältern.</li>
		<li>Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen vorsichtig vom Boden der Kolben abzukratzen. HINWEIS: Die Zellen sollten schnell aus den Kolben kommen.</li>
		<li>Geben Sie ~15 ml des Kulturüberstands (gesammelt in Schritt 1.4.1) in jeden Kolben (der das Volumen von ~20 ml in jedem Kolben bringt, d.h. 400 ml für 20 Kolben) und waschen Sie den Boden der Kolben einige Male vorsichtig mit einer sterilen serologischen Pipett von 10 ml. HINWEIS: Nicht kräftig pipeten. Ziel ist es, alle Zellen intakt zu halten.</li>
		<li>Sammeln Sie die Zellen (+ Medium) in 50 mL konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis (verwenden Sie 8 Röhrchen, um 400 ml geerntete Zellen aus 20 Kolben zu halten).</li>
		<li>Drehen Sie die Zellen bei 300 g für 10 min bei 4 °C und saugen Sie den Überstand an.</li>
		<li>1,25 ml (50 %) Virus Buffer (VB) und 1,25 ml (50%) des Kulturüberstands (gesammelt in Schritt 1.4.1) zu jedem Zentrifugenröhrchen und suspendieren Sie jedes Pellet gründlich wieder. Übertragen Sie die re-suspendierten Zellen von acht 50-ml-Zentrifugenröhrchen in ein 50-ml-kegelförmiges Zentrifugenröhrchen. HINWEIS: Siehe die Herstellung der VB-Lösung in Tabelle 1. Filtersterilisieren Sie die VB-Lösung mit einem Mediensterilisationsfilter. Verwenden Sie 0,5 ml VB + 0,5 ml Überstand pro T-150 cm2 Kolben für die erneute Suspension, d.h. für 20 Kolben (20 ml), verwenden Sie 10 ml VB und 10 ml Kulturüberstand.</li>
		<li>Die wieder suspendierten Zellen mit Trockeneis/100% Ethanol einfrieren und bei -80 °C lagern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2) oHSV-Reinigung
<ol><li>Snap-Freeze (in Trockeneis und 100% Ethanol) / Auftauen (in einem 37 ° C warmen Wasserbad) der Zellen gefolgt von Wasserbad-Beschallung für 1 min für insgesamt 3 Zyklen, um eine ordnungsgemäße Lyse der Zellen zu gewährleisten, um das Virus im Überstand freizusetzen. HINWEIS: Führen Sie die Beschallung für 1 Minute mit 40 kHz, 120 V Leistung durch. Wenn kein abstimmbarer Beschaller verfügbar ist, verwenden Sie einen Ultraschall-Wasserbad-Ultraschallgerät. Nehmen Sie ein 50 μL Aliquot für die Titration in Abschnitt 3, das hilft zu identifizieren, welcher der folgenden Schritte für einen möglichen Virusverlust während des Reinigungsverfahrens verantwortlich ist.</li>
	<li>Das Zelllysat wird mit Benzonase-Nuklease (175 Einheiten/ml) + 2 mMMgCl2 (1 M Stamm = 2 μL/ml), Wirbel behandelt und 30 min bei 37 °C inkubiert. Legen Sie das Rohr auf Eis und führen Sie die folgenden Schritte bei 4 °C durch.</li>
	<li>Pelletieren Sie die Zellreste durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit.<ol>
<li>Drehen Sie das Zelllysat bei 300 g für 10 min.</li>
		<li>Sammeln Sie den Überstand in einem neuen konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen (suspendieren Sie das Zellpellet in 0,5 ml VB erneut, bezeichnen Sie es als Pellet-1 und lagern Sie es bei 4 °C für die Verwendung in Schritt 2.3.5; siehe Abbildung 1).</li>
		<li>Drehen Sie den Überstand (erhalten in Schritt 2.3.2) erneut bei 500 g für 10 min.</li>
		<li>Sammeln Sie den Überstand in einem neuen konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen (suspendieren Sie das Zellpellet in 0,5 ml VB erneut, bezeichnen Sie es als Pellet-2 und lagern Sie es bei 4 °C für die Verwendung in Schritt 2.3.5; siehe Abbildung 1).</li>
