Name: Ein optimiertes O9-1/Hydrogel-System zur Untersuchung mechanischer Signale in Neuralleistenzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Lernen Sie ein optimiertes Hydrogel-System zur Untersuchung mechanischer Signale in O9-1-Neuralleistenzellen. Diese Methode erfasst Wechselwirkungen zwischen mechanischen und chemischen Signalen in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Dr. Ana-Maria Zaske, Betreiberin der Atomic Force Microscope-UT Core-Anlage am Health Sciences Center der University of Texas, für die in diesem Projekt beigebrachte Expertise in AFM. Wir danken auch den Finanzierungsquellen der National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 und R01HL142704 an J. Wang).

1. Hydrogel-Zubereitung
HINWEIS: Alle Schritte müssen in einer Zellkulturhaube durchgeführt werden, die vor Gebrauch mit Ethanol desinfiziert und ultraviolett (UV)-sterilisiert wurde, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. Werkzeuge wie Pinzetten und Pipetten müssen mit Ethanol besprüht werden. Pufferlösungen müssen ebenfalls sterilfiltriert werden.
<ol><li>Herstellung von Aminosilan-beschichteten Glas-Deckgläsern<ol>
<li>Legen Sie die gewünschte Anzahl von Glasdeckgläsern auf ein Stück Labortuch. HINWEIS: Bereiten Sie zusätzliche 3-4 Deckgläser vor, um ausreichende Backup-Vorräte zu gewährleisten, da sie leicht brechen. Verschiedene Materialien von Glasdeckgläsern führen zu einer unterschiedlichen Kompatibilität der Zellaussaat und -befestigung. Es ist besser zu bestimmen, welcher Typ am besten zum Experiment passt, bevor Sie mit den Experimenten beginnen (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Verwenden Sie einen Alkoholbrenner oder Bunsenbrenner, um jeden Deckglas zu sterilisieren, indem Sie ihn durch die Flamme hin und her führen (30 s für Protein-Assay-Experimente). Legen Sie jedes Glasdeckglas auf ein Labortuch, um sich abzukühlen.</li>
		<li>Sobald die Glasdeckgläser abgekühlt sind, übertragen Sie sie auf eine mit Parafilm ausgekleidete Petrischale, um ein Verrutschen zu verhindern. HINWEIS: Wenn die Deckgläser nicht kühl genug sind, schmilzt die Restwärme den Parafilm auf die Zettel und macht sie unbrauchbar.</li>
		<li>Decken Sie die Deckgläser mit ca. 200 μL und 800 μL 0,1 M NaOH für einen 12 mm bzw. einen 25 mm Deckglas ab und lassen Sie sie 5 min ruhen. Dann saugen Sie die 0,1 M NaOH ab und lassen Sie die Deckgläser für weitere 5 minuten an der Luft trocknen, um einen gleichmäßigen Film zu bilden.</li>
		<li>Sobald die Deckgläser getrocknet sind, werden etwa 80 μL und 150 μL 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTS) für 12 mm bzw. 25 mm Deckgläser pipettiert. Achten Sie darauf, dass die Lösung nicht auf den Parafilm verschüttet wird. Lassen Sie die Lösung 5 Minuten einwirken.</li>
		<li>Aspirieren Sie so viel überschüssiges APTS wie möglich und lassen Sie das verbleibende APTS 5 min trocknen. Spülen Sie die Deckgläser gut ab, indem Sie sie dreimal für jeweils 5 min in steriles, deionisiertes (DI)H2Otauchen. HINWEIS: Wenn die Glasdeckgläser nicht gut gespült werden, verursacht das verbleibende APTS unerwünschte Reaktionen mit Glutaraldehyd, wodurch sich ein weißer Niederschlag bildet und unbrauchbare Deckgläser entstehen.</li>
		<li>Bewegen Sie die Deckgläser mit der reaktiven Seite nach oben in eine neue Petrischale. Geben Sie genügend 0,5% Glutaraldehyd in die Petrischale, um die Deckgläser vollständig abzudecken, und lassen Sie die Deckgläser 30 Minuten einwirken.</li>
		<li>Das 0,5%ige Glutaraldehyd absaugen und die Deckgläser erneut in DIH2Oeinmalig für 3 min abspülen. Stellen Sie die Deckgläser mit der reaktiven Seite nach oben auf ein Labortuch oder eine saubere Petrischale, um sie vor dem Gebrauch vollständig an der Luft zu trocknen. HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Deckgläser müssen bis zur Verwendung in steriles DIH2Oeingelegt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung von silikonisierten Deckgläsern<ol>
<li>Die gleiche Anzahl von Deckgläsern wie die mit Aminosilan beschichteten Deckgläser (Schritt 1.1.1) in eine mit Parafilm ausgekleidete Petrischale geben.</li>
		<li>40 μL oder 150 μL für 12 mm bzw. 25 mm Deckgläser aus Dichlormethylsilan (DCMS) auf eine Seite des Deckglases pipettieren und die Lösung 5 min ruhen lassen.</li>
		<li>Die verbleibende Lösung aus dem Deckglas absaugen, 1 min lang in sterilem DIH2Owaschen und die reaktiven Deckgläser mit der Vorderseite nach oben auf ein Labortuch legen, um sie vollständig an der Luft zu trocknen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
	</ol></li>
	<li>Hydrogele zubereiten<ol><li>Mischen Sie Acrylamid, Bisacrylamid und DIH2Oin einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen, um 500 μL Lösungen mit unterschiedlichen Steifigkeiten herzustellen (siehe Tabelle 1). Vortex die Lösung für 30 s, um es gründlich zu mischen.</li>
		<li>Schnell arbeiten, die 10% ige Ammoniumpersulfatlösung (APS) und das Tetramethylethylendiamin (TEMED) in das Röhrchen geben und die Lösungen erneut verwirbeln, um die Lösungen zu mischen. HINWEIS: Bereiten Sie frisches 10% APS zu und lassen Sie es auf Eis oder gefrieren Sie es aufgrund seines empfindlichen Gefrier- / Auftauzyklus zu Einweg-Aliquots.</li>
