Kernmigration in der Drosophila-Eizelle
13. Mai 2021
Bei Drosophiladurchläuft der Eizellkern während der Oogenese eine mikrotubuliabhängige Migration. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das entwickelt wurde, um die Migration durch Live-Bildgebung an Eierkammern ex-vivozu verfolgen. Unser Verfahren hält Eierkammern für 12 Stunden am Leben, um multipositionale 3D-Zeitrafferfilme mit konfokaler Spinning-Disk-Mikroskopie zu erfassen.
Diese Technik ermöglicht es, lange biologische Prozesse in sezierten Drosophila-Eizellenkammern, wie z.B. die Eizellkernmigration, mittels Live-Imaging-Mikroskopie zu beobachten. Dieses Protokoll beschreibt, wie die sezierten Eierkammern 12 Stunden lang am Leben erhalten werden, um Live-Imaging-Mikroskopie durchzuführen. Zu Beginn 200 Mikroliter Schneider Medium pipetten und mit 30 Mikrolitern von 10 Milligramm pro Milliliter Insulin ergänzen, dann fügen Sie vier Mikroliter wärmeinaktiviertes fetales Kalbserum hinzu.
Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um eine kleine Menge Silikonfett um das Loch auf der Unterseite des punktierten Schlittens aufzutragen. Positionieren Sie einen Abdeckrlip und verwenden Sie das breite Ende einer Pipettenspitze, um Druck auf den Coverlip auszuüben, um das Silikonfett abzuflachen, um einen Silikonring im Inneren des Objektträgers zu erzeugen. Die betäubten weiblichen Fliegen werden in den Sezierbrunnen mit 150 Mikrolitern des Bildmediums überführen.
Um das Weibchen zu sezieren, verwenden Sie die Zange, um den Thorax zu greifen und die dorsale Bauchkutikula mit einem zweiten Paar Zangen zu kneifen. Entfernen Sie vorsichtig die Gebärmutter, den Eileiter und die Muskelscheide. Isolieren und lösen Sie das Paar Eierstöcke, die an der Nagelhautöffnung sichtbar sind.
Legen Sie einen Tropfen von 10 bis 15 Mikrolitern des Bildgebungsmediums auf die Eierstöcke und übertragen Sie einen Eierstock in die Bildgebungskammer. Um die Ovariolen zu trennen, verwenden Sie die Nadel, um das hintere Ende des Eierstocks zu halten. Verwenden Sie eine andere Nadel, um das Keimarium vorsichtig zu ziehen, um die Ovariolen auseinander zu necken.
Halten Sie die Scheide mit einer Nadel und ziehen Sie die Ovariole mit einer anderen Nadel durch die größeren Kammern, um die verbleibende Muskelscheide an den Eierkammern zu entfernen. Lassen Sie die ungehüllte Ovariole sinken und kontaktieren Sie den Abdeckungsrutsch. Entfernen Sie die späten Stadien und den Rest der Eierstöcke mit einer Zette aus dem Mikrokammer.
Verwenden Sie Nadeln, um die Eierstöcke vorsichtig zu entfernen, um die Erfassung zu erleichtern. Schneiden Sie ein kleines 10 x 10 Millimeter großes Quadrat der durchlässigen Membran. Tragen Sie die Membran vorsichtig auf die Oberseite des Bildmediums auf, um Luftblasen auszustoßen.
Dann verschließen Sie die Kammer hermetisch mit einer dünnen Schicht Halogenkohlenstofföl um den Brunnen auf der Kontur der Membran. Legen Sie das Bildgebungssetup auf den Objektträgerhalter des invertierten Mikroskops und verwenden Sie ein 40-faches Objektiv. Die Migration des Eizellkerns einer Wildtyp-Eizelle wurde mittels Live-Imaging-Mikroskopie erfasst.
Der Kern erreicht entweder die vordere Plasmamembran oder die laterale Plasmamembran, bevor er entlang der Trajektorien gleitet, um seine endgültige Position am Schnittpunkt der beiden Plasmamembranen zu erreichen. Membrandeformitäten, unorganisierte Follikelzellen, verkümmerte Zellen und geschrumpfte Kerne sind die ersten Anzeichen für absterbende Eierkammern. Die degenerierte Eizelle vor acht Stunden Bildgebung wird normalerweise nicht nachgewiesen.