		<li>Kombinieren Sie das wieder suspendierte Pellet-1 (ab 2.3.2) und Pellet-2 (ab 2.3.4) zu einem neuen 1,7-ml-Zentrifugenrohr, 2x Vortex/Sonicat (Wasserbad) und spinnen Sie es bei 400 g für 10 min. Sammeln Sie den Überstand und kombinieren Sie ihn mit dem in Schritt 2.3.4 erhaltenen Überstand; siehe Abbildung 1). HINWEIS: Führen Sie die Beschallung für 1 Minute mit 40 kHz, 120 V Leistung durch, um die Virusaggregation vor dem Filtrationsverfahren in Schritt 2.4 zu verhindern. Nehmen Sie ein 50 μL Aliquot des kombinierten Überstands zur Titration in Abschnitt 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Filtern Sie den kombinierten Überstand (~21 mL, d.h. 20 mL ab 1.4.6, 0.5 mL ab 2.3.2 und 0.5 mL ab 2.3.4) mit der folgenden 3-stufigen Filtrationsmethode.<ol>
<li>Ziehen Sie 21 ml des Überstands mit einer 10-ml-Spritze (jeweils 5-7 ml für einen einfachen Durchgang durch den Filter) und führen Sie ihn durch einen sterilen 5 μm Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Membranfilter, der auf einem neuen konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen (als TUBE 1gekennzeichnet) platziert ist.<ol>
<li>1 ml VB wird in ein 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen gegeben, das in 2.4.1 entleert wurde (um die verbleibende Spuren von Virusüberstand zu sammeln), Wirbel, und durch denselben 5 μm PVDF-Filter auf TUBE 1 gehen (wodurch die Gesamtmenge auf 22 ml Filtrat gebracht wird). Fahren Sie mit Schritt 2.4.2 fort.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ziehen Sie 22 mL des Filtrats aus TUBE 1 (wie in 2.4.1) und leiten Sie es durch einen sterilen 0,8 μm Mixed CelluloseEster (MCE) Membranfilter, der auf einem neuen 50 mL konischen Zentrifugenröhrchen (als TUBE 2 gekennzeichnet) platziert ist.<ol>
<li>Fügen Sie 1 ml VB zu TUBE 1 hinzu, das in Schritt 2.4.2, Wirbel, entleert wurde, und führen Sie es durch den gleichen 0,8 μm MCE-Filter, der auf TUBE 2 platziert ist (wodurch die Gesamtmenge auf 23 ml Filtrat gebracht wird). Fahren Sie mit Schritt 2.4.3 fort.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ziehen Sie 23 ml Filtrat aus TUBE 2 (wie in 2.4.1) und leiten Sie es durch einen sterilen 0,45 μm PVDF-Filter, der auf einem neuen konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen (als TUBE 3gekennzeichnet) platziert ist.<ol>
<li>Fügen Sie 1 ml VB zu TUBE 2 hinzu, das in Schritt 2.4.3, Wirbel, entleert wurde, und leiten Sie es durch den gleichen 0,45 μm PVDF-Filter, der auf TUBE 3 platziert ist (wodurch die Gesamtmenge auf 24 ml Filtrat gebracht wird). HINWEIS: Nehmen Sie ein Aliquot von 50 μL des Filtrats zur Titration in Abschnitt 3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Hochgeschwindigkeitszentrifugation mit dem Saccharose-Gradienten-Verfahren HINWEIS: In diesem Protokoll wurde ein F13-14x50cy-Rotor mit festem Winkel verwendet. Sowohl der Rotor als auch die Zentrifuge müssen bei 4 °C sein, bevor mit den folgenden Schritten fortgefahren werden kann.<ol>
<li>10 ml einer eiskalten, steril gefilterten 25%igen Saccharoselösung (hergestellt durch Auflösen von 25 g Saccharosepulver in 100 ml Hank's Balanced Salt Solution) in ein neues 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen geben.</li>
		<li>Langsam (3 ml/min) werden 24 ml des Virusfiltrats (aus Schritt 2.4.3.1) auf die Saccharoseschicht auffüllen. Achten Sie darauf, getrennte Schichten des Virusfiltrats und der Saccharoselösung zu erhalten. HINWEIS: Bis zu 30 ml der Virusschicht können über 10 ml der Saccharoselösung hinzugefügt werden.</li>
