Name: Polysomenprofilierung ohne Gradientenerzeuger oder Fraktionierungssysteme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Lernen Sie die Polysomenprofilierung ohne automatisierte Fraktionierungssysteme. Diese Methode ermöglicht die Analyse ribosomaler Aktivität in Saccharomyces cerevisiae durch manuelle Sukrosegradienten-Präparation.

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Die Autoren danken Dr. Percy Tumbale und Dr. Melissa Wells für ihre kritische Lektüre dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom US National Institute of Health Intramural Research Program unterstützt; Das US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS; ZIA ES103247 bis R.E.S).

1. Herstellung von 7% - 47% Saccharosegradienten
HINWEIS: Der lineare Bereich des Saccharosegradienten kann je nach verwendetem Zelltyp modifiziert werden, um eine bessere Trennung zu erreichen. Dieses Protokoll ist für Polysomenprofile für S. cerevisiae optimiert.
<ol><li>Stammlösungen von 7% und 47% Saccharose in Saccharosegradientenpuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mMMgCl2 und 1 mM DTT) herzustellen. Filter sterilisieren die Saccharose-Stammlösungen durch einen 0,22 μm Filter und lagern bei 4 °C.</li>
	<li>Bereiten Sie 14 ml 17%, 27% und 37% Saccharoselösungen durch Dosieren und Mischen der 7%igen und 47%igen Saccharose-Stammlösungen in der in Tabelle 1 beschriebenen Weise her.</li>
	<li>Legen Sie sechs Polypropylen-Zentrifugenröhrchen (14 x 89 mm) in ein Vollsicht-Reagenzglas-Rack. Sorgen Sie für genügend Platz zwischen den Rohren, damit Aktionen mit einem Schlauch die anderen nicht stören.</li>
	<li>Befestigen Sie eine lange Nadel an einer 3-ml-Spritze. Verwenden Sie für dieses Protokoll eine 9-Zoll-Nadel mit 22 G und einer stumpfen Spitze (Abbildung 1), aber jede Nadel, die lang genug ist, um den Boden des Zentrifugenröhrchens zu erreichen, reicht aus. HINWEIS: Führen Sie eine Testfüllung und Dispensation durch, um sicherzustellen, dass die Spritze die Saccharoselösung ohne Tropfen halten kann, bevor Sie die Farbverläufe einrichten.</li>
	<li>Geben Sie 2 ml der 7% igen Saccharose auf den Boden jedes Zentrifugenröhrchens.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml der 17% igen Saccharose unter die 7% ige Lösung hinzu, indem Sie die Nadelspitze in unmittelbarer Nähe des Röhrchenbodens positionieren und die Lösung langsam und vorsichtig dosieren.</li>
	<li>Wiederholen Sie dies mit je 2 ml der 27%, 37% und 47% igen Saccharoselösungen. Stellen Sie sicher, dass jede Schicht durch eine Linie voneinander unterscheidbar ist, die den Abstand der Dichten markiert (Abbildung 2). HINWEIS: Wenn die Gradienten nicht innerhalb von 48 Stunden verwendet werden, frieren Sie die Röhrchen zu diesem Zeitpunkt vor ihrer Setzung in einen kontinuierlichen Gradienten mit geschichteten Saccharoselösungen in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie in einem -80 ° C Gefrierschrank für die Langzeitlagerung.</li>
