Name: Messung des Membranlipidumsatzes mit dem pH-empfindlichen Fluoreszenz-Lipid-Analogon ND6 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Lernen Sie die Messung des Membranlipidumsatzes mit dem pH-empfindlichen Fluoreszenz-Analogon ND6 in lebenden Neuronen. Diese Methode ermöglicht direkte Beobachtung von Exo- und Endozytose-Prozessen.

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Diese Arbeit wurde durch das Florida Atlantic University Office of Undergraduate Research and Inquiry Grant (M.J.S.), das Florida Department of Health Ed and Ethel Moore Pilot Grant 20A17 (Q.Z.), das Alzheimer's Association Grant AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.) und das NIA R21 Grant AG061656-01A1 (Q.Z.) unterstützt.

Das folgende Protokoll enthält (1) ein vereinfachtes Verfahren zur Etablierung von Hippocampus- und Kortikalkulturen der Maus auf der Grundlage eines etablierten Protokolls22, (2) eine kurze Einführung in einen Epifluoreszenzmikroskop-Aufbau für lebende Neuronen, (3) eine detaillierte Beschreibung der Beladung und Abbildung von ND6 in Mausneuronen, (4) eine Diskussion über die Quantifizierung des Membrantransports durch ND6-Signal. Alle Verfahren folgen den Biosicherheits- und IACUC-Richtlinien der Florida Atlantic University. Die Synthese von ND6 wurde bereits beschrieben20.
1. Präparation von Hippocampus- und Kortikalkulturen der Maus
HINWEIS: Wenn nicht anders angegeben, müssen alle Schritte in einer Laminar-Flow-Haube der Biosicherheitsstufe 2 durchgeführt werden. Sterilisieren Sie alle Werkzeuge und Materialien.
<ol><li>Verwenden Sie eine Pinzette der Größe 5, um Glasdeckgläser in Multiwell-Kulturplatten zu legen. HINWEIS: Eine 24-Well-Platte ist beispielsweise ideal für 12-mm-Deckgläser <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> .</li>
	<li>Fügen Sie das entsprechende Volumen an extrazellulären Matrizen hinzu, um die Zellkulturoberfläche zu beschichten (z. B. 75 μl Basalmembranmatrixlösung pro 12 mm <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> Deckglas; siehe Materialtabelle)</li>
	<li>Legen Sie die vorbereiteten Platten für 1-4 Stunden in den Gewebekultur-Inkubator (5 % CO2, 100 % Luftfeuchtigkeit und 37 °C), um die Vernetzung der Basalmembranmatrix zu ermöglichen.</li>
	<li>Opfern Sie die Tiere, öffnen Sie den Schädel und geben Sie das gesamte Gehirn in eine 35-mm-Petrischale mit 3 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), die 20% fötales Rinderserum (H+20) enthält. Schneiden Sie das Gehirn entlang der Mittellinie und trennen Sie die Kortexe und Hippocampi in einer Laminar-Flow-Dissektionshaube, um die Kontamination zu reduzieren.</li>
	<li>Schneiden Sie das Gewebe mit einer Mikroschere in kleine Stücke (~1 mm3). Übertragen Sie diese Gewebe in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 5 ml H+20.</li>
	<li>Waschen Sie die Tücher dreimal mit 5 ml H+20 und dreimal mit 5 ml HBSS.</li>
	<li>1,5 ml 1% Trypsin mit Ethylendiamintetraessigsäure zugeben und 10 Minuten lang bei 37 °C für den Enzymaufschluss inkubieren.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 1.6 und verwenden Sie am Ende Vakuum, um HBSS abzusaugen.</li>
	<li>Dissoziieren Sie das Gewebe mechanisch in 1 ml HBSS mit 2,95 g/l MgSO4•7H2O mit einer feuerpolierten Glaspipette.</li>
	<li>Die Zellsuspension bei 400 × g, 4 °C 5 min zentrifugieren.</li>
	<li>Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen von Kulturmedien, um eine Konzentration von ~10.000.000 Zellen/ml zu erhalten.</li>
	<li>Plattieren Sie die Zellen mit ~1.000.000 Zellen/cm2 und legen Sie die Kultur für 1-4 Stunden in den Inkubator (5 % CO2, 100 % Luftfeuchtigkeit und 37 °C), um die Zellanhaftung an die Glasdeckgläser zu erleichtern.</li>
	<li>Fügen Sie ein geeignetes Volumen des Kulturmediums hinzu (z. B. 1 ml pro Vertiefung für eine 24-Well-Platte). Fügen Sie nach 1 Woche das gleiche Volumen des Nährmediums hinzu. Ersetzen Sie nach 2 Wochen jede Woche die Hälfte des vorhandenen Nährmediums durch frisches Medium.</li>
</ol>2. Mikroskopaufbau für die Fluoreszenzbildgebung lebender Zellen