		<li>Zentrifuge das Röhrchen für 90 min bei 22.620 g bei 4 °C.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand und die Saccharoseschicht aus dem konischen 50 mL Zentrifugenröhrchen. HINWEIS: Das Viruspellet sollte weißlich sein. Nehmen Sie ein 50 μL Aliquot des Überstandes und ein 50 μL Aliquot der Saccharoseschicht zur Titration in Abschnitt 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Suspendieren Sie das Pellet erneut in 10% iger Glycerin/PBS-Lösung.<ol>
<li>1 ml steriles 10% Glycerin (verdünnt in PBS) in das konische Zentrifugenröhrchen mit 50 ml geben, um das Pellet abzudecken. HINWEIS: Die Menge der wieder suspendierten Mischung kann je nach Pelletgröße variieren (z. B. 0,8-1,2 ml). Ein kleineres Volumen würde eine höhere Viruskonzentration ergeben.</li>
		<li>Legen Sie das 50 mL konische Zentrifugenrohr für 2-4 h auf Eis. Beschallen / wirbeln Sie das Pellet während dieser Zeit alle 15 Minuten für 30 s, um das Pellet zu vertreiben / wieder aufzuhängen.</li>
		<li>Sammeln Sie das wieder suspendierte Pellet (1 ml 10% Glycerin / PBS + die Pelletgröße bringt das Gesamtvolumen auf ~ 1,3 ml) in einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. [Optional: Fügen Sie weitere 0,3 ml 10% Glycerin / PBS in das gleiche konische 50-ml-Zentrifugenröhrchen hinzu, um die verbleibende Spurenmenge des Pellets zu sammeln, pipetieren Sie es nach oben und unten und kombinieren Sie es mit dem wieder suspendierten Pellet in Schritt 2.6.3, um das Gesamtvolumen auf ~ 1,6 ml zu bringen.]<ol>
<li>Wenn die Suspension in Schritt 2.6.3 trüb oder trüb ist (aufgrund von Zellablagerungen), zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 g für 10 min, übertragen Sie den Überstand in ein neues 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und fahren Sie mit Schritt 2.6.4 fort.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nehmen Sie ein 50 μL Aliquot für die oHSV-Titration in Abschnitt 3. Den Rest der Lösung (250 μL/Aliquot) in sterile Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschlüssen (gut versiegelt für die Langzeitlagerung) einfrieren und bis zur Verwendung bei -80 °C lagern (bereit für experimentelle Studien, sobald der oHSV-Titer bestimmt ist). HINWEIS: Alle Materialien, die mit dem Virus in Kontakt kommen, müssen vor dem Entfernen aus der Haube oder der Entsorgung gebleicht oder mit ultravioletter Strahlung behandelt werden.</li>
	</ol></li>
</ol>3. oHSV-Titration und Plaque-Assay
<ol><li>Samen Sie 1,7-1,8 x10 5 Vero-Zellen/Well in einer 6-Well-Zellkulturplatte in Vero-Zellmedium (DMEM mit 10% IFCS; siehe Schritt 1.1). HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zellen homogen im gesamten Brunnen verteilt sind. Wirbeln Sie die Platte nicht, was zu einer Ansammlung von Zellen in der Mitte der Vertiefungen führen kann. Um ein Verwirbeln zu verhindern, schaukeln Sie die Platte langsam von Hand vertikal, dann horizontal und dann vorsichtig in den Inkubator.</li>
	<li>Am nächsten Tag (wenn die Zellen 70-80% Konfluenz erreichen), saugen Sie das Kulturmedium an und fügen Sie 1 ml / Well PBS mit hohem Glukosegehalt hinzu, ergänzt mit 1% IFCS. Lassen Sie die Platte in der Zellkulturhaube, bis Schritt 3.3 abgeschlossen ist.</li>
	<li>Verdünnen Sie das Virus in 5-ml-Polypropylenröhrchen seriell mit PBS/1% IFCS(Abbildung 3). HINWEIS: Verwenden Sie das in Schritt 2.6.4 gesammelte Aliquot von 50 μL zur seriellen Verdünnung. In der1. Röhrchen (10-3 Verdünnung) werden 2 μL des Virus im Jahr 1998 μL PBS/1%IFCS, Wirbel, hinzugefügt. Im2. Röhrchen (10-5 Verdünnung) 10 μL aus dem 1. Röhrchen in 990 μL PBS/1% IFCS, Wirbel nehmen. In der3. Röhrchen (10-6 Verdünnung) 100 μL aus der 2. Röhrchen in 900 μL PBS/1% IFCS, Wirbel nehmen; Setzen Sie diese 10-fache serielle Verdünnung bis zur10-9-Verdünnung fort. Weitere Informationen finden Sie in Abbildung 3.</li>
