Name: Hyperaktives SchweinchenBac Transposase-vermittelte Keimbahntransformation im Herbst-Heerwurm, Spodoptera frugiperda (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Erfahren Sie die Keimbahntransformation bei Spodoptera frugiperda mit hyperaktiver piggyBac-Transposase. Diese Methode ermöglicht effiziente genetische Modifikation von Schädlingen für die funktionelle Genomik.

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Die gemeldete Forschung wird von der National Science Foundation I / UCRC, dem Center for Arthropod Management Technologies, unter der Fördernummer IIP-1821936 und von Industriepartnern, der Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant Nr. 2019-67013-29351 und dem National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture (2019-67013-29351 und 2353057000) unterstützt.

1. In vitro Synthese von hyPBase mRNA
HINWEIS: Die vollständige Codierungssequenz der hyPBase-Sequenz wurde synthetisiert und in einen pTD1-Cas9-Vektor eingefügt (siehe Materialtabelle),um das pTD1-hyPBase-Konstrukt zu erzeugen, das eine hyPBase-exprimierende Kassette enthält, T7-Promotor: Polyhedrin-5' UTR: hyPBase: Polyhedrin-3' UTR: Poly (A). Die vollständige Sequenz des pTD1-hyPBase-Konstrukts ist im Ergänzenden Material enthalten.
<ol><li>Vorbereitung der Schablone für die In-vitro-Synthese<ol>
<li>Führen Sie eine PCR-Reaktion durch, um die hyPBase-exprimierende Kassette zu amplifizieren, indem Sie einen Forward-Primer, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3' und einen Reverse Primer 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', eine High-Fidelity-Polymerase und ein pTD1-hyPBase-Plasmid als Vorlage verwenden. HINWEIS: Die PCR-Reaktion (Endvolumen von 50 μL) enthält 5,0 μL 10x Reaktionspuffer, 4,0 μL 10 mM Desoxynukleosidtriphosphat (dNTP), 1,0 μL Plasmid (50 μg/μL), 1,0 μL High-Fidelity-Polymerase, jeweils 1,0 μL 10 μM Forward- und Reverse-Primer und 33 μL nukleasefreies Wasser. Die Einstellungen waren wie folgt: eine anfängliche Inkubation von 95 °C für 3 min, gefolgt von 35 Zyklen von 98 °C für 10 s, 60 °C für 15 s und 68 °C für 2 min.</li>
		<li>Überprüfen Sie das PCR-Produkt auf einem 1% igen Agarosegel bei 120 V in frischem Tris-Acetat-Ethylendiamin-Tetraessigsäure (TAE) -Puffer für 30 min und reinigen Sie das Produkt mit dem Gelextraktionskit. HINWEIS: Verwenden Sie nicht das PCR-Produktreinigungskit. Selbst eine Spurenmenge des pTD1-hyPBase-Plasmids verringert die Effizienz der In-vitro-Synthese signifikant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
In-vitro-Synthese von hyPBase-mRNA mit einem kommerziellen Kit<ol>
<li>Die gefrorenen Reagenzien vollständig auftauen, das Enzym und die 2x NTP/CAP-Lösung auf Eis aufbewahren und den aufgetauten 10x Reaktionspuffer bei Raumtemperatur belassen.</li>
		<li>Montieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur unter Zugabe der folgenden Komponenten: 2x NTP/CAP-Lösung: 10 μL; 10x Reaktionspuffer: 2 μL; Template DNA: 0,1-0,2 μg; Enzymmischung: 2 μL; Nukleasefreies Wasser bis 20 μL.</li>
		<li>Mischen Sie die Reagenzien gründlich, indem Sie die Mischung vorsichtig auf und ab pipettieren und bei 37 ° C für 2-4 h inkubieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rückgewinnung synthetisierter mRNA durch Lithiumchlorid-Fällung<ol>
<li>Fügen Sie 30 μL LiCl Precipitation Solution hinzu, mischen Sie gründlich durch Flicken des Röhrchens und halten Sie es dann bei -20 ° C für ≥ 30 min.</li>
		<li>Zentrifugiere bei 4 °C für 15 min mit der maximalen Geschwindigkeit und entferne vorsichtig den Überstand.</li>
		<li>Waschen Sie das Pellet einmal mit 1 ml 70% Ethanol, zentrifugieren Sie es erneut und entfernen Sie den Überstand vorsichtig.</li>
		<li>Trocknen Sie das Pellet bei Raumtemperatur für 1-2 min und resuspenieren Sie das Pellet dann mit 20-40 μL nukleasefreiem Wasser.</li>
		<li>Verdünnen Sie 1 μL mRNA-Lösung mit 9 μL nukleasefreiem Wasser. Nehmen Sie 2 μL, um die mRNA-Konzentration zu bestimmen, und verwenden Sie 8 μL, um die mRNA-Qualität auf einem 1% igen Agarosegel bei 100 V in frischem TAE-Puffer für 40 min zu überprüfen.</li>
		<li>Aliquotieren Sie die mRNA-Lösung und lagern Sie sie gefroren bei -70 °C bis zu einem Jahr. HINWEIS: Trocknen Sie das mRNA-Pellet nicht vollständig; Es kann schwieriger sein, es in Wasser aufzulösen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Mikroinjektion
<ol><li>Eiersammlung<ol>
<li>Legen Sie 12 männliche Puppen und 12 weibliche Puppen in eine 15 cm x 15 cm x 10 cm große Box. Decken Sie die Box mit einem Papiertuch ab. Geben Sie eine 10% ige Saccharoselösung in die Box zur Fütterung von Erwachsenen.</li>