HINWEIS: Ein beispielhafter Bildgebungsaufbau (Abbildung 5) umfasst mindestens ein inverses Fluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle), eine Fluoreszenzlichtquelle mit automatischem Verschluss, Fluoreszenzfiltersätze (z. B. für die Bildgebung von ND6 verwenden Sie 405/10 BP für die Anregung, 495 LP für dichroitische und 510/20 BP für die Emission) und eine hochempfindliche Kamera (Materialtabelle), die alle von einer Bilderfassungssoftware (Materialtabelle) gesteuert werden.
<ol><li>Bereiten Sie eine Bildgebungskammer vor, die eine Temperaturregelung und einen Ein-/Ausgang der Lösung für die Fluoreszenzbildgebung lebender Zellen ermöglicht. HINWEIS: In diesem Protokoll wurde beispielsweise eine modifizierte Bildgebungskammer mit offenem Bad verwendet, die auf einer Heizplattform befestigt ist (Abbildung 6).</li>
	<li>Richten Sie ein programmierbares Gerät ein, um die Perfusionslösungen umzuschalten und den elektrischen Stimulus zu definierten Zeitpunkten während der Bildgebung abzugeben. HINWEIS: Für quantitative Analysen ist eine Hardware- und Softwaresynchronisierung erforderlich (Abbildung 7). In diesem Protokoll wurde beispielsweise ein Triggerausgang der Bildkamera verwendet, um ein Computerprogramm zu starten, das eine automatische Schaltvorrichtung steuert, die ein Mehrkanal-Perfusionssystem und einen Rechteckpulsstimulator steuert.</li>
	<li>Um zwei oder mehr Fluoreszenzreporter gemeinsam abzubilden, führen Sie eine Mehrkanal-Fluoreszenzbildgebung durch, indem Sie entweder nacheinander die Filtersätze wechseln oder gleichzeitig verschiedene Fluoreszenzemissionen aufteilen und auf dieselbe Kamera projizieren.</li>
</ol>3. Laden und Imaging von ND6 in neuronalen Kulturen
<ol><li>Wiegen Sie eine angemessene Menge ND6 ab, lösen Sie es in Dimethylsulfoxid (DMSO) auf und lassen Sie es bei Raumtemperatur löslich werden. kurz beschallen (z. B. 3 min). Filtrieren Sie die Rohstammlösung mit einem 0,22-μm-Filter, um große Farbstoffaggregate zu entfernen. Nach der Filtration wird die Farbstoffkonzentration durch Absorptionsspektroskopie bei 405 nm mit einem herkömmlichen oder Mikrovolumen-Spektrophotometer mit ε = 10.700 M-1 cm-1 bestimmt.</li>
	<li>Vor der Anwendung die Stammlösung mit der Badlösung auf eine Konzentration von 1 μM verdünnen. Bewahren Sie die Stammlösung bei Raumtemperatur im Dunkeln auf.</li>
	<li>Markierung von Endosomen und synaptischen Vesikeln<ol><li>Um endozytierte Membrankompartimente wie Endosomen ubiquitär zu markieren, geben Sie ND6-Stammlösung (z. B. 1 mM in DMSO) in der Endkonzentration von 1 μM in das Kulturmedium und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 5 % CO2, 100 % Luftfeuchtigkeit und 37 °C. Um das Ausmaß der SV-Markierung zu reduzieren, unterdrücken Sie die spontane neuronale Aktivität pharmakologisch. Verwenden Sie beispielsweise Tetrodotoxin, um Aktionspotentiale zu blockieren, oder 2,3-Dioxo-6-nitro-1,2,3,4-tetrahydrobenzo[f]chinoxalin-7-sulfonamid (NBQX) und D-(-)-2-amino-5-phosphonopentansäure (D-AP5), um die exzitatorische Übertragungzu hemmen 23.</li>
		<li>Um SVs selektiv zu markieren, verwenden Sie eine kurze, aber starke Stimulation, um präsynaptische Exo-/Endozytose hervorzurufen. Zuerst werden die Kulturdeckgläser in eine 35-mm-Petrischale <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> mit 2 ml normaler Tyrode-Lösung bei Raumtemperatur gegeben. Zweitens wird die ND6-Stammlösung in der Tyrodelösung mit hohem K+ -Gehalt (90 mM KCl) auf die Endkonzentration von 1 μM verdünnt. Drittens ersetzen Sie die normale Tyrode-Lösung in der Petrischale durch ND6-haltige High-K+ -Tyrode-Lösung und inkubieren Sie sie 2 Minuten lang bei Raumtemperatur.</li>
	</ol></li>
	<li>Die ND6-markierte Zellkultur wird in die Bildgebungskammer überführt, die mit vorgewärmter normaler Tyrode-Lösung gefüllt ist, die 10 μM NBQX und 10 μM D-AP5 enthält.</li>
	<li>Stellen Sie die Perfusionsgeschwindigkeit auf ~0,2 ml/s (d. h. 1 Tropfen pro Sekunde) ein und beginnen Sie mit der Perfusion der vorgewärmten normalen Tyrode-Lösung, die NBQX und D-AP5 enthält, um überschüssiges ND6 in der Kultur zu entfernen.</li>