	<li>Lagern Sie die Steigungen über Nacht bei 4 °C, damit sich die Steigungen zu einem kontinuierlichen, steigenden Saccharoseanteil absetzen können. Es dauert 8-12 Stunden, bis sich die geschichteten Saccharoselösungen zu einem linearen Saccharosegradienten absetzen. Lineare Gradienten sind bis zu 48 h stabil. Die Lagerung über Nacht bei 4 °C bietet ausreichend Zeit zum Auftauen und Absetzen in einem linearen Gradienten für die Verwendung von gefrorenen, geschichteten Saccharoselösungen. Verwenden Sie ein Densitometer, um die Gradientenqualität zu beurteilen. HINWEIS: Es ist wichtig, die Gradienten an einem stabilen Ort zu lagern, an dem sie nicht gestört werden, da Bewegungen oder Vibrationen den Gradienten stören.</li>
</ol>2. Herstellung von Hefezellextrakten
<ol><li>Impfen Sie den interessierenden Hefestamm in 50 ml Hefeextrakt-Peptondextrose-Medien (YPD) und wachsen Sie über Nacht bei 30 ° C in einem Schüttelinkubator in die stationäre Phase. HINWEIS: Die Temperatur kann je nach Hefestammanforderungen variieren.</li>
	<li>10 mL stationäre Phasenkultur in 1 L frisches YPD-Medium überführen. Inkubieren Sie die Zellen mit kräftigem Schütteln bei 30 °C (oder einer anderen geeigneten Temperatur), bis die Kultur die mittlere exponentielle Wachstumsphase erreicht (OD600 = 0,4-0,6).</li>
	<li>In der mittleren exponentiellen Wachstumsphase wird der Kultur Cycloheximid in einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml zugesetzt. Auf Eis 5 min inkubieren.</li>
	<li>Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 10 min bei 4 °C. HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können Zellen eingefroren und bei -80 °C gelagert werden.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in gekühltem 700 μL Polysomenextraktionspuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 0,1 mg/ml Cycloheximid, 0,2 mg/ml Heparin). Fügen Sie 100 Einheiten RNase Inhibitor hinzu und geben Sie es in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Fügen Sie ~400 μL vorgekühlte Glasperlen mit einem Größenbereich von 425-600 μm in das Zentrifugenröhrchen hinzu. Die Hefezellen durch kräftiges Rühren in einem Perlenschläger für 5 min aufbrechen.</li>
	<li>Das Lysat wird durch Zentrifugieren bei 8.000 x g für 5 min bei 4 °C geklärt.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Konzentration der RNA im geklärten Lysat, indem Sie die Absorption bei 260 nm mit einem Spektralphotometer oder mit einem fluoreszenzbasierten RNA-Detektionssystem messen. HINWEIS: Für sehr genaue RNA-Konzentrationsmessungen verwenden Sie fluoreszenzbasierte RNA-Detektionskits.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die RNA-Konzentration 0,5-1 μg/μL beträgt. Wenn die RNA-Konzentration zu niedrig ist, reduzieren Sie das Volumen des Polysomenextraktionspuffers, der zur Resuspendierung der Zellen in zukünftigen Experimenten verwendet wird. HINWEIS: Laden Sie das Lysat unmittelbar nach der Lyse und RNA-Quantifizierung auf die Gradienten. Bei Bedarf die Lysate in flüssigem Stickstoff schockgefrieren und einige Tage bei -80 °C lagern.</li>
</ol>3. Zentrifugation von Gradienten
<ol><li>Laden Sie das Lysat vorsichtig auf die Oberseite der Farbverläufe. Platzieren Sie die Pipettenspitze an der Innenwand an der Oberseite des Polypropylenrohrs. Winkeln Sie das Röhrchen vorsichtig an und dosieren Sie das Lysat langsam auf die Oberseite des Gefälles, indem Sie gegen die Wand tropfen. Achten Sie sehr darauf, den Farbverlauf beim Laden des Lysats nicht zu stören oder zu stören. HINWEIS: Die Menge an geladenem Lysat variiert je nach Zelltyp. Der Inhalt der RNA variiert ebenfalls. Es kann notwendig sein, eine Reihe von Experimenten durchzuführen, um die Menge an Lysat zu bestimmen, die benötigt wird, um ein optimales Polysomenprofil zu erzeugen. Für Hefe sind 300 μg RNA ein guter Ausgangspunkt für die Optimierung.</li>