		<li>Etwa 33 μL oder 100 μL der Lösung werden auf die getrockneten 12 mm bzw. 25 mm aminosilanbeschichteten Deckgläser pipettiert (Abschnitt 1.1).</li>
		<li>Legen Sie mit einer gekrümmten Pinzette sofort den DCMS-behandelten Deckglas auf die Gellösung, wobei die behandelte Seite die Gellösung berührt, wodurch die Gellösung zwischen dem DCMS-behandelten Deckglas und dem aminosilanbeschichteten Deckglas eingeklemmt wird.</li>
		<li>Lassen Sie die Gellösung für 5-15 min polymerisieren, während Sie aktiv auf die Gelpolymerisation der übrig gebliebenen Lösung im Röhrchen achten.</li>
		<li>Sobald das Gel polymerisiert ist, trennen Sie den DCMS-behandelten Deckglas mit einer gekrümmten Pinzette oder einer Rasierklinge, wobei das Gel an dem ursprünglichen aminosilanbeschichteten Deckglas befestigt bleibt.</li>
		<li>Legen Sie den Deckglas mit dem angebrachten Hydrogel sofort in eine vorgegebene 4-Well/24-Well- und 6-Well-Platte, die mit 500 μL und 2 mL sterilem PBS oder DI H2Ofür 12 mm bzw. 25 mm Deckgläser bedeckt ist, um ein Austrocknen des Gels zu verhindern.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.3.4-1.3.7 für alle Deckgläser.</li>
		<li>Die Hydrogele werden 30 min lang in steriles PBS oder DIH2Ogetaucht, um überschüssige Acrylamidlösung zu entfernen. Lagern Sie die Hydrogele in sterilem PBS oder DIH2Obei 4 °C für einen Verfahrensstopp hier.</li>
		<li>In einem dunklen Raum wird das Sulfosuccinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)-hexanoat(sulfo-SANPAH)-Gemisch hergestellt, indem 2,5 mL 50 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethansulfonsäure(HEPES) (pH=8,5) mit 25 μL der 50 μg/ml Sulfo-SANPAH in einem konischen Röhrchen gemischt werden, das zum Schutz vor Licht in Aluminiumfolie eingewickelt ist. Verwenden Sie eine Pipette, um die Lösung vor der Verwendung gut zu mischen. HINWEIS: Ein Volumen von 2,5 ml Sulfo-SANPAH-Lösung reicht für etwa fünfundzwanzig 12-mm-Hydrogele oder fünf 25-mm-Hydrogele aus.</li>
		<li>Saugen Sie PBS oder DIH2Oaus der Vertiefungsplatte ab. Fügen Sie etwa 100 μL oder 500 μL für 12 mm bzw. 25 mm Deckgläser sulfo-SANPAH-Lösung (Schritt 1.3.10) hinzu, um das Gel zu bedecken. Stellen Sie sicher, dass die Lösung das Gel vollständig bedeckt. HINWEIS: Stellen Sie die Vakuumsaugstärke ein, um zu verhindern, dass die starke Kraft die Hydrogele zerreißt oder stört.</li>
		<li>Legen Sie die Gele mit der Lösung unter ein 15 W, 365 nm UV-Licht für 10 min, unbedeckt, um jede Interferenz des UV-Lichts, das mit dem Sulfo-SANPAH reagiert, zu minimieren.</li>
		<li>Aspirieren Sie das überschüssige Sulfo-SANPAH, indem Sie die Platte kippen, um so viel wie möglich von der Lösung zu sammeln. Waschen Sie das Gel mit 50 mM HEPES zwei- bis dreimal.</li>
		<li>500 μL und 2 ml für 12 mm bzw. 25 mm Gele mit 50 mg/ml Kollagen I, verdünnt in 0,2 % Essigsäure, in jede Vertiefung geben, die das Hydrogel enthält. Lassen Sie die Gele über Nacht in einem 37 °C, 5% CO 2-Inkubator inkubieren. HINWEIS: Verdünnen Sie Kollagen I in 0,2% Essigsäure anstelle von 50 mM HEPES, um eine homogene Verteilung und Bindung von Kollagen I zu fördern.</li>
		<li>Aspirieren Sie das Kollagen I und waschen Sie die Gele dreimal mit sterilem PBS, um überschüssiges Kollagen I für 5 Minuten pro Wäsche zu entfernen. Inkubieren Sie die Hydrogele in PBS mit 10% Pferdeserum, 5% FBS für 2 h im 37 °C, 5%CO2 Inkubator. HINWEIS: Die Zugabe von 10% Pferdeserum fördert eine höhere Proliferation im Vergleich zur ausschließlichen Verwendung von FBS, wie in der vorherigen Veröffentlichung.</li>
		<li>Aspirieren Sie das Medium. Geben Sie 500 ml sterilfiltriertes Modifiziertes Eagle Medium (DMEM) von Dulbecco mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin (P/S) zu jeder Vertiefung hinzu. Lagern Sie die Gele im 37 °C, 5% CO2-Inkubator, bis sie für die Zellkultur bereit sind.</li>
		<li>Fertig, etwa 1,5 × 104 O9-1 Zellen/cm2 in Basalmedium in die Kulturschalen geben. Inkubieren Sie die Zellen für 2 Tage in einem Inkubator bei 37 ° C, 5%CO2. Überprüfen Sie die Zellen auf Konfluenz, um sicherzustellen, dass die Zellen ausreichend an Gele gebunden sind und dass die Anzahl der Zellen ausreicht, bevor Sie sie zur Analyse sammeln. HINWEIS: Siehe das zuvor veröffentlichte Protokoll für die Schritte der Wiederherstellung, Passage und Sammlung von O9-1-Zellen20.</li>
		<li>Fahren Sie mit den Abschnitten 2, 3 oder 4 fort, um die Hydrogele weiter zu analysieren.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Quantitative Analyse der Steifigkeit mittels AFM
<ol><li>Starten Sie den AFM-Systemcomputer, gefolgt vom AFM-Controller (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Montieren Sie den AFM-Freischwinger am AFM-Sondenhalter. Verwenden Sie einen sphärischen Cantilever mit einer 0,5 μm Silica-Perle, die am Ende des Cantilevers montiert ist (Cantilever mit kugelförmiger Perle). HINWEIS: Für steifere Hydrogele wie 10 kPa, 20 kPa und 40 kPa wurde eine steifere Sonde mit der Federkonstante von 0,24 N/m verwendet. Für weichere Hydrogele wie 0,5 kPa und 1 kPa wurde eine weichere Sonde mit einer Federkonstante von 0,059 N/m verwendet.</li>
	<li>Stellen Sie die AFM-Software in den Kontaktmodusein.</li>
	<li>Montieren Sie den Siliziumwafer auf dem AFM-Probentisch, um Kraftkurven zu sammeln, indem Sie auf Engage klicken, damit der Cantilever das Siliziumsubstrat berührt und so die Kraftkurven erzeugt.</li>