	<li>Passen Sie den Fokus an und suchen Sie das entsprechende Sichtfeld mit gesunden und gut verteilten Neuronen, die verbundene Neuriten tragen. Vermeiden Sie Bereiche mit ungelösten Farbstoffkolloiden.</li>
	<li>Versuchen Sie, ND6-beladene Zellen mit unterschiedlichen Belichtungszeiten zu fotografieren, um die besten Bildgebungseinstellungen zu ermitteln. HINWEIS: Für die beste Belichtungszeit beträgt die höchste Pixelfluoreszenzintensität im resultierenden Bild etwa die Hälfte des Bitbereichs (z. B. für ein 16-Bit-Bild liegt der Bitbereich zwischen 0 und 65.535), was eine weitere Erhöhung der Fluoreszenz ermöglicht, wenn die saure Badlösung aufgetragen wird. Die gewählte Belichtungszeit sollte für alle ND6-Aufnahmen verwendet werden.</li>
	<li>Richten Sie das Stimulations- und Perfusionsprotokoll, das Bildintervall und die Gesamtdauer ein. Verwenden Sie im folgenden Protokoll beispielsweise eine 30 s Basislinie, eine 10 s 30 Hz elektrische Feldstimulation, 50 s Erholung, 120 s 90 mM K+, 60 s Erholung, 60 s Tyrode-Lösung mit 50 mM NH4Cl, 60 s Tyrode-Lösung bei pH 5,5 und ein Frame-Intervall von 3 s.</li>
	<li>Starten Sie die Bildaufnahme begleitet von der synchronisierten Stimulation und Perfusion. Überwachen Sie die Simulation und den Lösungsaustausch während der Bildgebung.</li>
	<li>Stoppen Sie die Perfusion nach Beendigung der Bildgebung, entfernen Sie das Deckglas und reinigen Sie die Bildgebungskammer für den nächsten Versuch.</li>
</ol>4. Quantifizierung des Membrantransports durch eine Änderung der ND6-Fluoreszenz
<ol><li>Sichern und/oder erstellen Sie eine elektronische Kopie aller Bilddateien.</li>
	<li>Wählen Sie ein Analyseprogramm für die Datenextraktion, z. B. eine Open-Source-Bildanalysesoftware wie ImageJ24 und/oder FIJI25.</li>
	<li>Öffnen oder importieren Sie einen Bildstapel in das Analyseprogramm.</li>
	<li>Legen Sie das erste Bild als Referenz fest und richten Sie den Rest mit Funktionen/Plugins wie Rigid Registration26 daran aus, wodurch Artefakte aufgrund von xy-Drifting gemildert werden. In Abbildung 8 finden Sie Beispielbilder.</li>
	<li>Mittelung aller Bilder, die während der 30 Sekunden vor der Baseline aufgenommen wurden, um ein Referenzbild zu erstellen. Speichern Sie eine Kopie dieses Bildes zum späteren Nachschlagen.</li>
	<li>Legen Sie den Intensitätsschwellenwert fest, um ein binäres Bild aus dem gemittelten Basislinienbild zu generieren.</li>
	<li>Verwenden Sie Watershed in ImageJ oder ähnliche Funktionen in einem anderen Programm, um Verbindungsneuriten oder Zellen zu trennen.</li>
	<li>Verwenden Sie die Funktion Partikel analysieren mit geeigneter Flächengröße und Zirkularität, um ROIs (Regions of Interest) anzufordern, die Zellmembranen, Endosomen, Lysosomen oder synaptischen Boutons entsprechen. Speichern Sie alle ausgewählten ROIs.</li>
	<li>Wählen Sie vier Hintergrund-ROIs in zellenfreien Bereichen innerhalb des Sichtfelds aus.</li>
	<li>Messen Sie die durchschnittliche Pixelintensität für jeden ROI in jedem Frame des Bildstapels und exportieren Sie die Ergebnisse für statistische Analysen.</li>
	<li>Berechnen Sie die mittlere Intensität der Hintergrund-ROIs als Basisrauschen, das von den durchschnittlichen Pixelintensitäten für jeden ROI subtrahiert wird.</li>
	<li>Mittelung der drei höchsten durchschnittlichen Intensitäten für jeden ausgewählten ROI während der Anwendung der pH 5,5 Tyrode-Lösung, um die maximale Fluoreszenzintensität zu erhalten, die für die Normalisierung als 100% definiert ist.</li>
	<li>Mittelung der drei niedrigsten durchschnittlichen Intensitäten für jeden ausgewählten ROI während der Anwendung von 50 mM NH4Cl, um die minimale Fluoreszenzintensität festzulegen, die für die Normalisierung als 0 % definiert ist.</li>
	<li>Berechnen Sie die relativen Fluoreszenzänderungen für jeden ROI basierend auf seinen eigenen 0 % und 100 % Intensitäten. Ableiten von mittleren Fluoreszenzänderungen, Änderungskinetiken und anderen Werten/Diagrammen aus einzelnen ROI-Daten.</li>
</ol>