	<li>Legen Sie die Rohre vorsichtig in die vorgekühlten Eimer eines schwingenden Schaufelrotors. HINWEIS: Jedes Polypropylen-Zentrifugenröhrchen sollte gleiche Gradientenvolumina und die Menge des beladenen Lysats aufweisen. Dies kann von Röhre zu Röhre variieren. Stellen Sie sicher, dass die Variation während der Ultrazentrifugation keinen Unwuchtfehler verursacht.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Gradienten bei 260.110 x g für 150 min bei 4 °C.</li>
</ol>4. Fraktion und Datenerhebung
<ol><li>Nehmen Sie die Zentrifugenröhrchen vorsichtig aus dem schwingenden Schaufelrotor und legen Sie sie in einen Tubenhalter.</li>
	<li>Beschriften Sie die 96-Well-Platten, um die Fraktionen zu lagern und auf Eis vorzukühlen. HINWEIS: Verwenden Sie eine 96-Well-Platte, die für ein Spektralphotometer mit einem optischen Fenster bis hinunter zu 230 nm für Nukleinsäurebestimmungen bei 260 nm/280 nm geeignet ist.</li>
	<li>Sammeln Sie 100 μL oder 200 μL Fraktionen ausgehend von der Oberseite des Gradienten, indem Sie vorsichtig eine Pipettenspitze in die Oberseite des Gradienten einführen. Sammeln Sie Brüche, bis der gesamte Farbverlauf aliquotiert ist. Die Anzahl der Fraktionen hängt vom Gesamtgradientenvolumen ab. HINWEIS: Sammeln Sie die Brüche so, dass der Rest des Farbverlaufs nicht unterbrochen wird. Stellen Sie sicher, dass alle Fraktionen das gleiche Volumen haben. Neben der manuellen Fraktionierung ist eine weitere kostengünstige Methode zur Fraktionierung die Verwendung einer kleinen Schlauchpumpe.</li>
	<li>Übertragen Sie jede Fraktion auf die 96-Well-Platte, um den Boden des Zentrifugenröhrchens zu erreichen. Bewahren Sie die gesammelten Fraktionen immer auf dem Eis auf.</li>
	<li>Messen Sie die Absorption jeder Fraktion bei 254 nm mit einem Spektralphotometer. Verwenden Sie die 7% und 47% Saccharoselösungen als Leerzeichen. HINWEIS: Beachten Sie bei der Messung der Absorption von Fraktionen, dass für die meisten Spektrometer und Kolorimeter der effektivste Absorptionsbereich 0,1-1 beträgt. Wenn die Absorptionsmessungen außerhalb des Bereichs liegen (≥1,0), haben die Fraktionen zu viel Material. Verdünnen Sie die Probe, sammeln Sie die Daten erneut und berücksichtigen Sie dann den Verdünnungsfaktor beim Zeichnen des Profils.</li>
	<li>Erstellen Sie das Polysomenprofil, indem Sie die Fraktionszahl im Vergleich zur Absorption aufzeichnen.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier wurde eine Methode beschrieben, um Polysomenprofile ohne den Einsatz teurer automatisierter Fraktionierungssysteme zu erstellen. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie die Polysomenprofilierung für Labore zugänglich macht, die nicht über automatisierte Fraktionierungssysteme verfügen. Die Hauptnachteile dieses Protokolls sind die langwierige Handfraktionierung und die reduzierte Empfindlichkeit im Vergleich zum dedizierten Dichtefraktionierungssystem.
Dieses Protokoll beinhalt...