Seltene Fälle einer frühen Degeneration sind jedoch auf Probleme bei der Dissektion oder montage zurückzuführen. Die Beschädigung der Eierkammern beeinträchtigt ihr Überleben. Daher stehen eine filigrane handgenaue Dissektion und Vorbereitung der Mikrokammer im Vordergrund.
Dieses Verfahren ermöglichte es uns zu visualisieren, dass der Eizellkern während seiner Migration drei verschiedene Bahnen nehmen kann und verschiedene Organellen diese Trajektorien innerhalb der Eizelle regulieren.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Beobachtung der Oocyten-Kernmigration in Drosophila mittels Live-Bildgebungsmikroskopie. Die Technik ermöglicht die Aufrechterhaltung dissektierter Eikammern für 12 Stunden und erlaubt so die Aufnahme mehrerer 3D-Zeitrafferfilme aus verschiedenen Positionen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Entwicklungsbiologie
Hintergrund
- Drosophila dient als Modellorganismus zur Untersuchung der Oogenese.
- Die Mikrotubuli-abhängige Migration ist entscheidend für die Oozytenentwicklung.
- Methoden der Live-Bildgebung vertiefen das Verständnis dynamischer zellulärer Prozesse.
- Die Aufrechterhaltung der Vitalität von Eikammern ist für die Langzeit-Bildgebung unerlässlich.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Live-Bildgebung der Oocyten-Kernmigration.
- Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit von Eikammern über längere Zeiträume während der Beobachtung.
- Anwendung der Spinning-Disk-Konfokalmikroskopie für detaillierte Bildgebung.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Schneider-Medium, ergänzt mit Insulin und Fetal-Kalbs-Serum.
- Auftragung von Silikonfett zur Schaffung einer stabilen Umgebung für die Bildgebung.
- Präparation weiblicher Fliegen zur Gewinnung von Eikammern für die Bildgebung.
- Anwendung der Spinning-Disk-Konfokalmikroskopie zur Aufnahme von Zeitrafferfilmen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Kultivierung von Eikammern für 12 Stunden während der Bildgebung.
- Deutliche Visualisierung der Prozesse der Oozyten-Kernmigration.
- Nachweis der Wirksamkeit von Live-Bildgebungstechniken.
- Beitrag zum Verständnis der Entwicklungsbiologie bei Drosophila.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ermöglicht eine detaillierte Beobachtung der Oozyten-Dynamik.
- Mittels Live-Bildgebung lassen sich Einblicke in die Mechanismen der zellulären Migration gewinnen.
- Diese Methode kann auch auf andere biologische Prozesse in Drosophila angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis der Dynamik der Kernmigration in Modellsystemen wie Drosophila-Oozyten liefert grundlegende Erkenntnisse über die Regulation des Cytoskeletts und Mechanismen des intrazellulären Transports, die für die Zielvalidierung in zellbasierten Assays relevant sind. Die Live-Bildgebung der dreidimensionalen Organellenbewegung ermöglicht die mechanistische Absicherung von Hypothesen, die Motorproteine, Mikrotubuli-Stabilität oder die Etablierung von Polarität betreffen – zentrale Aspekte in der frühen Entdeckung, bei der phänotypische Bildschirmverfahren auf subzellulären Messgrößen basieren. Dieser Ansatz stärkt die Vorhersagekraft, indem molekulare Störungen mit beobachtbaren, quantifizierbaren zellulären Verhaltensweisen in einem krankheitsrelevanten System verknüpft werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen bezüglich zytoskelettaler Regulatoren und nukleärer Positionsproteine durch direkte Visualisierung von Migrationsverläufen.