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<li>Dason, J. S., Smith, A. J., Marin, L., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+sterols+are+essential+for+synaptic+vesicle+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vesicular sterols are essential for synaptic vesicle cycling.</a> Journal of Neuroscience. 30 (47), 15856-15865 (2010).</li>
<li>Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle+revisited%3A+New+insights+into+the+modes+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 39 (42), 8209-8216 (2019).</li>
<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255 (5041), 200(1992).</li>
<li>Afuwape, O. A., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+vesicle+exocytosis-endocytosis+with+pH-sensitive+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic vesicle exocytosis-endocytosis with pH-sensitive fluorescent proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1474, 187-200 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Farbstoffe auf Lipidbasis wie 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanin (DiI) und 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat (DiO) werden seit langem verwendet, um die Zellmorphologie zu veranschaulichen und zelluläre Prozesse wie die Axonprojektionen von Neuronen zu verfolgen. Styrylfarbstoffe wie FM1-43 wurden erfunden und erfolgreich zur Untersuchung der Exozytoseeingesetzt 34. Aufgrund ihrer geringen Membranaffinität markieren sie selektiv endozytierte Vesikel, wo sie eingeschlossen ...

Die Lipiddoppelschicht ist eine der häufigsten Biomolekül-Anordnungen und für alle Zellen unverzichtbar. Außerhalb der Zellen bildet es die Plasmamembran, die Zellen und ihre Umgebung miteinander verbindet; In Zellen unterteilt es verschiedene Organellen, die auf bestimmte Funktionalitäten spezialisiert sind. Lipidmembranen sind eher dynamisch als still und erfahren ständig Fusion und Spaltung, die den Transport von Biomaterial, die Organellenreform, die Morphologieänderung und die zelluläre Kommunikation vermittelt. Zweifellos ist die Lipidmembran die physikalische Grundlage für fast alle zellulären Prozesse, und ihre Funktionsstörung spielt eine entscheidende Rolle bei verschiedenen Erkrankungen von Krebs1 bis Alzheimer2. Obwohl Lipidmoleküle weit weniger vielfältig sind als Proteine, war die Membranforschung bisher hauptsächlich proteinzentriert. Zum Beispiel ist viel mehr über die Proteinmaschinerie als über Lipide in der Exozytosebekannt 3,4,5. Darüber hinaus sind die Organisation, Verteilung, Dynamik und Homöostase von Lipiden über Oberflächen- und intrazelluläre Membranen im Vergleich zu Membranproteinen weitgehend unerforscht6.
Dies ist nicht verwunderlich, da moderne molekularbiologische Techniken wie die Mutagenese einen methodischen Vorteil für die Untersuchung von Proteinen anstelle von Lipiden bieten. Beispielsweise erleichtert die transgene Markierung von pH-empfindlichem grün fluoreszierendem Protein (auch bekannt als pHluorin) an vesikuläre Proteine die quantitative Messung der Menge und Geschwindigkeit des vesikulären Proteinumsatzes während der Exo-/Endozytose 7,8,9. Es ist jedoch fast unmöglich, Membranlipide in vivo genetisch zu verändern. Darüber hinaus sind qualitative und sogar quantitative Manipulationen von Proteinmengen und -verteilungen viel praktikabler als die von Lipiden10. Dennoch wurden native und synthetische fluoreszierende Lipide isoliert und entwickelt, um endogene Membranlipide in vitro und in vivo zu simulieren 11. Eine Gruppe weit verbreiteter fluoreszierender Lipide sind Styrylfarbstoffe, z. B. FM1-43, die membranverstärkte Fluoreszenz aufweisen und ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Freisetzung synaptischer Vesikel (SV) in Neuronen sind12. In letzter Zeit wurden umweltempfindliche Lipidfarbstoffe erfunden und als neue Klasse von Reportern verwendet, um verschiedene Zellmembraneigenschaften zu untersuchen, einschließlich Membranpotential11, Phasenordnung13 und Sekretion14.
Eine neue Klasse von Lipidmimetika, deren Fluoreszenz sowohl pH-sensitiv (z.B. pHluorin) als auch membransensitiv (z.B. FM1-43) ist, wurde entwickelt, um die Lipidverteilung in der Plasmamembran und den Endosomen/Lysosomen sowie den Lipidverkehr während der Exo-/Endozytose direkt zu messen. Zu diesem Zweck wurden die bekannten solvatochromen Fluorophore ausgewählt, die aufgrund des intramolekularen Ladungstransfers Push-Pull-Eigenschaften aufweisen. Unter den bestehenden solvatochromen Fluorophoren ist das 1,8-Naphthalimid (ND)-Gerüst relativ leicht zu modifizieren, vielseitig für die Markierung und einzigartig in der Photophysik15 und wurde daher in DNA-Interkalatoren, organischen Leuchtdioden und Biomolekülsensoren verwendet 16,17,18.
Durch das Anbringen einer elektronenabgebenden Gruppe an der C4-Position des ND-Gerüsts wird eine Push-Pull-Struktur erzeugt, die durch Umverteilung der Elektronendichte im angeregten Zustand19,20 zu einem erhöhten Dipolmoment führt. Ein solcher intramolekularer Ladungstransfer erzeugt große Quantenausbeuten und Stokes-Verschiebungen, was zu einer hellen und stabilen Fluoreszenzführt 21. Diese Gruppe hat kürzlich eine Reihe von solvatochromen Lipidanaloga auf der Grundlage des ND-Gerüsts entwickelt und sie mit guten synthetischen Ausbeutenerhalten 20.
Die spektroskopische Charakterisierung zeigt, dass ND6 unter diesen Produkten die besten Fluoreszenzeigenschaften besitzt (Abbildung 1)20. Erstens hat es im Vergleich zu gängigen Fluorophoren wie Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder GFP gut getrennte Anregungs- und Emissionspeaks (d. h. ~400 nm bzw. ~520 nm in Abbildung 2A, B), wodurch es spektral von ihnen getrennt werden kann und daher für die mehrfarbige Bildgebung nützlich ist. Zweitens weist die ND6-Fluoreszenz in Gegenwart von Mizellen einen mehr als achtfachen Anstieg ihrer Fluoreszenz auf (Abbildung 2C), was auf eine starke Membranabhängigkeit hindeutet. Frühere Fluoreszenz-Bildgebungsstudien mit verschiedenen Zelltypen zeigten eine hervorragende Membranfärbung durch ND620. Drittens, wenn der pH-Wert der Lösung von 7,5 (häufig in extrazellulären oder zytosolischen Umgebungen zu finden) auf 5,5 (häufig in Endosomen und Lysosomen zu finden) gesenkt wird, zeigt ND6 einen etwa zweifachen Anstieg der Fluoreszenz (Abbildung 2D), was seine pH-Empfindlichkeit zeigt. Darüber hinaus zeigt die Molekulardynamik-Simulation, dass sich ND6 leicht in die Lipiddoppelschicht integriert, wobei sein ND-Gerüst aus der Membran und dem Piperazinrest herausragt und starke Wechselwirkungen mit Phospholipidkopfgruppen zeigt (Abbildung 3). Insgesamt machen diese Eigenschaften ND6 zu einem idealen fluoreszierenden Lipidanalogon zur Visualisierung und Messung des Membranlipidumsatzes während der Exo-/Endozytose.
In dieser Arbeit wird eine Methode zur Untersuchung der Umsatzrate und Dynamik von SV-Lipiden unter Verwendung kultivierter Maus-Hippocampus-Neuronen vorgestellt. Durch die Stimulation von Neuronen mit hohen K+-Tyrode-Lösungen wurden SVs und die Plasmamembran mit ND6 beladen (Abbildung 4A,B). Anschließend wurden die Neuronen mit verschiedenen Stimuli restimuliert, gefolgt von NH4Cl-haltigen und pH 5,5 Tyrode-Lösungen (Abbildung 4D). Dieses Protokoll erleichtert die quantitative Messung der zusammengestellten Exozytose- und Endozytoseraten unter verschiedenen Umständen (Abbildung 4C).