Ribosomen sind Mega-Dalton-Ribonukleoproteinkomplexe, die den grundlegenden Prozess der Übersetzung von mRNA in Proteine durchführen. Ribosomen sind für die Synthese aller Proteine innerhalb einer Zelle verantwortlich. Eukaryotische Ribosomen umfassen zwei Untereinheiten, die entsprechend ihren Sedimentationskoeffizienten als kleine ribosomale Untereinheit (40S) und große ribosomale Untereinheit (60S) bezeichnet werden. Das vollständig zusammengesetzte Ribosom wird als 80S-Monosom bezeichnet. Polysomen sind Gruppen von Ribosomen, die an der Übersetzung eines einzelnen mRNA-Moleküls beteiligt sind. Die Polysomenfraktionierung durch Saccharosedichtegradientenzentrifugation ist eine leistungsstarke Methode, um Ribosomenprofile zu erstellen, spezifische mRNAs zu identifizieren, die mit der Translation von Ribosomen assoziiert sind, und Polysomen-assoziierte Faktorenzu analysieren 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Diese Technik wird häufig verwendet, um Polysomen von einzelnen Ribosomen, ribosomalen Untereinheiten und Boten-Ribonukleoproteinpartikeln zu trennen. Die durch Fraktionierung erhaltenen Profile können wertvolle Informationen über die Translationsaktivität der Polysomen14 und den Assemblierungsstatus der Ribosomen15,16,17 liefern.
Ribosomenanordnung ist ein sehr komplexer Prozess, der durch eine Gruppe von Proteinen erleichtert wird, die als Ribosomen-Assemblierungsfaktoren 18,19,20,21 bekannt sind. Diese Faktoren erfüllen eine breite Palette von Funktionen während der Ribosomenbiogenese durch Wechselwirkungen mit vielen anderen Proteinen, einschließlich ATPasen, Endo- und Exonukleasen, GTPasen, RNA-Helikasen und RNA-bindenden Proteinen22. Die Polysomenfraktionierung war ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Rolle dieser Faktoren bei der Ribosomenanordnung zu untersuchen. Zum Beispiel wurde diese Methode verwendet, um zu zeigen, wie Mutationen in der Polynukleotidkinase Grc3, einem prä-rRNA-Verarbeitungsfaktor, den Ribosomenzusammenbauprozess negativ beeinflussen können17,23. Die Polysomenprofilierung hat auch hervorgehoben und gezeigt, dass die konservierten Motive in der ATPase Rix7 für die Ribosomenproduktion16 unerlässlich sind.
Das Verfahren zur Polysomenfraktionierung beginnt mit der Herstellung löslicher Zelllysate aus Zellen von Interesse. Das Lysat enthält RNA, ribosomale Untereinheiten und Polysomen sowie andere lösliche zelluläre Komponenten. In einem Ultrazentrifugenröhrchen wird ein kontinuierlicher, linearer Saccharosegradient erzeugt. Die lösliche Fraktion des Zelllysats wird sanft auf die Oberseite des Saccharosegradientenröhrchens geladen. Das beladene Gradientenrohr wird dann einer Zentrifugation unterzogen, die die zellulären Komponenten innerhalb des Saccharosegradienten durch die Schwerkraft nach Größe trennt. Die größeren Komponenten fahren weiter in den Gradienten hinein als die kleineren Komponenten. Die Oberseite des Gradienten beherbergt die kleineren, langsamer reisenden Zellkomponenten, während sich die größeren, schneller reisenden Zellkomponenten unten befinden. Nach der Zentrifugation wird der Inhalt des Röhrchens als Fraktionen gesammelt. Diese Methode trennt effektiv ribosomale Untereinheiten, Monosomen und Polysomen. Die optische Dichte jeder Fraktion wird dann durch Messung der spektralen Absorption bei einer Wellenlänge von 254 nm bestimmt. Die Darstellung von Absorption vs. Fraktionszahl ergibt ein Polysomenprofil.
Lineare Saccharosedichtegradienten können mit einem Gradientenmacher erzeugt werden. Nach der Zentrifugation werden die Gradienten oft fraktioniert und die Absorptionen mit einem automatisierten Dichtefraktionierungssystem 3,7,13,24,25 gemessen. Während diese Systeme sehr gut funktionieren, um Polysomenprofile herzustellen, sind sie teuer und können für einige Labore unerschwinglich sein. Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung von Polysomenprofilen ohne den Einsatz dieser Instrumente vorgestellt. Stattdessen verwendet dieses Protokoll Geräte, die normalerweise in den meisten molekularbiologischen Laboratorien verfügbar sind.