	<li>Verwenden Sie die oben genannten Kraftkurven (2.4) für die Kalibrierung, klicken Sie in der Steuerungssoftware auf Kalibrieren, um eine durchschnittliche Federkonstante des Cantilevers unter thermischen Tune-Bedingungen zu erhalten, und speichern Sie die kalibrierten Werte in der Steuerungssoftware.</li>
	<li>Montieren Sie die Proben, indem Sie den Deckglas mit dem angebrachten Hydrogel in einer 60-mm-Petrischale auf die AFM-Scanstufe legen. Geben Sie 3 ml PBS in die Schale, bevor Sie Messungen durchführen, um zu verhindern, dass das Gel austrocknet.</li>
	<li>Stellen Sie den AFM so ein, dass er im Kontaktmodus (Flüssigkeit) arbeitet, um die Messung zu starten. Aktivieren Sie die kugelförmige Perle, um die Gelprobe kontinuierlich zu berühren und zu heben.</li>
	<li>Stellen Sie den Ausleger so ein, dass seine Auslenkungsschwelle bei 10 nm bleibt. Halten Sie die Rampengröße der Sonde bei 10 μm. Notieren Sie dann die Kraftkurven wie in Schritt 2.4.</li>
	<li>Erfassen Sie mindestens 20 Kraftkurven von mindestens 3 bis 10 verschiedenen Stellen auf der Oberfläche des Hydrogels.</li>
	<li>Berechnen Sie den durchschnittlichen Elastizitätsmodul von ~ 20 Kraftkurven für jeden Punkt mit AFM-Bildgebungs- und Analysesoftware. Verwenden Sie verlängerte Rampenkraftkurven und ein linearisiertes Modell (sphärisch). Berechnen Sie den Durchschnitt aller Stellen für jede Probe, um die endgültige Steifigkeit zu erhalten. HINWEIS: Der Elastizitätsmodul und zugehörige Daten(d. h. Standardabweichungen) werden automatisch als Tabellenkalkulation gespeichert.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.6-2.10 für alle Samples.</li>
</ol>3. Molekulare Analyse der Steifigkeit durch Immunfluoreszenzfärbung
<ol><li>Verwenden Sie eine Pinzette, um den Deckglas auf eine neue Platte zu transportieren, um falsche Signale von Zellen zu minimieren, die direkt auf die Platte gezüchtet werden. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 500 μL sterilem PBS, um abgestorbene Zellen und verbleibendes Kulturmedium zu entfernen.</li>
	<li>Fixieren Sie die Zellen mit 500 μL 4% Paraformaldehyd (PFA) für 10 min bei Raumtemperatur, ungestört. Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit 500 μL PBS / Well für jeweils 2 min. HINWEIS: Für einen Verfahrensstopp bei 4 °C aufbewahren.</li>
	<li>Behandeln Sie die Zellen mit 500 μL 0,1% Triton X-100 für 15 min bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit 500 μL PBS / Well.</li>
	<li>Blockieren Sie die Zellen mit 250 μL 10% Eselserum (verdünnt in PBS und 0,1% Tween 20) pro Vertiefung für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit 250 μL primären Antikörpern für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C. Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit 500 μL PBS / Well für jeweils 5 min. HINWEIS: Anti-Vinculin (Vcl) (1:250) und Anti-AP2 alpha (1:250) wurden in diesem Experiment verwendet und in 10% Eselserum verdünnt.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit entsprechenden sekundären Antikörpern und/oder Phalloidin, die für die F-Aktin-Färbung verwendet werden, bei einer Verdünnung von 1:400 in 250 μL 10% Eselserum für 30 min bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten. HINWEIS: 568 nm Phalloidin kann mit 488 nm oder 647 nm sekundären Antikörpern oder allein co-inkubiert werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1:1000 Verdünnung) in 250 μL PBS für 10 min, gefolgt von einer letzten Wäsche PBS für 2 min.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Bohrloch 3-4 Tropfen Montagemedium hinzu. Lagern Sie die Proben bei 4 °C, um sie vor der Bildgebung für mindestens 2 h einzustellen, um sicherzustellen, dass das Montagemedium richtig eingestellt ist.</li>
	<li>Erfassen Sie Bilder von mindestens 3 zufälligen Bildern pro Hydrogelprobe mit einem Fluoreszenzmikroskop und erzeugen Sie einzelne und verschmolzene Kanäle.</li>
</ol>4. Quantitative real-time PCR (RT-qPCR)
<ol><li>Übertragen Sie die Hydrogele mit den adhärenten Zellen für die RNA-Sammlung auf eine neue Platte, um unerwünschte RNA von Zellen, die an die Zellplatte gebunden sind, zu minimieren. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, um abgestorbene Zellen und Kulturmedium zu entfernen.</li>
	<li>Extrahieren Sie die gesamte mRNA mit einem RNA-Extraktionskit. Führen Sie die umgekehrte Transkription von RNA in cDNA mit einem Reverse-Transkriptions-Supermix gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.</li>
	<li>Führen Sie RT-qPCR mit Primern für Vcl als Steifigkeitsmarker der Wahl durch und analysieren Sie mit der 2-ΔΔCT-Methode. HINWEIS: Primer-Sequenz von Vcl: Forward 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; reverse 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Ziel der aktuellen Studie ist es, ein effektives und effizientes In-vitro-System bereitzustellen, um die Auswirkungen mechanischer Signale in NCCs besser zu verstehen. Zusätzlich zur Befolgung des oben genannten Schritt-für-Schritt-Protokolls müssen die Forscher bedenken, dass die Zellkultur von O9-1-NCCs von der Art der Glasdeckgläser beeinflusst wird, die zur Herstellung von Hydrogelen verwendet werden. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass Zellen, die auf einer bestimmten Art von Glasdeckglas gesät wurden (si...