		<li>Setzen Sie die Erwachsenen am Tag 2 nach der Eklosion über Nacht intensivem Licht aus.</li>
		<li>Am Tag 3 nach der Eklosion bringen Sie die Erwachsenen von Schritt 2.1.2 an einen dunklen Ort. Sammeln Sie die Embryonen innerhalb von 2 h nach der Eiablage.</li>
		<li>Fügen Sie Wassertropfen zu dem Stück eines Papiertuchs mit frischen Eiern hinzu, die in einer Petrischale auf Eis aufbewahrt werden. Übertragen Sie die Eier vorsichtig mit einem feinen Pinsel auf einen Glasträger und richten Sie sie nacheinander auf einem Glasobjektträger aus. Bewahren Sie die Glasobjektträger mit den ausgerichteten Eiern vor der Mikroinjektion auf Eis auf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroinjektionsaufbau<ol>
<li>Injizieren Sie eine Mischung aus einem transgenen verstärkten grün fluoreszierenden Protein (EGFP)-exprimierenden Plasmid (200 ng/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, hyPBase mRNA (200 ng/μL) und sterilem destilliertem Wasser unter Verwendung des Kompensationsdrucks des automatisierten Mikroinjektors in die Eier (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Die injizierten Eier bis zum Schlüpfen bei 27 ± 1 °C, 60 ± 10% relativer Luftfeuchtigkeit aufbewahren.</li>
		<li>Füttern Sie die geschlüpften Larven künstlich und übertragen Sie jede Larve im frühen3. Stadium des Stadiums (~ 6 mm lang und die Körperfarbe wird schwarz).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Fluoreszenzscreening und genetische Kreuzung
<ol><li>Sammeln Sie die Puppen und legen Sie ~ 150 weibliche Puppen und ~ 150 männliche Puppen in einen 35 cm x 35 cm x 35 cm großen Käfig. Hängen Sie mehrere Stücke Papiertücher (~ 30 cm x 15 cm) in den Käfig, um die Eier zu sammeln.</li>
	<li>Sammeln Sie die Papiertücher täglich mit Eiern und bewahren Sie die Eier bis zum Schlüpfen bei 27 ± 1 °C, 60 ± 10% relativer Luftfeuchtigkeit auf.</li>
	<li>Halten Sie die neugeborenen Larven 5 Minuten lang bei 4 ° C, um sie zu immobilisieren, und übertragen Sie sie dann auf eine eiskalte Platte.</li>
	<li>Screenen Sie die immobilisierten Neugeborenenlarven unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Wählen Sie die EGFP-positiven Neugeborenen aus, heben Sie sie in ~ 2 Wochen bei 27 ± 1 ° C in das Puppenstadium und trennen Sie sie nach Geschlecht nach den Phänotypunterschieden an den ventralen Abdomensegmenten. HINWEIS: Die weibliche Puppe hat eine schlitzartige Genitalöffnung am achten Bauchsegment und die Kopfränder des neunten und zehnten Segments, die sich zur Genitalöffnung hin krümmen. Die Genitalöffnung der männlichen Puppe hat eine leichte Erhöhung auf dem neunten Bauchsegment.</li>
	<li>Legen Sie die EGFP-positiven Puppen und die Wildtyppuppen des anderen Geschlechts in ein Männchen:Weibchen-Verhältnis von 1:1 in einen Käfig. Sib-Kreuzung der EGFP-exprimierenden Erwachsenen, um die folgenden Generationen zu produzieren.</li>
</ol>4. PCR-Nachweis der transgenen Insertion
<ol><li>Extrahieren Sie genomische DNA aus den Wildtyp- und EGFP-positiven einzelnen Larven mit einem kommerziellen genomischen DNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Durchführung einer PCR-Reaktion unter Verwendung der genomischen DNA als Vorlage; eine Vorwärtsprimierung, 5'- acgtacgctcctcgttccgttccgttc-3' in der ie1 Promoter-Region; und ein umgekehrter Primer, 5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3', der sich im EGFP-Bereich des Transformationsvektors befindet.</li>
	<li>Richten Sie jede PCR-Reaktion (Endvolumen von 40 μL) so ein, dass sie 20 μL der Polymerasemischung, 1,0 μL genomische DNA (40 μg/μL), jeweils 1,0 μL 10 μM Vorwärts- und Rückwärtsprimer und 17 μL nukleasefreies Wasser enthält. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: eine anfängliche Inkubation von 95 °C für 3 min, gefolgt von 35 Zyklen von 95 °C für 20 s, 56 °C für 20 s und 68 °C für 40 s Einstellungen.</li>
	<li>Überprüfen Sie die PCR-Produkte auf einem 1% igen Agarosegel bei 120 V für 30 min.</li>
</ol>5. Bestimmung der transgenen Einfügestelle
<ol><li>Führen Sie eine hocheffiziente TAIL-PCR unter Verwendung genomischer DNA als Vorlage durch, um die Integrationsstelle der Transgen-Insertion in die EGFP-positiven Insekten zu bestimmen.<ol>
<li>Führen Sie die PCR-Reaktionen gemäß den an anderer Stelle beschriebenen Schrittendurch 9.<ol>
<li>Verwenden Sie drei Primer, P1'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3' und P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgccggattcgcgct-3', die spezifisch für den piggyBac-Vektor sind, in den 3 Runden der PCR-Reaktion.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sequenzieren Sie die endgültigen PCR-Produkte, um den Integrationsort zu bestimmen.</li>
</ol>