<table><tbody><tr><td>Automatischer Fraktionator</td><td>Brandel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clariostar Multimode Plate Reader</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td></td></tr><tr><td>Glasperlen, säuregewaschen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772</td><td>425&ndash; 600 μm m</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid, 1 M</td><td>KD Medical</td><td>CAC-5290</td><td></td></tr><tr><td>Nadel, 22 g, Metallnabe</td><td>Hamilton Company</td><td>7748-08</td><td>benutzerdefinierte Länge 9 Zoll, Punktausführung 3</td></tr><tr><td>Optima XL-100K Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen Zentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen Reagenzglas Peg Rack</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-810-54A</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33228</td><td></td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32855</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Inhibitor</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>N8080119</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Schwingschaufelrotor Pkg</td><td>Beckman Schar</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>Spritze, 3 mL</td><td>Coviden</td><td>888151394</td><td></td></tr><tr><td>Tris, 1 M, pH 7,4</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3340</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>UV-Star Mikrotiterplatte, 96 Vertiefungen</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td>655801</tr></tbody></table>

polysomenprofilierung ohne gradientenerzeuger oder fraktionierungssysteme

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Die Polysomenfraktionierung durch Saccharosedichtegradientenzentrifugation ist ein leistungsfähiges Werkzeug, mit dem Ribosomenprofile erstellt, spezifische mRNAs identifiziert werden können, die von Ribosomen übersetzt werden, und Polysomen-assoziierte Faktoren analysiert werden können. Während automatisierte Gradientenhersteller und Gradientenfraktionierungssysteme häufig mit dieser Technik verwendet werden, sind diese Systeme im Allgemeinen teuer und können für Laboratorien, die über begrenzte Ressourcen verfügen oder die Kosten aufgrund ihrer seltenen oder gelegentlichen Notwendigkeit, diese Methode für ihre Forschung durchzuführen, unerschwinglich sein. Hier wird ein Protokoll zur reproduzierbaren Erzeugung von Polysomenprofilen mit Standardgeräten vorgestellt, die in den meisten molekularbiologischen Laboratorien ohne spezielle Fraktionierungsinstrumente verfügbar sind. Darüber hinaus wird ein Vergleich von Polysomenprofilen bereitgestellt, die mit und ohne Gradientenfraktionierungssystem erzeugt wurden. Strategien zur Optimierung und Herstellung reproduzierbarer Polysomenprofile werden diskutiert. Saccharomyces cerevisiae wird in diesem Protokoll als Modellorganismus verwendet. Dieses Protokoll kann jedoch leicht modifiziert und angepasst werden, um Ribosomenprofile für viele verschiedene Organismen und Zelltypen zu erstellen.

In Abbildung 3 sind drei repräsentative Polysomenprofile dargestellt. Alle Profile stammen vom gleichen Hefestamm. Ein typisches Polysomenprofil hat gut aufgelöste Peaks für die ribosomalen Untereinheiten 40S, 60S und 80S sowie Polysomen. Der Kamm jeder ribosomalen Untereinheit und jedes Polysomenpeaks ist auf jedem Profil sichtbar (Abbildung 3). Ein repräsentatives Profil eines automatisierten Dichtefraktionierungssystems ist in Abbildung 3...

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein Polysomenprofil generiert wird, ohne automatisierte Gradientenerzeuger oder Gradientenfraktionierungssysteme zu verwenden.