Neuralleistenzellen (NCCs) sind eine Gruppe von Stammzellen während der Embryogenese von Wirbeltieren mit einer bemerkenswerten Fähigkeit zu wandern und zur Entwicklung verschiedener Organe und Gewebe beizutragen. NCCs können sich in verschiedene Zelltypen differenzieren, einschließlich sensorischer Neuronen, Knorpel, Knochen, Melanozyten und glatter Muskelzellen, abhängig von der Lage des axialen Ursprungs und der lokalen Umweltführung des NCC1,2. Mit der Fähigkeit, sich in eine Vielzahl von Zelltypen zu differenzieren, können genetische Anomalien, die in jedem Stadium der Neuralleistenentwicklung (NC) eine Dysregulation verursachen, zu zahlreichen angeborenen Erkrankungen führen2. Zum Beispiel führen Störungen während der Bildung, Migration und Entwicklung von NCCs zu Entwicklungsstörungen, die zusammen als Neurokristopathien1,3bekannt sind. Diese Krankheiten reichen von kraniofazialen Defekten aufgrund eines Versagens der NCC-Bildung, wie dem Treacher-Collins-Syndrom, bis hin zur Entwicklung verschiedener Krebsarten aufgrund der metastasierenden Migrationsfähigkeit des NCC, wie sie beim Melanom3,4,5,6beobachtet wird . In den letzten Jahrzehnten haben Forscher bemerkenswerte Entdeckungen über die Rollen und Mechanismen von NCCs in der Entwicklung und bei Krankheiten gemacht, wobei sich die Mehrheit der Ergebnisse auf chemische Signale konzentriert7,8. In jüngerer Zeit wurde darauf hingewiesen, dass mechanische Signale eine kritische, aber wenig verstandene Rolle in der NCC-Entwicklungspielen 9,10.
Die Umwelthinweise von NCCs spielen während ihrer Entwicklung eine entscheidende Rolle, einschließlich der Regulierung der NCC-Differenzierung in verschiedene Zelltypen. Umwelteinflüsse, z. B. physikalische Hinweise, beeinflussen das entscheidende Verhalten und die zellulären Reaktionen, wie z. B. die funktionelle Diversifizierung. Die Mechanotransduktion ermöglicht es den Zellen, diese Hinweise zu spüren und darauf zu reagieren, um verschiedene biologische Prozesse aufrechtzuerhalten2. NCCs sind von benachbarten Zellen und verschiedenen Substraten wie der extrazellulären Matrix (ECM) umgeben, die mechanische Reize hervorrufen können, um die Homöostase aufrechtzuerhalten und sich durch Schicksalsbestimmung, Proliferation und Apoptose an die Veränderungen anzupassen11. Die Mechanotransduktion beginnt an der Plasmamembran, wo die sensorische Komponente mechanischer extrazellulärer Reize auftritt, was zur intrazellulären Regulation der Zelleführt 12. Integrine, fokale Adhäsionen und Verbindungen der Plasmamembran leiten mechanische Signale wie Scherkräfte, Spannung und Steifigkeit der umgebenden Substrate in chemische Signale um, um zelluläre Reaktionen zu erzeugen12. Die Weiterleitung chemischer Signale von der Plasmamembran zur endgültigen zellulären Regulation erfolgt über verschiedene Signalwege, um lebenswichtige Prozesse für den Organismus, wie z.B. die Differenzierung, abzuschließen.
Mehrere Studien haben gezeigt, dass die mechanische Signalübertragung aus der Substratsteifigkeit eine Rolle bei der Zelldifferenzierung spielt13,14. Zum Beispiel haben frühere Studien gezeigt, dass mesenchymale Stammzellen (MSCs), die auf weichen Substraten mit einer Steifigkeit ähnlich der von Hirngewebe (im Bereich von 0,1-1,0 kPa) gezüchtet wurden, zu einer neuronalen Zelldifferenzierung führten15,16. Allerdings differenzieren sich mehr MSCs in myozytenähnliche Zellen, wenn sie auf 8-17 kPa-Substraten gezüchtet werden, die die Steifigkeit des Muskels nachahmen, während osteoblastenartige Differenzierung beobachtet wurde, wenn MSCs auf steifen Substraten kultiviert wurden (25-40 kPa)15,16. Die Bedeutung der Mechanotransduktion wird durch die Unregelmäßigkeiten und Anomalien im mechanischen Signalweg hervorgehoben, die möglicherweise zu schweren Entwicklungsdefekten und -krankheiten führen, einschließlich Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Osteoporose17,18,19. Bei Krebserkrankungen ist normales Brustgewebe weich, und das Brustkrebsrisiko steigt in steifem und dichtem Brustgewebe, einer Umgebung, die eher Brusttumorenähnelt 15. Mit diesem Wissen können die Auswirkungen der mechanischen Signalgebung auf die NCC-Entwicklung durch einfache Manipulation der Substratsteifigkeit durch ein In-vitro-System untersucht werden, was weitere Vorteile und Möglichkeiten zum Verständnis der Grundlagen des NC-bedingten Krankheitsverlaufs und der Ätiologie bietet.
Um den Einfluss mechanischer Signale in NCCs zu untersuchen, haben wir ein effizientes In-vitro-System für NCCs etabliert, das auf der Optimierung zuvor veröffentlichter Methoden und der Bewertung der Reaktionen von NCCs auf verschiedene mechanische Signale basiert20,21. Es wurde ein detailliertes Protokoll für die unterschiedliche Vorbereitung der Hydrogelsteifigkeit und die Bewertung der Auswirkungen der mechanischen Signalgebung in NCCs bereitgestellt. Um dies zu erreichen, werden O9-1 NCCs als NC-Modell verwendet, um die Auswirkungen und Veränderungen als Reaktion auf steife gegenüber weichen Hydrogelen zu untersuchen. O9-1 NCCs sind eine stabile NC-Zelllinie, die am Tag 8.5 aus dem Mausembryo (E) isoliert wurde. O9-1 NCCs ahmen NCCs in vivo nach, weil sie sich in definierten Differenzierungsmedien in verschiedene NC-abgeleitete Zelltypen differenzieren können22. Um die mechanische Signalisierung von NCCs zu untersuchen, wurde ein Matrixsubstrat mit abstimmbarer Elastizität aus unterschiedlichen Konzentrationen von Acrylamid- und Bisacrylamidlösungen hergestellt, um die gewünschte Steifigkeit zu erreichen, die der biologischen Substratsteifigkeit20,21,23entspricht. Um die Bedingungen des Matrixsubstrats für NCCs, insbesondere O9-1-Zellen, zu optimieren, wurden Modifikationen aus dem zuvor veröffentlichten Protokoll20vorgenommen. Eine Änderung in diesem Protokoll bestand darin, Hydrogele in Kollagen I, verdünnt in 0,2% Essigsäure anstelle von 50 mM HEPES, bei 37 ° C über Nacht zu inkubieren. Der niedrige pH-Wert der Essigsäure führt zu einer homogenen Verteilung und einem höheren Kollagen-I-Einbau, wodurch eine gleichmäßigere Bindung des ECM-Proteins24ermöglicht wird. Darüber hinaus wurde eine Kombination aus Pferdeserum und fetalem Rinderserum (FBS) in Konzentrationen von 10% bzw. 5% in Phosphatpuffersalzlösung (PBS) verwendet, bevor die Hydrogele im Inkubator gelagert wurden. Pferdeserum wurde als zusätzliche Ergänzung zu FBS aufgrund seiner Fähigkeit verwendet, die Zellproliferation und -differenzierung bei einer Konzentration von 10% zu fördern25.
Mit dieser Methode wurde eine biologische Umgebung durch die ECM-Proteinbeschichtung (z. B. Kollagen I) nachgeahmt, um eine genaue In-vitro-Umgebung für NCCs zu schaffen, um zu wachsen und zu überleben20,21. Die Steifigkeit der präparierten Hydrogele wurde mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM), einer bekannten Technik zur Darstellung des Elastizitätsmoduls26,quantitativ analysiert. Um die Wirkung unterschiedlicher Steifigkeitsniveaus auf NCCs zu untersuchen, wurden Wildtyp-O9-1-Zellen kultiviert und auf Hydrogelen für die Immunfluoreszenz (IF) -Färbung gegen filamentöses Aktin (F-Aktin) vorbereitet, um die Unterschiede in der Zelladhäsion und Morphologie als Reaktion auf Veränderungen der Substratsteifigkeit zu zeigen. Mit diesem In-vitro-System werden die Forscher in der Lage sein, die Rolle der mechanischen Signalgebung in NCCs und ihre Wechselwirkung mit anderen chemischen Signalen zu untersuchen, um ein tieferes Verständnis der Beziehung zwischen NCCs und mechanischer Signalgebung zu erlangen.