<ol><li>Gui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+transcriptomic+analysis+unveils+population+evolution+and+development+of+pesticide+resistance+in+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda.</a> Protein Cell. , (2020).</li>
<li>Montezano, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+plants+of+Spodoptera+frugiperda+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29+in+the+Americas%5BTitle%5D)+AND+%22African+Entomology%22%5BJournal%5D)">Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas.</a> African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+ecdysone+oxidase+impairs+tissue+degeneration+in+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513(2015).</li>
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<li>Otte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+genetic+transformation+rates+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improving genetic transformation rates in honeybees.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16534(2018).</li>
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<li>Tamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).</li>
<li>Handler, A. M., Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+Drosophila+melanogaster+with+the+piggyBac+transposon+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector.</a> Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).</li>
<li>Dreyfus, M., Régnier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly+%28A%29+tail+of+mRNAs%3A+bodyguard+in+eukaryotes%2C+scavenger+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria.</a> Cell. 111 (5), 611-613 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die geringe Transpositionsrate und die Schwierigkeit, transgene Komponenten in frische Embryonen zu liefern, begrenzen den Erfolg der Keimbahntransformation bei vielen Nicht-Modellinsekten, insbesondere bei Lepidoptera. Um die Keimbahntransformationsrate zu erhöhen, wurde eine hyperaktive Version der am weitesten verbreiteten PiggyBac-Transposase (hyPBase) entwickelt7,10. Bis heute wird eine erfolgreiche Keimbahntransformation bei Lepidoptera-Insekten ha...

