Ein optimiertes O9-1/Hydrogel-System zur Untersuchung mechanischer Signale in Neuralleistenzellen

Detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokolle werden hier beschrieben, um mechanische Signale in vitro mit multipotenten O9-1-Neuralleistenzellen und Polyacrylamid-Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit zu untersuchen.

Die Methode hilft bei der Untersuchung der mechanischen Signalübertragung der Neuralleistenzellen und ihrer Wechselwirkung mit chemischen Signalen. Es kann auch bei den molekularen und genetischen Mechanismen der Neuralleistenentwicklung bei Krankheiten helfen. Das Übertragen der Glasabdeckungsrutschen ist die größte Herausforderung, daher übertragen Sie sie langsam und aufmerksam, um ein Brechen und Herunterfallen zu verhindern.

Das Verfahren werden von mir und Dr. Sherry Zhao, einer Postdoktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Legen Sie zunächst die gewünschte Anzahl von Glasabdeckungsrutschen auf ein Stück Labortuch. Sterilisieren Sie dann jeden Deckzettel, indem Sie ihn durch die Flamme des Alkoholbrenners hin und her führen.

Wenn der Deckel abkühlt, bedecken Sie den 12 Millimeter Abdeckslip mit ca. 200 Mikrolitern und den 25 Millimeter Deckschlupf mit 800 Mikrolitern 0,1 molarem Natriumhydroxid. Nach fünf Minuten Natronlauge absaugen und den Deckel fünf Minuten an der Luft trocknen lassen, um einen gleichmäßigen Film zu bilden. Sobald die Deckblätter getrocknet sind, fügen Sie etwa 18 Mikroliter Aminopropyltriethoxysilan oder APTS auf einen 12-Millimeter-Deckzettel und 150 Mikroliter APTS auf einen 25-Millimeter-Deckzettel hinzu.

Aspirat greifen Sie auf APTS zu, damit das verbleibende APTS fünf Minuten lang trocknen kann. Später spülen Sie die Abdeckungsrutschen dreimal aus, indem Sie sie jedes Mal fünf Minuten lang in steriles deionisiertes Wasser tauchen. Bewegen Sie die gewaschenen Bezugsrutschen mit der reaktiven Seite nach oben in eine frische Petrischale.

Und behandeln Sie die Abdeckungsrutschen, indem Sie 30 Minuten lang genügend 0,5% Glutaraldehyd einweichen. Nach dem Absaugen des Glutaraldehyds spülen Sie die Abdeckungsrutschen einmal mit entionisiertem Wasser für drei Minuten ab und trocknen Sie die Abdeckung mit der reaktiven Seite nach oben an der Luft. Um die silikonisierten Abdeckzettel vorzubereiten, legen Sie die gleiche Anzahl von Abdeckzetteln wie die mit Aminosilan beschichteten Deckblätter in eine mit Parafolie ausgekleidete Petrischale.

Behandeln Sie dann die 12-Millimeter-Abdeckzettel mit 40 Mikrolitern und 25-Millimeter-Deckblättern mit 150 Mikrolitern Dichlormethansilan oder DCMS für fünf Minuten. Waschen Sie die Bezugsslips einmal für eine Minute mit sterilem entionisiertem Wasser, bevor Sie die reaktiven Cover-Slips mit der Vorderseite nach oben auf ein Labortuch legen. Zur Herstellung der Hydrogele werden frisch zubereitete Acrylamid-Gellösung auf die getrockneten Aminosilan-beschichteten Deckblätter pipettiert.

Mit einer gekrümmten Pinzette den DCMS-behandelten Deckslip sofort auf die Gellösung aufbringen, wobei die behandelte Seite die Gellösung berührt, wodurch die Gellösung zwischen zwei Deckblättern gewechselt wird. Sobald das Gel polymerisiert ist, trennen Sie den DCMS-behandelten Deckschlicker mit einer gekrümmten Pinzette, wobei das Gel an dem mit Aminosilan beschichteten Deckslip befestigt bleibt. Als nächstes tauchen Sie den 12-Millimeter-Deckslip mit dem angebrachten Hydrogel in eine vorgegebene 4-Well- oder 24-Well-Platte, die mit 500 Mikrolitern sterilem PBS oder deionisiertem Wasser bedeckt ist, und den 25-Millimeter-Abdeckungsrutsch in eine 6-Well-Platte, die mit zwei Millilitern sterilem PBS oder deionisiertem Wasser bedeckt ist, für 30 Minuten.

Nach dem Entfernen der überschüssigen Acrylamidlösung lagern Sie die Hydrogele 30 Minuten lang in sterilem PBS oder entionisiertem Wasser bei Raumtemperatur. Später saugen Sie PBS oder deionisiertes Wasser aus der Brunnenplatte ab, bevor Sie Sulfo-Succinimydyl- oder Sulfo-SUNPAH-Lösung hinzufügen, um das Gel vollständig zu bedecken. Und legen Sie die Gele mit der Lösung unter ein 15 Watt, 365 Nanometer ultraviolettes Licht, das für 10 Minuten unbedeckt ist.