Polysomenprofilierung ohne Gradientenerzeuger oder Fraktionierungssysteme

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Dieses Protokoll beschreibt, wie man ein Polysomenprofil erzeugt, das molekulare Details über die Aktivität von Ribosomen in der Zelle enthüllt. Diese Technik ermöglicht es Benutzern, die wertvollen Informationen eines Polysomenprofils zu erhalten, die keinen Zugang zu automatisierten Gradientenfraktionierungssystemen haben. Nehmen Sie sich Zeit für die Vorbereitung der Farbverläufe und lagern Sie die Farbverläufe an einem Ort, an dem sie nicht durch einen Kompressor oder andere mechanische Vorgänge unterbrochen werden, wenn sie sich in einem linearen Farbverlauf absetzen.Um zu beginnen, bereiten Sie Stammlösungen von 7 und 47% Saccharose in Saccharosegradientenpuffer vor. Filter sterilisieren die Saccharose-Stammlösungen durch einen 0,22-Mikron-Filter. Bereiten Sie 14 Milliliter 17, 27 und 37% Saccharoselösungen durch Dosieren und Mischen der 7- und 47%-Stammlösungen vor.Legen Sie sechs Polypropylen-Zentrifugenröhrchen in ein Reagenzglas-Rack. Stellen Sie sicher, dass genügend Platz zwischen den Röhren vorhanden ist, damit die Aktionen mit einem Rohr die anderen nicht stören. Befestigen Sie eine neun Zoll, 22 Gauge Nadel mit einer stumpfen Spitze an einer Drei-Milliliter-Spritze und führen Sie eine Testfüllung durch und dosieren Sie, um sicherzustellen, dass die Spritze die Saccharoselösung ohne Tropfen halten kann, bevor Sie die Farbverläufe einrichten.Fügen Sie zwei Milliliter der 7% igen Saccharose auf den Boden jedes Zentrifugenröhrchens hinzu. Dann fügen Sie zwei Milliliter der 17% igen Saccharose unter die 7% ige Lösung hinzu, indem Sie die Nadelspitze in unmittelbarer Nähe des Röhrchenbodens positionieren. Geben Sie die Lösung vorsichtig und langsam ab.Wiederholen Sie den Vorgang mit je zwei Milliliter der 27-, 37- und 47%igen Saccharoselösung, wobei sichergestellt wird, dass jede Schicht durch eine Linie unterscheidbar ist, die den Abstand der Dichten markiert. Lagern Sie die Steigungen über Nacht bei vier Grad Celsius, damit sie sich zu einem kontinuierlichen, steigenden Saccharoseanteil absetzen können. Nach dem Wachstum und der Ernte von Hefe, Saccharomyces cerevisiae Zellen, resuspendieren die Zellen in gekühlten 700 Mikrolitern Polysomenextraktionspuffer.Fügen Sie 100 Einheiten RNAse Inhibitor hinzu. Fügen Sie dann 400 Mikroliter vorgekühlte Glasperlen mit einer ungefähren Größe von 425 bis 600 Mikron hinzu. Die Mischung wird mit den Glasperlen in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gegeben und die Hefezellen durch kräftiges Rühren in einem Perlenschläger fünf Minuten lang aufgebrochen.Nach dem Aufbrechen der Zellen klären Sie das Lysat durch Zentrifugieren. Bestimmung der Konzentration der RNA im geklärten Lysat durch Messung der Absorption bei 260 Nanometern mit einem fluoreszenzbasierten RNA-Detektionssystem. Stellen Sie sicher, dass die RNA-Konzentration 0,5 bis ein Mikrogramm pro Mikroliter beträgt.Wenn die RNA-Konzentration zu niedrig ist, reduzieren Sie das Volumen des Extraktionspuffers, der zur Resuspendierung der Zellen verwendet wird. Laden Sie das Lysat vorsichtig auf die Oberseite der Farbverläufe. Legen Sie die Pipettenspitze gegen die Innenwand an der Oberseite des Polypropylenrohrs.Winkeln Sie das Röhrchen und geben Sie das Lysat langsam auf die Oberseite des Farbverlaufs und tropfen Sie gegen die Wand. Legen Sie die Röhrchen vorsichtig in die vorgekühlten Eimer eines schwingenden Schaufelrotors und zentrifugieren Sie die Farbverläufe. Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren vorsichtig die Zentrifugenröhrchen aus dem schwingenden Schaufelrotor und legen Sie sie in einen Tubenhalter.Beschriften Sie die 96-Well-Platten, um die Fraktionen zu lagern und auf Eis vorzukühlen. Sammeln Sie 100 oder 200 Mikroliter Fraktionen beginnend von der Oberseite des Gradienten, indem Sie vorsichtig eine Pipettenspitze in die Oberseite des Gradienten einführen und die Brüche sammeln, bis der gesamte Gradient aliquotiert ist. Messen Sie die Absorption jeder Fraktion bei 254 Nanometern mit einem Spektralphotometer gegen die 7- und 47%Saccharoselösungen als Blindlinge.Erstellen Sie das Polysomenprofil, indem Sie die Fraktionszahl im Vergleich zur Absorption aufzeichnen. Drei repräsentative Polysomenprofile aus Hefe S.Cerevisiae werden gezeigt. Der Kamm jeder ribosomalen Untereinheit und jedes Polysomenpeaks ist auf jedem Profil sichtbar.Ein repräsentatives Profil aus einem automatisierten Dichtefraktionierungssystem wird hier gezeigt. Dieses Profil wurde aus einem kontinuierlichen Absorptionsprofil hergestellt, als der Saccharosegradient von unten nach oben durch eine Chase-Lösung durch eine Detektor-Durchflusszelle verschoben und in Fraktionen gesammelt wurde. Das Polysomenprofil, das durch Handfraktionierung von 200- und 100-Mikroliter-Proben erzeugt wird, ist hier dargestellt.Das Wichtigste, woran Sie sich bei diesem Verfahren erinnern sollten, ist, die Farbverläufe nicht zu unterbrechen. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen oder den Gradienten zu stören, indem Sie die Lösung zu schnell dosieren. Nach diesem Verfahren kann RNA aus den Gradienten extrahiert werden, um weitere Analysen durchzuführen, um mRNAs zu bestimmen, die mit aktiven Ribosomen assoziiert sind