- Operativer Wert: Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung, indem genetische oder pharmakologische Störungen mit Veränderungen in dreidimensionalen nukleären Bewegungsmustern korreliert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Standardisierung von Assays, indem quantitative, zeitlich aufgelöste Messungen der Kernposition und der Migrationskinetik in einem kontrollierten, langzeitfähigen Bildgebungsumfeld bereitgestellt werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Eignung für Screenings durch reproduzierbare Kammerpräparation und stabile Vitalität von Drosophila-Eikammern für bis zu 12 Stunden, wodurch Vergleiche unter mehreren Bedingungen ermöglicht werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet ein krankheitsrelevantes System, um Polaritätsdefekte im Zusammenhang mit Entwicklungsstörungen zu untersuchen, und unterstützt die translationale Biomarkerforschung durch die Korrelation von nukleärer Fehllokalisation mit phänotypischen Ergebnissen.
- Operationaler Wert: Fördert die translationale Kontinuität, indem Entdeckungen aus der Entdeckungsphase in einem genetisch handhabbaren, mit Live-Bildgebung kompatiblen Modell validiert werden können, bevor sie auf Säugetiersysteme übertragen werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Testung von Zielhypothesen über die Optimierung von Assays bis hin zur präklinischen Validierung, insbesondere wenn nukleare Dynamik oder zytoskelettale Funktion im Zentrum des Wirkmechanismus stehen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen und die biologische Entrisikung, indem veranschaulicht wird, wie spezifische Gen-Knockdowns oder Behandlungen mit Verbindungen die Kerwanderung in Echtzeit beeinflussen.
- Screening: Ermöglicht die Bereitstellung von Assays durch standardisierte Kammeraufbauten und quantitative 3D-Verfolgung der Kernposition als funktionellen Endpunkt für die Wirkung von Substanzen.
- Analytik: Erzeugt quantifizierbare Ergebnisse wie Migrationsgeschwindigkeit, Trajektorienwahl und endgültige Kernpositionierung, die statistisch über verschiedene experimentelle Bedingungen hinweg verglichen werden können.
- Translationale Forschung: Verbindet mit präklinischer Arbeit, indem ein kausaler Zusammenhang zwischen Fehlpositionierungen des Zellkerns und Entwicklungsphänotypen hergestellt wird, was Entscheidungen über risikoadjustierte Weiterentwicklungen unterstützt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Bildgebungsplattform zur Untersuchung des intrazellulären Transports, der Organellenpositionierung oder der Polarisierung in mehreren Projekten der Entwicklungs- und Zellbiologie.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bezüglich Zielmechanismen, indem die Unschärfe reduziert wird, mit der molekulare Eingriffe die subzelluläre Organisation und Dynamik beeinflussen.
- Operationaler Wert: Bietet Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch ein validiertes Protokoll zur Kammerpräparation, das die Gewebevitalität über längere Zeiträume für Live-Bildgebung aufrechterhält.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich der Weiterentwicklung von Zielstrukturen, indem frühzeitige, beobachtbare phänotypische Ankerpunkte für Zielstrukturen bereitgestellt werden, die an der Zytoskelettreorganisation oder dem intrazellulären Transport beteiligt sind.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf ihrem nachgewiesenen Einfluss auf die Kernmigration, einem Prozess, der mit Zellschicksal und Entwicklungstheke verbunden ist.
Durchführungsaspekte
- Setzt Fachkenntnisse in der Drosophila-Dissektion, der Live-Bildgebungsmikroskopie und der Herstellung fluoreszierender Proben voraus.
- Hängt von dem Zugang zu einem Spinning-Disk-Konfokalmikroskop oder vergleichbaren Langzeit-3D-Bildgebungssystemen mit Umweltkontrolle ab.
- Erfordert eine Standardisierung der Kammerversiegelung und der Mediumzusammensetzung zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen, um eine konsistente Überlebensfähigkeit der Eikammern sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn das Kammer-System auf andere Gewebetypen oder Entwicklungsstadien jenseits der mittleren Oogenese angewendet wird.
- Ist durch die physiologische Relevanz von Drosophila für menschliche Erkrankungen begrenzt, was eine orthogonale Validierung in Säugetiersystemen für translationsrelevante Zielstrukturen notwendig macht.