	<li>Aspiratieren Sie PBS/1% IFCS und fügen Sie 0,7 ml/Well des seriell verdünnten Virus (beginnend von 10-5 bis 10-9)zu Vero-Zellen hinzu. HINWEIS: Lassen Sie die Zellen nicht trocknen.</li>
	<li>Die Platte vorsichtig auf einer Wippe für 5 min bei Raumtemperatur schaukeln (um eine homogene Verteilung des Virusinokulums zu gewährleisten).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte für 1,5 h bei 37 °C. HINWEIS: Bereiten Sie während dieser Inkubationszeit eine 1:1000-Verdünnung des humanen Immunglobulins G (IgG) in DMEM vor, die mit 1% IFCS ergänzt wird. Bereiten Sie für eine 6-Well-Platte 12,5 ml vor, damit 2 ml / Well in Schritt 3.7 verwendet werden können. Passen Sie die Verdünnung an, um Chargenschwankungen im menschlichen IgG zu berücksichtigen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Virus-Inokum aus den Vertiefungen und fügen Sie 2 ml / Well von 0,1% humanem IgG (um das oHSV im Kulturmedium zu neutralisieren und die Bildung von sekundären Plaques zu verhindern) in DMEM mit 1% IFCS ergänzt. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 3-4 Tage. HINWEIS: Klare Plaques bilden sich normalerweise in 3 Tagen.</li>
	<li>Fixier- und Färbeplatten<ol>
<li>Entfernen Sie den Überstand und fixieren Sie die Zellen für 5 min in reinem Methanol (1 ml /Well). Entfernen Sie das Methanol und lassen Sie die Platten an der Luft trocknen.</li>
		<li>Verdünnen Sie den Giemsa-Fleck (1:5) mit entionisiertem Wasser und fügen Sie 1 ml des verdünnten Giemsa-Flecks pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 10-15 min.</li>
		<li>Entfernen Sie den Fleck, spülen Sie ihn mit Leitungswasser ab und lassen Sie die Platten an der Luft trocknen.</li>
		<li>Zählen Sie die Plaques mit einem Seziermikroskop.</li>
		<li>Optional für oHSVs mit lacZ-Ausdruck:<ol>
<li>Entfernen Sie den Überstand und fixieren Sie die Zellen mit kaltem 0,2% Glutaraldehyd / 2% Paraformaldehyd für 5-10 min bei Raumtemperatur.</li>
			<li>Entfernen Sie die Fixierlösung und waschen Sie die Zellen 3x mit PBS.</li>
			<li>Fügen Sie den Zellen X-gal-Lösung hinzu (1 ml/Well) und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 2 h. HINWEIS: Der X-gal-Fleck sollte am Tag der Färbung frisch zubereitet werden; Langzeitlagerung kann zu einem Ausbleichen der Farbe führen. Siehe die Herstellung der X-gal-Lösung in Tabelle 1.</li>
			<li>Entfernen Sie den X-gal-Fleck und waschen Sie den Teller 1 Minute lang mit Leitungswasser.</li>
			<li>Gegenfleck mit neutraler roter Lösung (1 ml/well) für 2 min bei Raumtemperatur. HINWEIS: Siehe Herstellung der neutralroten Lösung in Tabelle 1.</li>
			<li>Waschen Sie den Teller mit Leitungswasser für 1 min; Lassen Sie die Platten an der Luft trocknen.</li>
			<li>Zählen Sie blaue Plaques mit einem Seziermikroskop (Abbildung 4).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Berechnen Sie den Titer mit der Formel (2) Titer in pfu/ml (plaquebildende Einheiten) = Anzahl der Plaques/0,7 ml × Verdünnungsfaktor (2) HINWEIS: Wenn beispielsweise 25 Plaques in der10-9-Verdünnungsbohrung gefunden werden, beträgt der Titer 25/0,7 × 109 = 35,7 × 109 = 3,57 × 1010 pfu/ml. Dies ist der letzte oHSV-Titer von Aliquoten, die in Schritt 2.6.4 hergestellt wurden.</li>
</ol>