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Extraktion des Übersetzens Ribosomen aus eukaryotischen Zellen. Sobald extrahiert, Ribosomen in monosomes und Polyribosomen durch Saccharose-Gradienten Fraktionierung getrennt, um verschiedene ribosomale Populationen analysiert werden. Als solche ist diese Methode der Goldstandard für die Untersuchung der Regulation der Translation.

Eukaryotische Polyribosome Profile Analysis

Hier beschreiben wir ein Verfahren, um Veränderungen in der mRNA-Translationsinitiation eukaryontischer Zellen in Reaktion auf Stress-Bedingungen zu untersuchen. Dieses Verfahren basiert auf der Geschwindigkeit Trennung auf Saccharosegradienten übersetzen Ribosomen nicht übersetzen Ribosomen basiert.

Analyse der Translation Initiation Während Stress-Bedingungen durch Polysomprofile Profiling

Dieses Protokoll stellt wesentliche Änderungen Polyribosom Fraktionierung, um die translatome von in vivo ZNS-Proben zu untersuchen. Es ermöglicht umfassende Beurteilung der Übersetzung und der Transkriptionsregulation durch die Isolierung und der Vergleich der Gesamt-RNA gebunden Ribosomen-RNA-Fraktionen.

In-vivo-Abfrage des Zentralen Nervensystems durch Translatome Polyribosom Fraktionierung

Ribosomen spielen eine zentrale Rolle bei der Proteinsynthese. Polyribosom (Polysomen) Fraktionierung durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation ermöglicht die direkte Bestimmung der Übersetzung Effizienz einzelner mRNAs auf einem genomweiten Maßstab. Darüber hinaus kann dieses Verfahren für die biochemische Analyse von Ribosomen und Polysomen-assoziierten Faktoren wie Chaperone und Signalmolekülen verwendet werden.