Der Herbst-Heerwurm (FAW), Spodoptera frugiperda,stammt aus tropischen und subtropischen Regionen Amerikas. Derzeit ist dies ein verheerender Insektenpflanzenfresser in mehr als 100 Ländern weltweit1. FAW-Larven ernähren sich von mehr als 350 Wirtspflanzen, darunter einige wichtige Grundnahrungsmittel2. Die starke Migrationsfähigkeit der FAW-Erwachsenen trägt zu ihrer jüngsten raschen Ausbreitung von Amerika auf andere Orte bei1,2. Infolgedessen bedroht dieses Insekt jetzt die Ernährungssicherheit auf internationaler Ebene. Die Anwendung neuer Technologien kann fortgeschrittene Studien in FAW erleichtern und neuartige Strategien zur Bekämpfung dieses Schädlings bieten.
Die Transformation der Keimbahn von Insekten wurde verwendet, um die Genfunktion zu untersuchen und transgene Insekten für die genetische Kontrolle zu erzeugen3,4. Unter den verschiedenen Methoden, die verwendet werden, um eine genetische Transformation bei Insekten zu erreichen, ist die auf PiggyBac-Elementen basierende Methode die am häufigsten verwendete Methode5. Aufgrund der geringen Transpositionsrate ist es jedoch immer noch schwierig, die Transgenese bei Nicht-Modellinsekten durchzuführen. Vor kurzem wurde eine hyperaktive Version der piggyBac Transposase (hyPBase) entwickelt6,7. Die Keimbahntransformation wurde kürzlich in FAWerreicht 8, was der erste Bericht ist, der die hyPBase bei Lepidoptera-Insekten verwendete. In diesem Bericht werden detaillierte Informationen zum Einsatz von hyPBase mRNA bei der Erzeugung transgener FAW beschrieben. Die hier beschriebene Methode könnte angewendet werden, um die Transformation anderer Lepidoptera-Insekten zu erreichen.

<table><tbody><tr><td>1,5" Dental Watterollen</td><td>PlastCare USA</td><td>8542025591</td><td>REARING</td></tr><tr><td>1 oz Souffle Cup Deckel</td><td>DART</td><td>PL1N</td><td></td></tr><tr><td>1 oz Souffle Cups</td><td>DART</td><td>P100N</td><td>REARING</td></tr><tr><td>48 oz Kunststoff Deli Behälter</td><td>Genpack</td><td>AD48</td><td>REARING</td></tr><tr><td>Add-on Filterset (Grün)</td><td>NightSea LLC</td><td>SFA-BLFS-GR</td><td>SCREENING</td></tr><tr><td>Borosilikatglas</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-50-10</td><td>INJEKTION</td></tr><tr><td>Borosilikatglas</td><td>SUTTER INSTRUMENT</td><td>BF-100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Präparierfernrohr</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td>SCREENING</td></tr><tr><td>Federleichte Pinzette</td><td>BioQuip</td><td>4750</td><td>ZUCHT</td></tr><tr><td>Dachrinnenschutz</td><td>ThermWell Produkte</td><td>VX620</td><td>AUFZUCHT</td></tr><tr><td>Invertiert Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>INJEKTION</td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td>Narishige</td><td>IM-300</td><td>INJEKTION</td></tr><tr><td>Mikropipette Abzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td>INJEKTION</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>VWR</td><td>16004-22</td><td>INJEKTION</td></tr><tr><td>NightSea Full System</td><td>NightSea LLC</td><td>SFA-RB-DIM</td><td>SCREENING</td></tr><tr><td>Stickstoffgas</td><td>AWG/ Scott-Gross</td><td>NI 225</td><td>INJEKTION</td></tr><tr><td>Papierhandtücher</td><td>Bounty</td><td>&nbsp; 43217-45074</td><td>REARING</td></tr><<tr><td>em>Spodoptera frugiperda Artificial Diet</td><td>Southland Products, Inc</td><td>N/A [Anfrage Species/Menge]</td><td>REARING</td></tr><tr><td>Spodoptera frugiperda Eggs</td><td>Benzon Research, Inc</td><td>N/A [Anfrage Species/Menge]</td><td>REARING</td></tr><tr><td>Taq MasterMix</td><td></td><td></td><td>Polymerase Mischung</td></tr></tbody></table>