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</ol>

SDR ist Miterfinder von Patenten im Zusammenhang mit onkolytischen Herpes-simplex-Viren, im Besitz und verwaltet von der Georgetown University und dem Massachusetts General Hospital, die Lizenzgebühren von Amgen und ActiVec Inc. erhalten haben und im wissenschaftlichen Beirat von EG 427 sind. Die anderen Autoren haben nichts preiszugeben.

Das Protokoll beginnt mit dem Wachstum von oHSV in Vero-Zellen mit niedriger Passage. Die Konfluenz der Vero-Zellmonoschicht sollte zum Zeitpunkt der Virusimpfung ~ 80% betragen, da überwachsene Zellen enge faserige Strukturen entwickeln können, die den Eintritt von oHSV in Vero-Zellen reduzieren können20. Sobald 90-100% CPE beobachtet wurde, wird der Kulturüberstand entfernt, Zellen geerntet, in VB/Überstand resuspendiert (siehe Schritt 1.4.6), einrastig eingefroren und bei -80 °C zur späteren Re...

Onkolytische Viren (OVs) sind eine aufkommende und einzigartige Form der Krebsimmuntherapie. OVs replizieren sich selektiv in tumoren Zellen und lysieren sie (schonen normale/gesunde Zellen)1 und induzieren gleichzeitig eine Antitumorimmunität2. Das onkolytische Herpes-simplex-Virus (oHSV) ist eines der am umfangreichsten untersuchten Viren unter allen OVs. Talimogene Laherparepvec (T-VEC) ist die erste und einzige OV, die in den USA die FDA-Zulassung für die Behandlung des fortgeschrittenen Melanoms3erhalten hat. Neben T-VEC werden viele weitere gentechnisch veränderte oHSVs präklinisch und klinisch bei verschiedenen Krebsarten3,4,5,6,7, 8getestet. Die derzeitige fortgeschrittene rekombinante DNA-Biotechnologie hat die Machbarkeit der Entwicklung neuer oHSVs, die für therapeutische Transgene kodieren, weiter erhöht3,5. Ein effizientes System der oHSV-Vermehrung, -Aufreinigung und -bestimmung ist entscheidend, bevor ein (neu entwickeltes) oHSV für In-vitro- und In-vivo-Studien getestet werden kann. Dieser Artikel beschreibt eine einfache Schritt-für-Schritt-Methode des oHSV-Wachstums (in Vero-Zellen), der Reinigung (durch die Saccharose-Gradienten-Methode) und der Titration (durch einen oHSV-Plaque-Assay in Vero-Zellen) (Abbildung 1). Es kann leicht in jedem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL2) eingesetzt werden, um einen qualitativ hochwertigen Virusbestand für präklinische Studien zu erhalten.
Vero, eine afrikanische grüne Affennierenzelllinie, ist die am häufigsten verwendete Zelllinie für die oHSV-Vermehrung9,10,11,12,13, da Vero-Zellen einen defekten antiviralen Interferon-Signalweg haben14. Andere Zelllinien mit inaktiviertem Stimulator der Interferon-Gene (STING) signalisierung können auch für das oHSV-Wachstum verwendet werden12,13. Dieses Protokoll verwendet Vero-Zellen für oHSV-Wachstum und Plaque-Assay. Nach der Vermehrung werden oHSV-infizierte Zellen geerntet, lysiert und einer Reinigung unterzogen, wobei lysierte Zellen zuerst mit Benzonase-Nuklease behandelt werden, um die DNA der Wirtszelle abzubauen, die Nukleinsäure-Protein-Aggregation zu verhindern und die Viskosität des Zelllysats zu reduzieren. Da die ordnungsgemäße Aktivierung der Benzonase oft Mg2+erfordert, werden in diesem Protokoll15 1-2mM MgCl2 verwendet. Die Wirtszellreste aus dem mit Benzonase behandelten Zelllysat werden durch serielle Filtration vor der Hochgeschwindigkeits-Saccharose-Gradientenzentrifugation weiter eliminiert. Ein viskoses 25%iges Saccharoselösungskissen trägt dazu bei, eine langsamere Virusmigration durch die Saccharoseschicht zu gewährleisten, wobei wirtszellbezogene Komponenten im Überstand belassen werden, wodurch die Reinigung verbessert und der Virusverlust im Pelletbegrenzt wird 16. Das gereinigte oHSV wird dann auf Vero-Zellen titriert, und virale Plaques werden durch Giemsa-Färbung17 oder X-Gal-Färbung (für LacZ-kodierende oHSVs)18visualisiert.

<table><tbody><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Sigma</td><td>CLS3620</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Röhrchen aus Polypropylen</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturplatten</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase Nuklease</td><td>Sigma</td><td>E8263-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>Fisher Scientific</td><td>179693</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifizierte Eagle Medium</td><td>Corning</td><td>MT-10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Corning</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum-Hyklon</td><td></td><td>SH3007003</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>Sigma</td><td>G3032</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-262-23</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Corning</td><td>MT-21-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco mit hohem Glukosegehalt s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma</td><td>D4031</td><td></td></tr><tr><td>Humanes Immunglobulin</td><td>Gamastan</td><td>NDC 13533-335-12</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Sterilisationsfilter für Medien, 250 mL</td><td>Nalgene, Fisher Scientific</td><td>09-740-25E Sterilisationsfilter</td><td></td></tr><tr><td>für Medien, 500 mL</td><td>Nalgene, Fisher Scientific</td><td>09-740-25C</td><td></td></tr><tr><td>Neutralrote Lösung</td><td>Sigma</td><td>N4638</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher wissenschaftlich</td><td>&nbsp; 15710S</td><td></td></tr><tr><td>Tellerwippe</td><td>Fisher</td><td>88861043</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferricyanid</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferrocyanid</td><td>Sigma</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R Zentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75004381</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 21R Zentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002446</td><td></td></tr><tr><td>sterile Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-371</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter, 0,45 PVDF</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter, 0,8 MCE</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLAA033SS</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter, 5 & Mikro; m PVDF</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLSV025LS</td><td></td></tr><tr><td>T150 Kulturflasche</td><td>Falcon</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>816116</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschall-Wasserbad</td><td>Branson</td><td>CPX-952-116R</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Corning</td><td>46-101-RF</td><td></td></tr></tbody></table>