<table><tbody><tr><td>Digidata 1440A Datenerfassungssystem</td><td>Molekulare Bauelemente</td><td>Digidata 1440A</td><td>Für synchronisierte Stimulation und Lösungsaustausch</td></tr><tr><td>Zweikanal-Temperaturregler</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td>Für die Bildgebung</td></tr><tr><td>lebender Zellen Fötales Rinderserum</td><td>OMEGA Scientific</td><td>FB-01</td><td>Zur Herstellung von H+20-Lösungen für die Dissektion und Gewebekultur</td></tr><tr><td>Hamamatsu Flash4.0 sCOMS Kamera</td><td>Hamamatsu Inc.</td><td>C13440-20CU</td><td>hochempfindliche Kamera</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td>Zur Herstellung von H+20-Lösung, die in der Dissektion und Gewebekultur verwendet</td></tr> wird <tr><td>Beheizte Plattform</td><td>Warner Instruments</td><td>PH-1</td><td>Für die Bildgebung lebender Zellen</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Für Gewebekulturen</td></tr><tr><td>Micro-G Vibration Isolation Table</td><td>TMC</td><td>63-564</td><td>Für die Bildgebung lebender Zellen</td></tr><tr><td>Micro-Manager</td><td>https://micro-manager.org/</td> <td>NA</td><td>Für die Bildaufnahmekontrolle</td></tr><tr><td>Multi-Line In-Line Solution Heater</td><td>Warner Instruments</td><td>SHM-6</td><td>Für die Bildgebung von lebenden Zellen</td></tr><tr><td>Neurobasal Plus Medium</td><td>THermoFisher Scientific</td><td>A3582901</td><td>Für Gewebekulturen</td></tr><tr><td>Nikon Ti-E Inverses Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Ti-E/B</td><td>Für die Bildgebung von lebenden Zellen</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 Digitale CMOS-Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C1340-20CU</td><td>Für die Bildgebung von lebenden Zellen</td></tr><tr><td>Perfusionskammer</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td>Für die Bildgebung von lebenden Zellen</td></tr><tr><td>Sechskanal-Ventilsteuerung Perfusionssystem</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6</td><td>Für den Lösungsaustausch</td></tr><tr><td>Rechteckpulsstimulator</td><td>Grass Instrument</td><td>SD9</td><td>Für die Stimulation elektrischer Felder</td></tr></tbody></table>