<table><tbody><tr><td>12 mm #1 Corning 0211 Glasdeckglas</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-1763-012</td><td></td></tr><tr><td>2% Bis-Acrylamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662165</td><td></td></tr><tr><td>25 mm #1 Corning 0211 Glasdeckglas</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-1763-025</td><td></td></tr><tr><td>3-Aminopropyltriethoxysilan (APTS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>4-Well-Zellkulturplatte</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td></td></tr><tr><td>4 % Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>J61899-AP</td><td></td></tr><tr><td>40 % Acrylamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>50 % Glutaraldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7651</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturplatte</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>AFM-Ausleger (kugelförmige Kugel)</td><td>Novascan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM-Software</td><td>Katalysator NanoScope</td><td></td><td>Modell: 8.15 SR3R1</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat (APS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>248614</td><td>Pulver</td></tr><tr><td>anti-AP-2&alpha; Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-12726</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Vinculin-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab129002</td><td></td></tr><tr><td>Rasterkraftmikroskopie (AFM) Bioskop Katalysator</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollagen Typ I (100mg)</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dichlormethylsilan (DCMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440272</td><td></td></tr><tr><td>Eselserum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td>Modell DMi8</td></tr><tr><td>Fluoromount-G-Fassung mittel</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-35</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>Pulver</td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Corning</td><td>35-030-CI</td><td></td></tr><tr><td>iScript Reverse Transkription Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Antibiotikum</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mikrokit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Steril 1x PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td></td></tr><tr><td>Steriles deionisiertes Wasser</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>U284</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Fisher</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>SYBR grün</td><td>Applied Biosystems</td><td>4472908</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