wachstum, reinigung und titration des onkolytischen herpes-simplex-virus

Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus

Onkolytische Viren (OVs), wie das onkolytische Herpes-simplex-Virus (oHSV), sind eine schnell wachsende Behandlungsstrategie im Bereich der Krebsimmuntherapie. OVs, einschließlich oHSV, replizieren sich selektiv in Krebszellen und töten sie ab (schonen gesunde / normale Zellen), während sie eine Anti-Tumor-Immunität induzieren. Aufgrund dieser einzigartigen Eigenschaften werden oHSV-basierte Behandlungsstrategien zunehmend präklinisch und klinisch zur Behandlung von Krebs eingesetzt, einschließlich des von der FDA zugelassenen Talimogens Laherparevec (T-Vec). Wachstum, Reinigung und Titration sind drei wesentliche Labortechniken für alle OVs, einschließlich oHSVs, bevor sie für experimentelle Studien verwendet werden können. Dieses Papier beschreibt eine einfache Schritt-für-Schritt-Methode zur Verstärkung von oHSV in Vero-Zellen. Wenn sich oHSVs vermehren, erzeugen sie einen zytopathischen Effekt (CPE) in Vero-Zellen. Sobald 90-100% der infizierten Zellen eine CPE aufweisen, werden sie schonend geerntet, mit Benzonase und Magnesiumchlorid(MgCl2)behandelt, filtriert und mit der Saccharose-Gradienten-Methode gereinigt. Nach der Reinigung wird die Anzahl der infektiösen oHSV (als Plaque-bildende Einheiten oder PFUs bezeichnet) durch einen "Plaque-Assay" in Vero-Zellen bestimmt. Das hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um hochtitere oHSV-Bestände für In-vitro-Studien in Zellkultur und in vivo Tierversuchen vorzubereiten.

Ein kurzer Überblick über das gesamte Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt, die die kritischen Schritte beim Wachstum, der Reinigung und der Titration von oHSV darstellt. CPE in Vero-Zellen kann bereits 4 Stunden nach HSV-Infektion nachgewiesen werden19. Abbildung 2 zeigt CPE in Vero-Zellen zu drei verschiedenen Zeitpunkten nach einer oHSV-Infektion. Das Niveau des CPE wird im Laufe der Zeit erhöht. In diesem Protokoll wird 90-100% CPE...

In diesem Manuskript beschreiben wir eine einfache Methode des Wachstums, der Reinigung und der Titration des onkolytischen Herpes-simplex-Virus für die präklinische Anwendung.

Wachstum, Reinigung und Titration des onkolytischen Herpes-Simplex-Virus

Oncolytic viruses (OVs), such as&#160;the&#160;oncolytic herpes simplex virus (oHSV), are a rapidly growing treatment strategy in the field of cancer ...