messung des membranlipidumsatzes mit dem ph-empfindlichen fluoreszenz-lipid-analogon nd6

Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6

Die Exo-/Endozytose ist ein gängiger Prozess, der den Austausch von Biomolekülen zwischen Zellen und ihrer Umgebung sowie zwischen verschiedenen Zellen vermittelt. Spezialisierte Zellen nutzen diesen Prozess, um lebenswichtige Körperfunktionen wie die Insulinsekretion von β Zellen und die Freisetzung von Neurotransmittern aus chemischen Synapsen auszuführen. Aufgrund ihrer physiologischen Bedeutung ist die Exo-/Endozytose eines der am meisten untersuchten Themen in der Zellbiologie. Es wurden viele Werkzeuge entwickelt, um diesen Prozess auf Gen- und Proteinebene zu untersuchen, weshalb viel über die an diesem Prozess beteiligte Proteinmaschinerie bekannt ist. Es wurden jedoch nur sehr wenige Methoden entwickelt, um den Membranlipidumsatz zu messen, der die physikalische Grundlage der Exo-/Endozytose ist.
In dieser Arbeit wird eine Klasse neuer fluoreszierender Lipidanaloga vorgestellt, die eine pH-abhängige Fluoreszenz aufweisen, und ihre Verwendung zur Verfolgung des Lipidrecyclings zwischen der Plasmamembran und den sekretorischen Vesikeln demonstriert. Mit Hilfe einfacher pH-Manipulationen ermöglichen diese Analoga auch die Quantifizierung der Lipidverteilung über die Oberfläche und die intrazellulären Membrankompartimente sowie die Messung der Lipidumsatzrate während der Exo-/Endozytose. Diese neuartigen Lipidreporter werden für verschiedene biologische Forschungsbereiche wie Zellbiologie und Neurowissenschaften von großem Interesse sein.

SVs sind auf die Freisetzung von Neurotransmittern über evozierte Exo-/Endozytosespezialisiert 27. SVs haben ein stark saures Lumen (d. h. pH 5,5), was ideal für ND6 ist. Wir verwendeten eine hohe K+ -Stimulation, um SV-Exo-/Endozytose hervorzurufen, um ND6 den Zugang zu SV zu ermöglichen. Erwartungsgemäß zeigten sich nach dem Laden hellgrün fluoreszierende Punkte entlang neuronaler Prozesse (Abbildung 9A). Das in Abbildung 4B gezeigte Lini...