hyperaktives schweinchenbac transposase-vermittelte keimbahntransformation im herbst-heerwurm, spodoptera frugiperda

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Die stabile Insertion genetischer Fracht in Insektengenomen unter Verwendung transponierbarer Elemente ist ein leistungsfähiges Werkzeug für funktionelle genomische Studien und die Entwicklung genetischer Schädlingsbekämpfungsstrategien. Das am häufigsten verwendete transponierbare Element in der Insektentransformation ist PiggyBac, und die PiggyBac-basierteKeimbahntransformation wurde erfolgreich in Modellinsekten durchgeführt. Es ist jedoch immer noch eine Herausforderung, diese Technologie bei Nicht-Modell-Insekten einzusetzen, zu denen auch landwirtschaftliche Schädlinge gehören. Dieser Artikel berichtet über die Keimbahntransformation eines globalen landwirtschaftlichen Schädlings, des Herbstheerwurms (FAW), Spodoptera frugiperda,unter Verwendung der hyperaktiven PiggyBac-Transposase (hyPBase).
In dieser Arbeit wurde die hyPBase mRNA hergestellt und anstelle von Helferplasmid in embryonalen Mikroinjektionen verwendet. Diese Veränderung führte zur erfolgreichen Generierung von transgenem FAW. Darüber hinaus werden auch die Methoden des Screenings transgener Tiere, des PCR-basierten Schnellnachweises der Transgeninsertion und der thermischen asymmetrischen Interlaced PCR (TAIL-PCR)-basierten Bestimmung der Integrationsstelle beschrieben. Daher stellt dieses Papier ein Protokoll zur Herstellung von transgenem FAW vor, das die PiggyBac-basierteTransgenese bei FAW und anderen Lepidoptera-Insekten erleichtern wird.

Ein Konstrukt zur Expression des hyPBase-haltigen T7-Promotors: Polyhedrin-5'UTR: hyPBase: Polyhedrin-3'UTR: Poly(A)-Signal wurde erzeugt (Abbildung 1A) und als ~2,2 kb PCR-Fragment zur Synthese von hyPBase mRNA in vitro amplifiziert (Abbildung 1B). Dann wurde die hyPBase-mRNA hergestellt und einer Agarosegelelektrophorese unterzogen. Die mRNA der erwarteten Größe (~1,1 kb Bande) wurde auf einem 1% igen Agarosegel nachgewiesen (Abbi...

Eine erfolgreiche Keimbahntransformation im Herbst-Heerwurm Spodoptera frugiperdawurde unter Verwendung von mRNA der hyperaktiven PiggyBac-Transposase erreicht.

Hyperaktives SchweinchenBac Transposase-vermittelte Keimbahntransformation im Herbst-Heerwurm, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