Sammeln Sie so viel von der Sulfo-SANPAH pro Lösung wie möglich, indem Sie die Platte kippen. Und dann waschen Sie das Gel zwei- bis dreimal mit 15 Millimolar HEPES. Fügen Sie 15 Milligramm pro Milliliter Kollagen 1, verdünnt in 0,2% Essigsäure, zu jeder Vertiefung hinzu, die das Hydrogel enthält.

Und inkubieren Sie die Gele über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Führen Sie am nächsten Tag die Wäsche wie im Manuskript beschrieben durch, bevor Sie die Hydrogele mit PBS inkubieren, das 10% Pferdeserum und 5% FBS bei 37 Celsius und 5% Kohlendioxid enthält. Nach zwei Stunden Inkubation werden 500 Mikroliter steril gefiltertes DMEM mit jeweils 10% FBS und 1% Penicillin Streptomycin zugegeben und die Gele bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid gelagert.

Wenn die Zellkultur fertig ist, platten Sie ungefähr 1,5 mal 10 bis die vierte 09-1 Zelle pro Zentimeter Im Quadrat im Bazell-Medium. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Abdeckungsrutschen auf eine neue Platte zu transportieren, um falsche Signale von den Direkt auf der Platte gezüchteten Zellen zu minimieren. Fixieren Sie dann die Zellen mit 500 Mikrolitern 4% Paraformaldehyd für 10 Minuten, bevor Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern von 0,1% Triton X-100 bei Raumtemperatur behandeln.

Nach 15 Minuten gehen Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern 10% Eselserum. Färben Sie die Zellen auf F-Aktin mit Felodipin in einer Verdünnung von 1 bis 400 in 250 Mikrolitern 10% Eselserum, gefolgt von einer Inkubation mit DAPI für 10 Minuten. Waschen Sie die Zellen zwei Minuten lang mit PBS, bevor Sie drei bis vier Tropfen Montagemedium zu jeder Vertiefung geben.

Erfassen Sie auf einem Fluoreszenzmikroskop die Bilder von mindestens drei zufälligen Bildern pro Hydrogelprobe, die einzelne und verschmolzene Kanäle erzeugen. Bei der Steifigkeitsbewertung des Hydrogels durch Rasterkraftmikroskopie oder AFM war die Neigung der Kraftkurve für weiche Hydrogele schonend, da die erforderliche Kraft von der AFM-Sonde geringer war. Bei steifen Hydrogelen war die erzeugte Steigung jedoch viel steiler.

Die AFM-Messungen wurden dann verwendet, um die durchschnittliche Steifigkeit von Hydrogelen aus dem Elastizitätsmodul von Young in Kilopascal zu berechnen. Die Wachstumseigenschaften von P19- und 09-1-Zellen wurden in einem Kilopascal und 40 Kilopascal Hydrogelen von Kontroll- und modifizierten Gelsystemen beobachtet. Die 09-1-Zellen, die auf den ursprünglichen Gelsystemen gezüchtet wurden, führten zu einer höheren Anzahl toter Zellen.

Im Gegensatz dazu zeigten die 09-1-Zellen, die auf den modifizierten Gelsystemen gezüchtet wurden, ein gesundes Zellwachstum und eine ausreichende Bindung an das Hydrogelsubstrat mit wenig Zelldeck, das durch minimale runde Zellen angezeigt wurde. Die P19-Zellen, die auf beiden Hydrogelsystemen plattiert waren, zeigten einen Überschuss an runden schwimmenden Zellen und einen Mangel an Zellsubstratansätzen. Die Kompatibilität von Neuralleistenzellen oder NCCs mit dem modifizierten Hydrogelsystem wurde durch Immunfluoreszenzfärbung für AP-2 bewertet.

Ein signifikanter Anstieg der AP-2-Expression in 09-1 Zellen, die auf dem modifizierten Hydrogelsystem plattiert waren, wurde beobachtet. Darüber hinaus zeigten die 09-1-Zellen unterschiedliche Morphologien, die auf den Hydrogelen mit niedriger oder hoher Steifigkeit durch unterschiedliche Mengen der Spannungsfasern basierten. Die Anti-Vinculin-Expression in 09-1-Zellen, die auf dem 40-Kilopascal-Hydrogel gezüchtet wurden, war höher als die auf dem einen Kilopascal-Hydrogel gezüchteten Zellen, was widerspiegelt, dass die auf weicheren Substraten gezüchteten Zellen minimale fokale Additionskomplexe bilden als das steife Substrat.

Eine angemessene Wartezeit ist entscheidend für die Polymerisation der Hydrogele, da Acrylamide für die Zellen toxisch sind. Tauchen Sie die Hydrogele mindestens 30 Minuten lang in PBS oder entionisiertes Wasser, um bessere Ergebnisse zu erzielen.