Das onkolytische Herpes-simplex-Virus ist eine emergente Form der Krebsimmuntherapie. Ein effizientes System der Virusvermehrung, -reinigung und -bestimmung ist entscheidend für den Einsatz in experimentellen Studien. Diese Methode ist sehr einfach und kann leicht in jedem Labor der Biosicherheitsstufe zwei eingesetzt werden, um einen qualitativ hochwertigen Virusbestand für präklinische Studien zu erhalten.Die Produktion eines hochwertigen, reinen Virusbestands ist von entscheidender Bedeutung, da er zur Untersuchung der Immunantwort gegen Krebs und zur Entwicklung einer neuartigen Form der virusbasierten Krebsimmuntherapie verwendet wird. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um jedes Wildtyp- oder gentechnisch veränderte Herpes-simplex-Virus zu reinigen. Dieses Protokoll sollte für eine Person, die diese Technik noch nie zuvor durchgeführt hat, leicht zu lesen und leicht zu befolgen sein.Die aufgeführten Materialien und Reagenzien sollten vorhanden sein, bevor Sie diese Technik zum ersten Mal ausprobieren. Beginnen Sie mit dem Waschen der T-150 Quadratzentimeterkolben mit zweifach hohen Glukose-DPBS, ergänzt mit 1% IFCS. Saugen Sie das DPBS an und fügen Sie sieben Milliliter Virusinokum pro Kolben hinzu.Die Kolben fünf Minuten lang vorsichtig schaukeln und bei 37 Grad Celsius 1,5 bis 2 Stunden inkubieren. Entfernen Sie dann das Inokum und fügen Sie jedem Kolben 25 Milliliter DMEM hinzu, ergänzt mit 1% IFCS. Nach der Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für zwei bis vier Tage 20 Milliliter des Kulturüberstandes aus jedem Kolben in 50 Milliliter Zentrifugenröhrchen sammeln.Kratzen Sie die Zellen mit einem Zellschaber vom Boden der Kolben ab. Geben Sie etwa 15 Milliliter des zuvor gesammelten Kulturüberstands in jeden Kolben, um das Volumen auf 20 Milliliter zu erhöhen, und verwenden Sie dann eine sterile serologische Pipette von 10 Millilitern, um den Boden der Kolben einige Male vorsichtig zu waschen. Sammeln Sie die Zellen mit Medium in 50 Milliliter konische Zentrifugenröhrchen, die auf Eis gelegt werden.Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie jedes Pellet gründlich in 1,25 Milliliter Viruspuffer oder VB und 1,25 Milliliter zuvor gesammelter Kulturüberstand. Mischen Sie alle resuspendierten Pellets in einem 50 Milliliter konischen Zentrifugenröhrchen.Schnappen Sie die resuspendierten Zellen mit Trockeneis und 100% Ethanol ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Die zuvor geschnappten gefrorenen Zellen in einem warmen Wasserbad bei 37 Grad Celsius auftauen und eine Minute lang für drei Zyklen in einem Wasserbad beschallen. Fügen Sie 175 Einheiten Benzonase-Nuklease und zwei Mikroliter von zwei millimolarem Magnesiumchlorid pro Milliliter Zelllysat und Wirbel hinzu.Nach einer Inkubation von 30 Minuten und einem warmen Wasserbad bei 37 Grad Celsius den Schlauch auf Eis legen. Drehen Sie das Zelllysat bei 300 mal G für 10 Minuten. Sammeln Sie den Überstand in einem neuen 50 Milliliter konischen Zentrifugenröhrchen und resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 Mikrolitern VB. Bezeichnen Sie es als Pellet eins.Drehen Sie den gesammelten Überstand erneut bei 500 mal G für 10 Minuten und lagern Sie den Überstand separat in einem frischen 50 Milliliter konischen Zentrifugenröhrchen, um es später zu verwenden. Resuspend das Zellpellet in 500 Mikroliter VB und bezeichnen Sie es als Pellet zwei. Kombinieren Sie das resuspendierte Pellet eins und Pellet zwei in einem neuen 1,75 Milliliter Zentrifugenrohr und Wirbel und beschallen Sie zweimal in einem Wasserbad, bevor Sie die Röhrchen bei 400 mal G für 10 Minuten drehen.Sammeln Sie den Überstand aus dem 1,7-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und kombinieren Sie ihn mit dem zuvor gesammelten 50-Milliliter-Kegelzentrifugenröhrchen. Filtern Sie den Überstand durch einen sterilen fünf Mikrometer großen PVDF-Membranfilter in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenrohr namens Tube One. Fügen Sie einen Milliliter VB in das 50-Milliliter-Zentrifugenrohr hinzu, das nach dem Filtern des Überstands aus dem vorherigen Schritt, Dem Wirbel, entleert wurde, und führen Sie es durch den gleichen PVDF-Membranfilter, der auf Rohr eins platziert ist.Leiten Sie das Filtrat von Rohr eins durch einen sterilen 0,8 Mikrometer MCE-Membranfilter, der auf einem neuen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen namens Rohr zwei platziert ist. Fügen Sie einen Milliliter VB in das entleerte Rohr eins, Wirbel, hinzu und führen Sie es durch den gleichen MCE-Filter, der auf Rohr zwei platziert ist. Leiten Sie das Filtrat von Rohr zwei durch einen sterilen 0,45-Mikrometer-PVDF-Filter, der auf einem neuen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung Rohr drei platziert ist.Wie bereits beschrieben, wiederholen Sie das Waschen von Rohr zwei mit einem Milliliter VB, um Filtrat zu Rohr drei hinzuzufügen. In dieser repräsentativen Analyse konnte der zytopathische Effekt in Vero-Zellen 36, 48 und 72 Stunden nach der oHSV-Infektion mit der Rundung der betroffenen Zellen beobachtet werden. Das im Laufe der Zeit zunehmende CPE-Niveau ist offensichtlich, wie durch den mCherry-Ausdruck visualisiert.72 Stunden nach der Infektion wurden virale Plaques mit X-gal gefärbt, um oHSVs mit lacZ-Expression zu visualisieren. Das sanfte Abwaschen von virusinfizierten Zellen und das sanfte Waschen des Bodens auf dem Kolben ist entscheidend, um alle HSV-infizierten Zellen intakt zu halten, damit ein virusreicher Bestand mit hohem Titergehalt erhalten werden kann.

growth-purification-and-titration-of-oncolytic-herpes-simplex-virus

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Eine schnelle, einfache und kostengünstige Protokoll für die Erzeugung von Spender-derived multivirus-spezifische CTLs (RCTL) zur Infusion einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) Empfänger die Gefahr der Entwicklung CMV, Adv. oder EBV-Infektionen. Dieses Herstellungsverfahren ist GMP-konform und sollte die breitere Umsetzung von T-Zell-Immuntherapie über spezialisierte Zentren zu gewährleisten.