Dieses Protokoll zeigt die Produktion von transgenem Fall Armyworm unter Verwendung eines PiggyBac-basierten Transformationssystems. Wir hoffen, dass diese Methoden der Verbesserung der Transformation zugute kommen werden, nicht nur beim Herbst-Heerwurm, sondern auch bei Lepidoptera-Insekten. Die hier beschriebene Methode macht die Keimbahntransformation von Lepidoptera-Schadinsekten effizient.Das Verfahren wird von Dr. Xien Chen, einem Postdoktoranden in meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie, indem Sie 12 männliche Puppen und 12 weibliche Puppen in eine Box legen. Geben Sie eine 10% ige Saccharoselösung in die Box zur Fütterung von Erwachsenen.Decken Sie die Box mit einem Papiertuch ab. Setzen Sie die Erwachsenen am zweiten Tag nach der Eklosion über Nacht intensivem Licht aus. Bringen Sie die Erwachsenen am dritten Tag nach der Eklosion an einen dunklen Ort.Sammeln Sie die Embryonen innerhalb von zwei Stunden nach der Überposition. Fügen Sie Wassertropfen auf das Stück des Papiertuchs mit frischen Eiern hinzu, die in einer Petrischale auf Eis aufbewahrt werden. Übertragen Sie die Eier vorsichtig mit einem feinen Pinsel auf einen Glasträger und richten Sie sie nacheinander auf einem Glasobjektträger aus.Halten Sie die Glasobjektträger mit den Eiern vor der Mikroinjektion auf Eis ausgerichtet. Injizieren Sie eine Mischung aus 200 Nanogramm pro Mikroliter PiggyBac-basiertem EGFP-exprimierendem Plasmid, 200 Nanogramm pro Mikroliter hyperaktiver PiggyBac-Transposase-mRNA und sterilem destilliertem Wasser in die Eier unter Verwendung des Kompensationsdrucks des automatisierten Mikroinjektors. Halten Sie die injizierten Eier bei 27 plus oder minus einem Grad Celsius, 60 plus oder minus 10% relativer Luftfeuchtigkeit bis zum Schlüpfen.Füttern Sie die geschlüpften Larven künstlich und übertragen Sie jede Larve im frühen Quark- und Sternstadium in eine kleine Tasse. Sammeln Sie die Puppen und legen Sie ungefähr 150 weibliche und 150 männliche Puppen in einen Käfig. Hängen Sie mehrere 30 Zentimeter mal 15 Zentimeter große Papiertücher in den Käfig, um die Eier zu sammeln.Sammeln Sie die Papiertücher täglich mit Eiern und bewahren Sie die Eier bis zum Schlüpfen unter geeigneten Bedingungen auf. Halten Sie die neugeborenen Larven fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius, um sie zu immobilisieren, und übertragen Sie sie dann auf eine eiskalte Platte. Screenen Sie die immobilisierten Neugeborenenlarven unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop.Wählen Sie die EGFP-positiven Neugeborenen aus, heben Sie sie in etwa zwei Wochen bei 27 plus oder minus einem Grad Celsius in das Puppenstadium. Die in vitro synthetisierte hyperaktive PiggyBac-Transposase-mRNA wurde mit einem 1%igen Agarose-Gel nachgewiesen. Die PDS-injizierten Embryonen zeigten kein EGFP-Signal, während das EGFP-exprimierende Plasmid und die hyperaktive PiggyBac-Transposase-mRNA-injizierten Embryonen EGP-Fluoreszenz zeigten, was darauf hindeutet, dass die PiggyBac-Konstruktion erfolgreich war.Die G1-Larven, die aus Eiern gewonnen wurden, die aus einer Selbstkreuzung von G0-Erwachsenen resultierten, zeigten ein starkes EGFP-Signal. Ein Fragment, das den Promotor und das EGFP-Fragment enthielt, wurde erfolgreich unter Verwendung der genomischen DNA, die aus den EGFP-positiven Larven isoliert wurde, als Vorlage amplifiziert. Das gleiche Fragment wurde jedoch nicht nachgewiesen, als genomische DNA aus den Wildtyplarven als Vorlage isoliert wurde.Die Eier für die Mikroinjektion sollten so frisch wie möglich sein und müssen vor der Mikroinjektion immer auf Eis aufbewahrt werden, um ihre Entwicklung zu verlangsamen. Diese Technik ebnet den Forschern den Weg, Fragen in der funktionellen Genomik von Schädlingsinsekten zu beantworten und genetische Bekämpfungsmethoden für diesen globalen Schädling zu entwickeln.

hyperactive-piggybac-transposase-mediated-germline-transformation

Research

Forschung

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Biology

Biologie

Erzeugung von transgenen C. elegans Nach Biolistic Transformation

In Modell-Organismen, kann Transgenese manipulieren Genfunktionen während RNAi kann Knockdown spezifische mRNA-Transkripte 1-2. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Techniken benötigt, um stabil zu übertragen DNA und vorübergehend doppelsträngige RNA in die necromenic Nematoden Einführung...