Polysomprofile Fraktionierung und Analyse von Säuger Translatomes auf einer Genom-weite Skala

Die Fähigkeit der Zellen, sich an Stress anzupassen, ist entscheidend für ihr Überleben. Die Regulation der mRNA-Translation ist eine solche Anpassungsstrategie, die eine schnelle Regulation des Proteoms ermöglicht. Hier stellen wir ein standardisiertes Polysomen-Profiling-Protokoll zur Verfügung, um spezifische mRNAs zu identifizieren, die unter Stressbedingungen selektiv translatiert werden.

Bewertung der Selective mRNA Translation in Säugerzellen durch Polysomen Profilieren

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Extraktion und Fraktionierung von Transkripten aus pflanzlichem Gewebe auf der Grundlage der Anzahl der gebundenen Ribosomen. Es ermöglicht eine globale Abschätzung der Translationsaktivität und die Bestimmung des Translationsstatus spezifischer mRNAs.

Eine einfache Methode für Pflanzen Polysomen Profilieren

Translational Regelung spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle von Protein Fülle. Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Methode zur quantitativen Analyse der Übersetzung in der angehenden Hefe Saccharomyces Cerevisiae.

Genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung

Das übergeordnete Ziel der Polysome Profilerstellung Technik ist Analyse der übersetzerischen Tätigkeit der einzelnen mRNAs oder Transkriptom mRNAs während der Proteinsynthese. Die Methode ist für Studien von Protein-Synthese-Verordnung, Übersetzung Aktivierung und Repression in Gesundheit und mehrere menschliche Krankheiten wichtig.

Polysome Profilerstellung in Leishmaniose, menschliche Zellen und Maus Hoden

Die Entwicklung des Säugetiergehirns erfordert eine ordnungsgemäße Kontrolle der Genexpression auf der Ebene der Translation. Hier beschreiben wir ein Polysomen-Profiling-System mit einer einfach zu montierenden Sucrose-Gradientenerstellungs- und Fraktionierungsplattform, um den Translationsstatus von mRNAs im sich entwickelnden Gehirn zu bewerten.

Analyse der Übersetzung im sich entwickelnden Mausgehirn mit Polysome Profiling

Wir stellen eine Technik zur schnellen Stabilisierung translationaler (Proteinbiosynthese) Komplexe mit Formaldehydvernetzung in lebenden Hefe- und Säugetierzellen vor. Der Ansatz ermöglicht die Sezierung transienter Zwischenprodukte und dynamischer RNA:Protein-Interaktionen. Die vernetzten Komplexe können in mehreren nachgelagerten Anwendungen eingesetzt werden, z. B. in Deep-Sequencing-basierten Profilierungsmethoden, Mikroskopie und Massenspektrometrie.

Schnelle In-vivo-Fixierung und Isolierung translationaler Komplexe aus eukaryotischen Zellen

Das hier vorgestellte Protokoll beinhaltet polysomales Profiling zur Isolierung von Translatomen, mRNAs, die mit Ribosomen assoziiert sind, in nicht-polysomale und polysomale RNAs aus Arabidopsis durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation. Diese Methode demonstriert die Translationseffizienz von hitzegestresstem Arabidopsis.

Translationseffizienztest mit Polysomenprofilen unter Hitzebelastung

Lernen Sie die Polysomenprofilierung ohne automatisierte Fraktionierungssysteme. Diese Methode ermöglicht die Analyse ribosomaler Aktivität in Saccharomyces cerevisiae durch manuelle Sukrosegradienten-Präparation.

Polysomenprofilierung ohne Gradientenerzeuger oder Fraktionierungssysteme

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