Hyperaktives SchweinchenBac Transposase-vermittelte Keimbahntransformation im Herbst-Heerwurm, Spodoptera frugiperda
23. September 2021
Eine erfolgreiche Keimbahntransformation im Herbst-Heerwurm Spodoptera frugiperdawurde unter Verwendung von mRNA der hyperaktiven PiggyBac-Transposase erreicht.
Dieses Protokoll zeigt die Produktion von transgenem Fall Armyworm unter Verwendung eines PiggyBac-basierten Transformationssystems. Wir hoffen, dass diese Methoden der Verbesserung der Transformation zugute kommen werden, nicht nur beim Herbst-Heerwurm, sondern auch bei Lepidoptera-Insekten. Die hier beschriebene Methode macht die Keimbahntransformation von Lepidoptera-Schadinsekten effizient.
Das Verfahren wird von Dr. Xien Chen, einem Postdoktoranden in meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie, indem Sie 12 männliche Puppen und 12 weibliche Puppen in eine Box legen. Geben Sie eine 10% ige Saccharoselösung in die Box zur Fütterung von Erwachsenen.
Decken Sie die Box mit einem Papiertuch ab. Setzen Sie die Erwachsenen am zweiten Tag nach der Eklosion über Nacht intensivem Licht aus. Bringen Sie die Erwachsenen am dritten Tag nach der Eklosion an einen dunklen Ort.
Sammeln Sie die Embryonen innerhalb von zwei Stunden nach der Überposition. Fügen Sie Wassertropfen auf das Stück des Papiertuchs mit frischen Eiern hinzu, die in einer Petrischale auf Eis aufbewahrt werden. Übertragen Sie die Eier vorsichtig mit einem feinen Pinsel auf einen Glasträger und richten Sie sie nacheinander auf einem Glasobjektträger aus.
Halten Sie die Glasobjektträger mit den Eiern vor der Mikroinjektion auf Eis ausgerichtet. Injizieren Sie eine Mischung aus 200 Nanogramm pro Mikroliter PiggyBac-basiertem EGFP-exprimierendem Plasmid, 200 Nanogramm pro Mikroliter hyperaktiver PiggyBac-Transposase-mRNA und sterilem destilliertem Wasser in die Eier unter Verwendung des Kompensationsdrucks des automatisierten Mikroinjektors. Halten Sie die injizierten Eier bei 27 plus oder minus einem Grad Celsius, 60 plus oder minus 10% relativer Luftfeuchtigkeit bis zum Schlüpfen.
Füttern Sie die geschlüpften Larven künstlich und übertragen Sie jede Larve im frühen Quark- und Sternstadium in eine kleine Tasse. Sammeln Sie die Puppen und legen Sie ungefähr 150 weibliche und 150 männliche Puppen in einen Käfig. Hängen Sie mehrere 30 Zentimeter mal 15 Zentimeter große Papiertücher in den Käfig, um die Eier zu sammeln.
Sammeln Sie die Papiertücher täglich mit Eiern und bewahren Sie die Eier bis zum Schlüpfen unter geeigneten Bedingungen auf. Halten Sie die neugeborenen Larven fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius, um sie zu immobilisieren, und übertragen Sie sie dann auf eine eiskalte Platte. Screenen Sie die immobilisierten Neugeborenenlarven unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop.
Wählen Sie die EGFP-positiven Neugeborenen aus, heben Sie sie in etwa zwei Wochen bei 27 plus oder minus einem Grad Celsius in das Puppenstadium. Die in vitro synthetisierte hyperaktive PiggyBac-Transposase-mRNA wurde mit einem 1%igen Agarose-Gel nachgewiesen. Die PDS-injizierten Embryonen zeigten kein EGFP-Signal, während das EGFP-exprimierende Plasmid und die hyperaktive PiggyBac-Transposase-mRNA-injizierten Embryonen EGP-Fluoreszenz zeigten, was darauf hindeutet, dass die PiggyBac-Konstruktion erfolgreich war.
Die G1-Larven, die aus Eiern gewonnen wurden, die aus einer Selbstkreuzung von G0-Erwachsenen resultierten, zeigten ein starkes EGFP-Signal. Ein Fragment, das den Promotor und das EGFP-Fragment enthielt, wurde erfolgreich unter Verwendung der genomischen DNA, die aus den EGFP-positiven Larven isoliert wurde, als Vorlage amplifiziert. Das gleiche Fragment wurde jedoch nicht nachgewiesen, als genomische DNA aus den Wildtyplarven als Vorlage isoliert wurde.
Die Eier für die Mikroinjektion sollten so frisch wie möglich sein und müssen vor der Mikroinjektion immer auf Eis aufbewahrt werden, um ihre Entwicklung zu verlangsamen. Diese Technik ebnet den Forschern den Weg, Fragen in der funktionellen Genomik von Schädlingsinsekten zu beantworten und genetische Bekämpfungsmethoden für diesen globalen Schädling zu entwickeln.
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Übersicht
Diese Studie demonstriert ein Protokoll für eine erfolgreiche Keimbahn-Transformation bei der Maiszünslarve, Spodoptera frugiperda, unter Verwendung eines auf piggyBac basierenden Transformationssystems. Die Methode verspricht eine verbesserte Transformations-Effizienz bei Schmetterlingsraupen und fördert die funktionelle Genomforschung in diesen Organismen.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Gentechnik bei Schadinsekten
- Methoden der Transformationsbiologie
- Anwendungen der Funktionalen Genomik
Hintergrund
- Die Herbstheuschrecke ist ein bedeutender landwirtschaftlicher Schädling.