ein optimiertes o9-1/hydrogel-system zur untersuchung mechanischer signale in neuralleistenzellen

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Neuralleistenzellen (NCCs) sind embryonale multipotente Zellen von Wirbeltieren, die in eine Vielzahl von Zelltypen wandern und differenzieren können, aus denen verschiedene Organe und Gewebe hervorgehen. Gewebesteifigkeit erzeugt mechanische Kraft, ein physikalischer Hinweis, der eine entscheidende Rolle bei der NCC-Differenzierung spielt; Der Mechanismus bleibt jedoch unklar. Die hier beschriebene Methode liefert detaillierte Informationen für die optimierte Erzeugung von Polyacrylamid-Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit, die genaue Messung einer solchen Steifigkeit und die Bewertung der Wirkung mechanischer Signale in O9-1-Zellen, einer NCC-Linie, die in vivo NCCs nachahmt.
Die Hydrogelsteifigkeit wurde mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) gemessen und zeigte entsprechend unterschiedliche Steifigkeitsstufen an. O9-1 NCCs, die auf Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit kultiviert wurden, zeigten eine unterschiedliche Zellmorphologie und Genexpression von Stressfasern, was auf unterschiedliche biologische Effekte hinwies, die durch mechanische Signaländerungen verursacht wurden. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Variation der Hydrogelsteifigkeit zu einem effizienten In-vitro-System führte, um die mechanische Signalgebung zu manipulieren, indem die Gelsteifigkeit verändert und die molekulare und genetische Regulation in NCCs analysiert wurde. O9-1 NCCs können sich unter dem Einfluss der entsprechenden Differenzierungsmedien in eine Vielzahl von Zelltypen differenzieren, und es ist praktisch, chemische Signale in vitrozu manipulieren. Daher ist dieses In-vitro-System ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Rolle der mechanischen Signalgebung in NCCs und ihre Wechselwirkung mit chemischen Signalen zu untersuchen, was den Forschern helfen wird, die molekularen und genetischen Mechanismen der Neuralleistenentwicklung und -krankheiten besser zu verstehen.

Hydrogelvorbereitung und Steifigkeitsbewertung durch AFM und das Hertz-Modell Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von Polyacrylamid-Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit bereitgestellt, indem das Verhältnis von Acrylamid und Bisacrylamid reguliert wird. Die Polyacrylamid-Hydrogele sind jedoch aufgrund des Mangels an ECM-Proteinen nicht bereit für die Adhäsion von Zellen. So bindet Sulfo-SANPAH, das als Linker fungiert, kovalent an die Hydrogele und reagiert mit den primären Aminen v...

Detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokolle werden hier beschrieben, um mechanische Signale in vitro mit multipotenten O9-1-Neuralleistenzellen und Polyacrylamid-Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit zu untersuchen.

Ein optimiertes O9-1/Hydrogel-System zur Untersuchung mechanischer Signale in Neuralleistenzellen