RNAi-vermittelte Gene Knockdown und Transgenese durch Mikroinjektion in die Necromenic Nematode Pristionchus pacificus</em

Die Mittelmeerfruchtfliege Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) ist ein weltweiter Schädling der Landwirtschaft. Ein tieferes Verständnis ihrer Biologie ist der Schlüssel, um die Populationen der Medfly zu kontrollieren und so die wirtschaftlichen Auswirkungen zu reduzieren. Die Mikroinjektion von Embryonen ist ein grundlegendes Instrument, das sowohl die Transformation der Keimbahn als auch umgekehrte genetische Studien bei dieser Spezies ermöglicht.

Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,<em&gt; Mittelmeerfruchtfliege</em

Dieses Protokoll zeigt , wie fluoreszierend markiert, genetisch definierten klonalen Tumoren im Auge von Drosophila melanogaster / antennal Imaginalscheiben (EAD) zu erzeugen. Es beschreibt, wie der EAD und Gehirn aus dem dritten Larvenstadium zu sezieren und wie sie zu verarbeiten, zu visualisieren und zu Veränderungen der Genexpression und Tumorinvasivität quantifizieren.

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Abbilden der Morphogenese von Insekten Embryonen mit Lichtbogen basierende Fluoreszenzmikroskopie wurde Stand der Technik geworden. Dieses Protokoll beschreibt und vergleicht drei Befestigungstechniken geeignet für Tribolium castaneum Embryonen führt zwei neue maßgeschneiderte transgenen Linien gut geeignet für die Echtzeit- Bildgebung, diskutiert wesentliche Qualitätskontrollen und zeigt den aktuellen experimentellen Beschränkungen.

Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie lebender oder fixiert und gefärbt<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embry

Hier präsentieren wir Protokolle für sammeln und microinjecting precellular westlichen Mais Maiswurzelbohrer Embryonen zum Zwecke der Ausführung der funktionellen Genomik Assays wie Keimbahn Transformation und CRISPR/Cas9-Genom-Bearbeitung.

Mikroinjektion der westliche Maiswurzelbohrer Diabrotica Virgifera Virgifera, Embryonen für die Keimbahn Transformation oder CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Injektion von Cricket-Eiern vor, eine Technik, die als grundlegende Methode in vielen Experimenten im Cricket dient, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, RNA-Interferenz und genomische Manipulation.

Injektion von Gryllus bimaculatus Eiern

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Aufzucht, Mikroinjektion von Eiern und für eine effiziente Paarung des Feuerbres Thermobia domestica zur Erzeugung und Aufrechterhaltung mutierter Stämme nach der Genombearbeitung.

Ei-Mikroinjektion und effiziente Mating für die Genombearbeitung im Firebrat Thermobia domestica

Hier wird ein Protokoll der Helicoverpa armigera (Hübner) Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutantenidentifizierung vorgestellt, das durch CRISPR/Cas9-Genom-Editing erstellt wurde. Mutierte Insekten ermöglichen die weitere Erforschung der Genfunktion und Interaktion zwischen verschiedenen Genen in vivo.

Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutanten-Identifizierung von CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Das funktionelle genomische Toolkit für die parasitären Nematoden Strongyloides stercoralis und Strongyloides ratti umfasst Transgenese, CRISPR/Cas9-vermittelte Mutagenese und RNAi. Dieses Protokoll wird zeigen, wie intragonadale Mikroinjektion verwendet werden kann, um Transgene und CRISPR-Komponenten in S. stercoralis und S. ratti einzuführen.

Erzeugung von Transgenics und Knockouts in Strongyloides-Spezies durch Mikroinjektion

Erfahren Sie die Keimbahntransformation bei Spodoptera frugiperda mit hyperaktiver piggyBac-Transposase. Diese Methode ermöglicht effiziente genetische Modifikation von Schädlingen für die funktionelle Genomik.

Hyperaktives SchweinchenBac Transposase-vermittelte Keimbahntransformation im Herbst-Heerwurm, Spodoptera frugiperda

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