Dieses Protokoll stellt eine Fluoreszenzbildgebungsmethode vor, die eine Klasse von pH-empfindlichen Lipidfluorophoren verwendet, um den Lipidmembrantransport während der Zellexozytose und des Endozytosezyklus zu überwachen.

Messung des Membranlipidumsatzes mit dem pH-empfindlichen Fluoreszenz-Lipid-Analogon ND6

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized ...

Dieses Protokoll beschreibt die Charakterisierung und Anwendung einer neuen pH-empfindlichen fluoreszierenden Lipidsonde, die spezifisch für Zellmembranen ist und es Forschern ermöglicht, Exo und Endozytose in lebenden Zellen zu überwachen. Die meisten früheren Reporter über Membranprotein basierend auf pH-empfindlichem grünem Fluoreszenzprotein, das indirekt ist. Als Lipidmimetikum integriert sich ND6 in die Zellmembran und berichtet so getreu über den Lipidmembrantransport.Die ND6-Sonde wird nur fluoreszierend, wenn sie in eine biologische Membranumgebung eingebettet ist. Die Fluoreszenzintensität dieser Sonde korreliert mit der Protonierung und Deprotonierung der Piperazinkopfgruppe. Daher fluoresziert es bei niedrigerem pH-Wert viel stärker.Exozytose und Endozytose sind ubiquitäre Prozesse, die der Sekretion und Aufnahme vieler Signalmoleküle zugrunde liegen. Daher kann ND6 verwendet werden, um einige grundlegende Fragen der Zellbiologie und der biomedizinischen Wissenschaften zu untersuchen. Haley, Oliver und Jonathan, Studenten aus meinem Labor, werden das Verfahren demonstrieren.Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer Bildgebungskammer, die eine Temperaturregelung und einen Lösungseingang für die Fluoreszenzbildgebung lebender Zellen ermöglicht. Richten Sie ein programmierbares Gerät ein, um die Perfusionslösungen umzuschalten und den elektrischen Stimulus zu definierten Zeitpunkten während der Bildgebung abzugeben. Wiegen Sie eine angemessene Menge ND6 ab.Lösen Sie es in Dimethylsulfoxid auf und lassen Sie es bei Raumtemperatur auflösen. Dann beschallen Sie die Lösung kurz. Filtern Sie die Rohöllösung mit einem 0,22-Mikrometer-Filter, um große Farbstoffaggregate zu entfernen.Bestimmen Sie mit einem herkömmlichen oder Mikrovolumen-Spektralphotometer die Farbstoffkonzentration bei 405 Nanometern. Vor der Anwendung die Stammlösung mit der Badlösung auf eine Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter verdünnen. Bewahren Sie die Stammlösung bei Raumtemperatur im Dunkeln auf.Geben Sie ND6-Stammlösung in der Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter in das Kulturmedium und inkubieren Sie es, um endozytierte Membrankompartimente, wie z. B. Endosomen, ubiquitär zu markieren. Um das Ausmaß der Markierung synaptischer Vesikel zu reduzieren, unterdrücken Sie die spontane neuronale Aktivität pharmakologisch. Nach selektiver Markierung synaptischer Vesikel, wie im Manuskript beschrieben, montieren Sie das Deckglas mit den Zellen in der Bildgebungskammer.Schließen Sie den Temperatursensor, den Perfusionseingang und die Vakuumspitze an die Bildgebungskammer an. Stellen Sie die Perfusionsgeschwindigkeit auf etwa 0,2 Milliliter pro Sekunde ein und beginnen Sie mit der Perfusion der vorgewärmten normalen Tyrodelösung, die NBQX und DAP5 enthält, um überschüssiges ND6 in der Kultur zu entfernen. Passen Sie den Fokus an und suchen Sie das entsprechende Sichtfeld mit gesunden und gut verteilten Neuronen, die verbundene Neuriten tragen.Vermeiden Sie Bereiche, die ungelöste Dikolloide enthalten. Versuchen Sie, ND6-geladene Zellen mit unterschiedlichen Belichtungszeiten zu fotografieren, um die besten Bildgebungseinstellungen zu ermitteln. Richten Sie das Stimulations- und Perfusionsprotokoll, das Rahmenintervall und die Gesamtdauer anhand der Informationen im Textmanuskript ein.Starten Sie die Bildaufnahme, begleitet von synchronisierter Stimulation und Perfusion. Überwachen Sie die Stimulation und den Lösungsaustausch während der Bildgebung. Stoppen Sie die Perfusion, nachdem die Bildgebung beendet ist.Entfernen Sie das Deckglas und reinigen Sie die Bildgebungskammer für den nächsten Versuch. Sichern Sie alle Bilddateien und erstellen Sie eine elektronische Kopie. Wählen und öffnen Sie das Analyseprogramm für die Datenextraktion.