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

Die Methode hilft bei der Untersuchung der mechanischen Signalübertragung der Neuralleistenzellen und ihrer Wechselwirkung mit chemischen Signalen. Es kann auch bei den molekularen und genetischen Mechanismen der Neuralleistenentwicklung bei Krankheiten helfen. Das Übertragen der Glasabdeckungsrutschen ist die größte Herausforderung, daher übertragen Sie sie langsam und aufmerksam, um ein Brechen und Herunterfallen zu verhindern.Das Verfahren werden von mir und Dr. Sherry Zhao, einer Postdoktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Legen Sie zunächst die gewünschte Anzahl von Glasabdeckungsrutschen auf ein Stück Labortuch. Sterilisieren Sie dann jeden Deckzettel, indem Sie ihn durch die Flamme des Alkoholbrenners hin und her führen.Wenn der Deckel abkühlt, bedecken Sie den 12 Millimeter Abdeckslip mit ca. 200 Mikrolitern und den 25 Millimeter Deckschlupf mit 800 Mikrolitern 0,1 molarem Natriumhydroxid. Nach fünf Minuten Natronlauge absaugen und den Deckel fünf Minuten an der Luft trocknen lassen, um einen gleichmäßigen Film zu bilden. Sobald die Deckblätter getrocknet sind, fügen Sie etwa 18 Mikroliter Aminopropyltriethoxysilan oder APTS auf einen 12-Millimeter-Deckzettel und 150 Mikroliter APTS auf einen 25-Millimeter-Deckzettel hinzu.Aspirat greifen Sie auf APTS zu, damit das verbleibende APTS fünf Minuten lang trocknen kann. Später spülen Sie die Abdeckungsrutschen dreimal aus, indem Sie sie jedes Mal fünf Minuten lang in steriles deionisiertes Wasser tauchen. Bewegen Sie die gewaschenen Bezugsrutschen mit der reaktiven Seite nach oben in eine frische Petrischale.Und behandeln Sie die Abdeckungsrutschen, indem Sie 30 Minuten lang genügend 0,5% Glutaraldehyd einweichen. Nach dem Absaugen des Glutaraldehyds spülen Sie die Abdeckungsrutschen einmal mit entionisiertem Wasser für drei Minuten ab und trocknen Sie die Abdeckung mit der reaktiven Seite nach oben an der Luft. Um die silikonisierten Abdeckzettel vorzubereiten, legen Sie die gleiche Anzahl von Abdeckzetteln wie die mit Aminosilan beschichteten Deckblätter in eine mit Parafolie ausgekleidete Petrischale.Behandeln Sie dann die 12-Millimeter-Abdeckzettel mit 40 Mikrolitern und 25-Millimeter-Deckblättern mit 150 Mikrolitern Dichlormethansilan oder DCMS für fünf Minuten. Waschen Sie die Bezugsslips einmal für eine Minute mit sterilem entionisiertem Wasser, bevor Sie die reaktiven Cover-Slips mit der Vorderseite nach oben auf ein Labortuch legen. Zur Herstellung der Hydrogele werden frisch zubereitete Acrylamid-Gellösung auf die getrockneten Aminosilan-beschichteten Deckblätter pipettiert.Mit einer gekrümmten Pinzette den DCMS-behandelten Deckslip sofort auf die Gellösung aufbringen, wobei die behandelte Seite die Gellösung berührt, wodurch die Gellösung zwischen zwei Deckblättern gewechselt wird. Sobald das Gel polymerisiert ist, trennen Sie den DCMS-behandelten Deckschlicker mit einer gekrümmten Pinzette, wobei das Gel an dem mit Aminosilan beschichteten Deckslip befestigt bleibt. Als nächstes tauchen Sie den 12-Millimeter-Deckslip mit dem angebrachten Hydrogel in eine vorgegebene 4-Well- oder 24-Well-Platte, die mit 500 Mikrolitern sterilem PBS oder deionisiertem Wasser bedeckt ist, und den 25-Millimeter-Abdeckungsrutsch in eine 6-Well-Platte, die mit zwei Millilitern sterilem PBS oder deionisiertem Wasser bedeckt ist, für 30 Minuten.Nach dem Entfernen der überschüssigen Acrylamidlösung lagern Sie die Hydrogele 30 Minuten lang in sterilem PBS oder entionisiertem Wasser bei Raumtemperatur. Später saugen Sie PBS oder deionisiertes Wasser aus der Brunnenplatte ab, bevor Sie Sulfo-Succinimydyl- oder Sulfo-SUNPAH-Lösung hinzufügen, um das Gel vollständig zu bedecken. Und legen Sie die Gele mit der Lösung unter ein 15 Watt, 365 Nanometer ultraviolettes Licht, das für 10 Minuten unbedeckt ist.Sammeln Sie so viel von der Sulfo-SANPAH pro Lösung wie möglich, indem Sie die Platte kippen. Und dann waschen Sie das Gel zwei- bis dreimal mit 15 Millimolar HEPES. Fügen Sie 15 Milligramm pro Milliliter Kollagen 1, verdünnt in 0,2% Essigsäure, zu jeder Vertiefung hinzu, die das Hydrogel enthält.Und inkubieren Sie die Gele über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Führen Sie am nächsten Tag die Wäsche wie im Manuskript beschrieben durch, bevor Sie die Hydrogele mit PBS inkubieren, das 10% Pferdeserum und 5% FBS bei 37 Celsius und 5% Kohlendioxid enthält. Nach zwei Stunden Inkubation werden 500 Mikroliter steril gefiltertes DMEM mit jeweils 10% FBS und 1% Penicillin Streptomycin zugegeben und die Gele bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid gelagert.Wenn die Zellkultur fertig ist, platten Sie ungefähr 1,5 mal 10 bis die vierte 09-1 Zelle pro Zentimeter Im Quadrat im Bazell-Medium. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Abdeckungsrutschen auf eine neue Platte zu transportieren, um falsche Signale von den Direkt auf der Platte gezüchteten Zellen zu minimieren. Fixieren Sie dann die Zellen mit 500 Mikrolitern 4% Paraformaldehyd für 10 Minuten, bevor Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern von 0,1% Triton X-100 bei Raumtemperatur behandeln.Nach 15 Minuten gehen Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern 10% Eselserum. Färben Sie die Zellen auf F-Aktin mit Felodipin in einer Verdünnung von 1 bis 400 in 250 Mikrolitern 10% Eselserum, gefolgt von einer Inkubation mit DAPI für 10 Minuten. Waschen Sie die Zellen zwei Minuten lang mit PBS, bevor Sie drei bis vier Tropfen Montagemedium zu jeder Vertiefung geben.Erfassen Sie auf einem Fluoreszenzmikroskop die Bilder von mindestens drei zufälligen Bildern pro Hydrogelprobe, die einzelne und verschmolzene Kanäle erzeugen. Bei der Steifigkeitsbewertung des Hydrogels durch Rasterkraftmikroskopie oder AFM war die Neigung der Kraftkurve für weiche Hydrogele schonend, da die erforderliche Kraft von der AFM-Sonde geringer war. Bei steifen Hydrogelen war die erzeugte Steigung jedoch viel steiler.Die AFM-Messungen wurden dann verwendet, um die durchschnittliche Steifigkeit von Hydrogelen aus dem Elastizitätsmodul von Young in Kilopascal zu berechnen. Die Wachstumseigenschaften von P19- und 09-1-Zellen wurden in einem Kilopascal und 40 Kilopascal Hydrogelen von Kontroll- und modifizierten Gelsystemen beobachtet. Die 09-1-Zellen, die auf den ursprünglichen Gelsystemen gezüchtet wurden, führten zu einer höheren Anzahl toter Zellen.Im Gegensatz dazu zeigten die 09-1-Zellen, die auf den modifizierten Gelsystemen gezüchtet wurden, ein gesundes Zellwachstum und eine ausreichende Bindung an das Hydrogelsubstrat mit wenig Zelldeck, das durch minimale runde Zellen angezeigt wurde. Die P19-Zellen, die auf beiden Hydrogelsystemen plattiert waren, zeigten einen Überschuss an runden schwimmenden Zellen und einen Mangel an Zellsubstratansätzen. Die Kompatibilität von Neuralleistenzellen oder NCCs mit dem modifizierten Hydrogelsystem wurde durch Immunfluoreszenzfärbung für AP-2 bewertet.Ein signifikanter Anstieg der AP-2-Expression in 09-1 Zellen, die auf dem modifizierten Hydrogelsystem plattiert waren, wurde beobachtet. Darüber hinaus zeigten die 09-1-Zellen unterschiedliche Morphologien, die auf den Hydrogelen mit niedriger oder hoher Steifigkeit durch unterschiedliche Mengen der Spannungsfasern basierten. Die Anti-Vinculin-Expression in 09-1-Zellen, die auf dem 40-Kilopascal-Hydrogel gezüchtet wurden, war höher als die auf dem einen Kilopascal-Hydrogel gezüchteten Zellen, was widerspiegelt, dass die auf weicheren Substraten gezüchteten Zellen minimale fokale Additionskomplexe bilden als das steife Substrat.Eine angemessene Wartezeit ist entscheidend für die Polymerisation der Hydrogele, da Acrylamide für die Zellen toxisch sind. Tauchen Sie die Hydrogele mindestens 30 Minuten lang in PBS oder entionisiertes Wasser, um bessere Ergebnisse zu erzielen.

an-optimized-o9-1hydrogel-system-for-studying-mechanical-signals

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir zeigen, dass die Überexpression des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFR) die Beweglichkeit der neuralen Stammzellen (NSCs) unter Verwendung eines neuartigen Agarosegel basierten mikrofluidischen Gerät verbessert. Diese Technologie kann ohne weiteres auf andere Säugetierzellen Systeme, bei denen Zellen Quellen sind rar, wie menschliche neurale Stammzellen, und die Umdrehung um Zeit ist von entscheidender Bedeutung.