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Onkolytischen Viren sind für Krebstherapeutika vielversprechend. Die Fähigkeit, die infectability von Live-Gewebeproben von Patienten vor der Behandlung erhalten zu ermitteln ist ein einzigartiger Vorteil dieses therapeutischen Ansatzes. Dieses Protokoll beschreibt, wie das Gewebe für die...

Ex-vivo-Infektion von lebendem Gewebe mit onkolytischen Viren

Wir beschreiben ein Protokoll zu den wichtigsten Aufgaben der Host Signalmoleküle in lytische Replikation eines Modells Herpesvirus, gamma Herpesvirus 68 (γHV68) zu identifizieren. Mit Hilfe genetisch veränderter Mauslinien und embryonale Fibroblasten zur γHV68 lytische Replikation, erlaubt das Protokoll sowohl phänotypische Charakterisierung und molekulare Vernehmung von Virus-Wirt-Interaktionen in lytischen Replikation.

Sezieren Host-Virus-Interaktion in Lytic Replikation von einem Modell Herpesvirus

Das Protokoll beschreibt eine effiziente und reproduzierbare Modellsystem zur Untersuchung Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) Latenz und Reaktivierung. Der Test verwendet homogene sympathischen Neuronen Kulturen und ermöglicht die molekulare Analyse der Virus-Neuron-Wechselwirkungen unter Verwendung einer Vielzahl von Anwendungen, wie RNA-Interferenz und Expression von rekombinanten Proteinen.

Eine primäre Neuron Culture System zur Erforschung des Herpes Simplex Virus Latenz und Reaktivierung

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Propagation and Harvesting of Oncolytic Herpes Simplex Virus in Mammalian Cells

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the purification of an oncolytic virus from infected mammalian cell cultures using nuclease treatment, sequential centrifugation, membrane filtration, and sucrose cushion centrifugation.

 Oncolytic Virus Purification from Infected Mammalian Cells 

Hier beschreiben wir ein Protokoll für den Einsatz von Hochdurchsatz-Screening der RNAi Host Ziele aufzudecken, die manipuliert werden können, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern, speziell Rhabodvirus und Vaccinia-Virus-Therapie, aber es kann leicht an andere onkolytische angepasst werden Virus-Plattformen oder für die Entdeckung von Host-Gene, die Replikation des Virus in der Regel zu modulieren.

Genomweiten RNAi-Screening, Host Faktoren zu identifizieren, die onkolytische Viren Therapie zu modulieren

Dieses Protokoll beschreibt einen detaillierten Workflow für die Generierung und ex-Vivo Charakterisierung von onkolytische Viren für den Ausdruck von Immunmodulatoren, Masern-Viren Codierung bispezifische T Zelle Engagers als Beispiel verwenden. Anwendung und Anpassung an andere Vektor-Plattformen und transgene beschleunigt die Entwicklung von neuartigen Immunovirotherapeutics für klinische Übersetzung.

Paramyxoviruses für Tumor-gezielte Immunmodulation: Gestaltung und Evaluation Ex Vivo

Plaquing ist eine Routinemethode zur Quantifizierung lebender Viren in einer Population. Obwohl Plaquing häufig in verschiedenen mikrobiologischen Lehrplänen mit Bakterien und Bakteriophagen gelehrt wird, ist das Plaquieren von Säugetierviren komplexer und zeitaufwendiger. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren, die für die regelmäßige Arbeit mit Herpes-simplex-Viren zuverlässig funktionieren.

Plaquierung von Herpes-simplex-Viren

Dieses Protokoll beschreibt ein in vitro System zur Modellierung der de novo lytischen Infektion des Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus unter Verwendung von BAC16-abgeleiteten Virionen. Die Methode ermöglicht die Untersuchung der frühen Virusreplikation und -verbreitung. Die Produktion infektiöser Viren wird durch GFP-basierte Assays für infektiöse Einheiten und Echtzeit-PCR von verkapselten Virusgenomen quantifiziert.

Etablierung und Quantifizierung der de novo lytischen Infektion durch zellfreies Kaposi-Sarkom-assoziiertes Herpesvirus

Lernen Sie die Kultivierung, Reinigung und Titration des onkolytischen Herpes-Simplex-Virus für präklinische Studien. Diese Methode ermöglicht die Herstellung hochwertiger Virusstämme in Biosicherheitsstufe 2 Laboratorien.

Wachstum, Reinigung und Titration des onkolytischen Herpes-Simplex-Virus

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