Öffnen oder importieren Sie einen Bildstapel in das Analyseprogramm. Verwenden Sie nach dem Generieren einer binären Maske die Funktion "Partikel analysieren" mit entsprechender Flächengröße und Zirkularität, um Bereiche von Interesse oder ROIs anzufordern, die Zellmembranen, Endosomen, Lysosomen oder synaptischen Boutons entsprechen. Wählen Sie vier Hintergrund-ROIs in zellenfreien Bereichen innerhalb des Sichtfelds aus.Speichern Sie dann alle ausgewählten ROIs. Richten Sie alle Frames innerhalb der ND6-Zeitraffer-Bildstapel aus. Legen Sie das erste Bild als Referenz fest, und richten Sie den Rest mit einer starren Registrierung daran aus, wodurch Artefakte aufgrund von XY-Drift verringert werden.Speichern Sie dann die ausgerichteten Bildstapel. Wenden Sie die gespeicherten ROIs auf ausgerichtete ND6-Bildstapel an. Messen Sie die durchschnittliche Pixelintensität der ND6-Fluoreszenz für jeden ROI in jedem Frame des Bildstapels.Exportieren Sie dann die Ergebnisse zur statistischen Analyse. Berechnen Sie die mittlere Intensität der Hintergrund-ROIs, um das Basisrauschen zu erhalten, das von allen ausgewählten ROIs subtrahiert wird. Mittelung der drei höchsten durchschnittlichen Intensitäten für jeden ausgewählten ROI während der Anwendung der Tyrodlösung von pH 5,5, um die maximale Fluoreszenzintensität zu erhalten, die für die Normalisierung als 100 % definiert ist.Mittelwerten Sie die drei niedrigsten durchschnittlichen Intensitäten für jeden ausgewählten ROI während der Anwendung von 50 Millimol Ammoniumchlorid, um die minimale Fluoreszenzintensität festzulegen, die für die Normalisierung als 0 % definiert ist. Berechnen Sie die relativen Fluoreszenzänderungen für jeden ROI basierend auf seinen eigenen 0%- und 100%Intensitäten. Leiten Sie mittlere Fluoreszenzänderungen, Änderungskinetiken und andere Werte oder Diagramme aus einzelnen ROI-Daten ab.Hellgrün fluoreszierende Punkte entlang der neuronalen Fortsätze waren sichtbar, nachdem die neuronalen Zellen mit ND6 beladen wurden. Eine starke Korrelation zwischen den Fluoreszenzintensitäten von ND6 und FM464 deutete ebenfalls auf eine synaptische Vesikelfärbung durch ND6 hin. Es wurde eine Abnahme der ND6-Fluoreszenz als Reaktion auf elektrische Stimulation und Stimulation mit hohem Kaliumgehalt beobachtet, was darauf hindeutet, dass sich ND6 in der synaptischen Vesikelmembran befindet und dass das synaptische Vesikellumen während der Freisetzung neutralisiert wird.Unter einer umfassenden elektrischen Stimulation reduzierte die M-beta-CD-Behandlung die durch ND-Bildgebung gemessene synaptische Vesikelfreisetzung und -entnahme signifikant, was darauf hindeutet, dass Membrancholesterin die Exozytose und Endozytose synaptischer Vesikel erleichtert. Baf A1 verhinderte die Erholung der ND6-Fluoreszenz nach der Stimulation, indem es die Wiederansäuerung der gewonnenen synaptischen Vesikel akut blockierte. Grundlegendes Verständnis der Fluoreszenzmikroskopie ist ein Muss.Eine sorgfältige Planung physiologischer Bedingungen zur Unterstützung der Lebendzellbildgebung ist sehr wichtig. Es ist entscheidend, die Konzentration der ND-Stammlösung genau zu bestimmen. Wenn möglich, messen Sie die Stammlösungskonzentration vor jedem Gebrauch erneut.Bitte halten Sie es von direkter Sonneneinstrahlung fern, um ein Ausbleichen von Fotos und eine Zersetzung der Sonde zu vermeiden.

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Messung des Membranlipidumsatzes mit dem pH-empfindlichen Fluoreszenz-Lipid-Analogon ND6

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