Die Beurteilung Neural Stem Cell Motilität Mit einem Agarosegel-basierte Mikrofluidikvorrichtung

In diesem Video beschreiben wir das Verfahren zur Durchführung einer Fluoreszenzfärbung mittels Fluoreszenzmikroskopie, um die Phalloidinfärbung von Neuralleistenzellen zu demonstrieren, die auf Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit kultiviert wurden, um die Organisation des Zytoskeletts sichtbar zu machen und zu analysieren.

Fluoreszenzfärbung von Neuralleistenzellen, die auf Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit kultiviert wurden

Wir präsentieren ein neues Polyacrylamid-Hydrogel, genannt Hydroxy-PAAm, die mit minimalen Kosten oder Know-how eine direkte Bindung von ECM-Proteine ​​ermöglicht. Die Kombination von Hydroxy-PAAm Hydrogele mit Mikrokontaktdruck erleichtert eine unabhängige Steuerung der vielen Hinweise des natürlichen Zellmikroumgebung für die Untersuchung zellulärer mechanostransduction.

Herstellung von Hydroxy-PAAm Hydrogele zur Entkopplung der Auswirkungen von Mechanotransduction Cues

Wir präsentieren die Entwicklung des selbst-zusammengebauten, dreidimensionale Bündel longitudinal ausgerichteten astrocytic Somata und Prozesse innerhalb ein neuartiges Biomaterial-Ummantelung. Diese "lebende Gerüste", präsentiert Mikron-Skala Durchmesser noch Zentimeter in der Länge, Verlängerung dienen als Testumgebungen zu Entwicklungsstörungen Mechanismen zu studieren oder zu erleichtern Neuroregeneration Regie neuronalen Migration und/oder axonalen entwickelt Pathfinding.

Dreidimensionale Gewebezüchtungen ausgerichtet Astrozyten Netzwerke Nervensystem Regeneration zu rekapitulieren Entwicklungsmechanismen

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die 3D Kultur der Ratte Gehirn abgeleitet Glia-Zellen, einschließlich der Oligodendrozyten, Astrozyten und Mikroglia. Wir zeigen Primärzelle Kultur, methacrylated Hyaluronsäure (HAMA) Hydrogel Synthese, HAMAphoto-Polymerisation und Zelle Kapselung und Probe Verarbeitung für die konfokale und scanning Electron mikroskopische Bildgebung.

3D Hydrogel Kulturen von primären Gliazellen für In-vitro- Modellierung von Neuroinflammation verbessert

Dieses Protokoll beschreibt eine physiologisch relevante, unter Druck stehende flüssige Ansatz für schnelle und reversible Induktion von Krampfadern in den Neuronen.

Ein Microbiomechanical-System für das Studium Varizen-Bildung und Erholung in zentralen Neuronen Axone

O9-1 ist eine Zell-Linie multipotent Maus Neuralleiste. Hier beschreiben wir detaillierte Schritt für Schritt Protokolle für die Kultivierung O9-1-Zellen, O9-1-Zellen in bestimmten Zelltypen differenzieren und genetisch manipuliert O9-1-Zellen mit SiRNA-vermittelten Zuschlag oder CRISPR-Cas9 Genom-Bearbeitung.

Kultivierung und Manipulation von Zellen der Neuralleiste O9-1

Hier bieten wir eine Methode zur Analyse des Verhaltens wachsender Axone in 3D-Matrizen, die ihre natürliche Entwicklung imitieren.

Generation von 3-D-Kollagen-basierten Hydrogelen zur Analyse des axonalen Wachstums und Verhaltens während der Entwicklung des Nervensystems

Dieses Protokoll beschreibt die Zerlegung und Kultur von kranialen neuralen Kammzellen aus Mausmodellen, in erster Linie für die Untersuchung der Zellmigration. Wir beschreiben die verwendeten Live-Bildgebungstechniken und die Analyse von Geschwindigkeits- und Zellformänderungen.

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Diese Methode soll die Mechanismen veranschaulichen, mit denen extrazelluläre Matrix-Cues wie Substratsteifigkeit, Proteinzusammensetzung und Zellmorphologie Schwann-Zell(SC)-Phänotyp regulieren.

Vorbereitung von tunable Extracellular Matrix Microenvironments zur Bewertung der Schwann Cell Phänotyp Specification

Dieses Protokoll beschreibt ein in vitro Migrationsexperiment, das für die funktionelle Analyse der Moleküle geeignet ist, die an der in vivo Migration von Neuralleistenzellen in die hyaluronsäurereiche extrazelluläre Matrix beteiligt sind.

In vitro Untersuchung der Auswirkungen der hyaluronsäurereichen extrazellulären Matrix auf die Migration von Neuralleistenzellen

Lernen Sie ein optimiertes Hydrogel-System zur Untersuchung mechanischer Signale in O9-1-Neuralleistenzellen. Diese Methode erfasst Wechselwirkungen zwischen mechanischen und chemischen Signalen in vitro.

Ein optimiertes O9-1/Hydrogel-System zur Untersuchung mechanischer Signale in Neuralleistenzellen

Weitere Videos entdecken