- Das piggyBac-Transposon-System ist bekannt für seine Effizienz bei der Genübertragung.
- Die Verbesserung der Keimbahntransformation ist entscheidend für Strategien zur Schädlingsbekämpfung.
Verwendete Methoden
- Mikroinjektion von Eiern mit piggyBac-Plasmid und mRNA
- Spodoptera frugiperda als biologisches Modell
- Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung transgener Larven
Hauptergebnisse
- Die erfolgreiche Expression von EGFP in transgenen Larven zeigte die Funktionalität des piggyBac-Systems.
- Die EGFP-Expression wurde durch Amplifikation von genomischer DNA bestätigt, wodurch transgene von wildtypischen Larven unterschieden werden konnten.
- Die Transformationsmethode erwies sich als effizient zur Erzeugung genetisch veränderter Schadinsekten.
Schlussfolgerungen
- Die Studie etabliert eine robuste Methode für die Keimbahntransformation in Spodoptera frugiperda.
- Die Ergebnisse tragen zur Weiterentwicklung genetischer Bekämpfungsmaßnahmen gegen landwirtschaftliche Schädlinge bei.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Branchenrelevanz
Die Herstellung einer effizienten Keimbahn-Transformation bei landwirtschaftlichen Schädlingen wie der Herbstheuschrecke ermöglicht die funktionelle Genomik zur Zielvalidierung und mechanistischen Ent风险bewertung in Schädlingsbekämpfungsstrategien. Dieses Protokoll unterstützt die frühe Entdeckung, indem es ein skalierbares System bereitstellt, um die Genfunktion zu untersuchen und phänotypische Ergebnisse in einem für Krankheiten relevanten Insektenmodell zu bewerten. Eine erfolgreiche Transgenese erleichtert die nachgeschaltete Screening- und Biomarker-Entdeckung für genetische Schädlingsmanagementstrategien.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die funktionelle Untersuchung von Schädlingsgenen zur Validierung von Zielstrukturen für genetische Kontrollstrategien.
- Operationaler Wert: Bietet ein reproduzierbares System zur Erzeugung transgener Linien für eine konsistente Beurteilung von Zielstrukturen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem genetische Störungen mit phänotypischen Effekten in einem Schädlingsmodell verknüpft werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt fluoreszierende Reporterpflinien für die Hochdurchsatz-Screening genetischer Störungen.
- Operativer Wert: Ermöglicht standardisierte PCR-basierte Genotypisierung und TAIL-PCR zur Validierung der Insertionsstelle.
- Eignung für Assays: Erzeugt stabile transgene Stämme, die für die Wirkstoff-Screening und phänotypische Assays geeignet sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet die genetische Validierung in der Entdeckungsphase mit der präklinischen Bewertung genetischer Kontrollmechanismen.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht die Beurteilung der Genessenzialität und des phänotypischen Effekts vor dem Einsatz im Feld.
- Biomarker-Korrelation: Unterstützt die Identifizierung genetischer Marker, die mit Anfälligkeit oder Resistenzmerkmalen assoziiert sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie die Target-Validierung durch Transgenese ermöglicht, die Leitstrukturfeststellung mittels phänotypischer Bildschirmung unterstützt und präklinische Entscheidungen anhand stabiler genetischer Modelle informiert.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem sie das Ausschalten oder die Überexpression von Genen in der Maiszünsler-Raupe ermöglicht, um die Relevanz von Zielstrukturen zu bewerten.
- Screening: Erzeugt standardisierte transgene Linien für die reproduzierbare Untersuchung genetischer oder chemischer Modulatoren.
- Analytik: Bietet quantitative PCR- und Fluoreszenzsignale, um die Integration und Expressionslevel von Transgenen zu messen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung von Genfunktionen mit der präklinischen Bewertung genetischer Schädlingsbekämpfungsstrategien.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Transgenese-Plattform, die auf verschiedene Schmetterlings-Schädlinge anwendbar ist und die Validierung von Zielstrukturen über das gesamte Portfolio hinweg ermöglicht.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung durch direkte genetische Manipulation in einem Schädlingsmodell.
- Operationaler Wert: Bietet ein skalierbares, reproduzierbares Transgenese-System mit standardisierten Mikroinjektions- und Screening-Protokollen.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch Verringerung biologischer Unsicherheiten hinsichtlich der Essenzialität des Targets.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Targets basierend auf der in-vivo-Phänotyp-Validierung in einem Schädlingsmodell.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Insektenembryologie und Mikroinjektionstechniken.
- Benötigt einen automatisierten Mikroinjektor, ein Fluoreszenz-Stereo-Mikroskop und PCR-Ausrüstung zur Validierung.
- Setzt standardisierte Protokolle für die Sammlung von Embryonen, Injektionsbedingungen und die transgene Selektion über verschiedene Teams hinweg voraus.
- Erfordert die Anpassung von Temperatur-, Feuchtigkeits- und Fütterungsprotokollen an verschiedene Lepidopterenarten.
- Hängt von der Qualität und Frische der Embryonen ab, wobei die Effizienz der Mikroinjektion vom Entwicklungszeitpunkt beeinflusst wird.
