Gewebeentnahme und RNA-Extraktion aus dem humanen osteoarthritischen Kniegelenk

Dieses Protokoll fördert die Verwendung von primärem menschlichem Gewebe als klinisch relevantes Modell für die Arthroseforschung. Die Durchführung von Genexpressions- und histologischen Analysen in diesen Geweben könnte neue mechanistische Erkenntnisse liefern. Diese Technik standardisiert Methoden zur Identifizierung und Verarbeitung menschlicher Kniegelenkskomponenten.

Es ermöglicht die Extraktion von hochwertiger RNA, die die Anforderungen für nachgeschaltete Genexpressionsassays erfüllt. Es ist eine Herausforderung, qualitativ hochwertige RNA aus erkranktem Gelenkgewebe zu erhalten, daher sollte die Bedeutung scheinbar unbedeutender Schritte, wie z.B. alles sauber und kühl zu halten, nicht unterschätzt werden. Thomas Wilson, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter, und Navdeep Kaur, ein Postdoktorand aus meinem Labor, werden das Verfahren demonstrieren.

Beginnen Sie mit der Identifizierung der harten Gewebe, einschließlich Knorpel, Knochen und Meniskus und Weichteile, einschließlich infrapatellarer Fettpolster, vorderem Kreuzband, Synovium und Vastus medialis schrägem Muskel aus der Probe basierend auf den Unterschieden in Größe, Form, Farbe und Textur. Schneiden Sie jedes der Gewebe in drei Abschnitte. Spülen Sie die Gewebeschnitte mit sterilem PBS ab, um Rückstände oder Ablagerungen zu entfernen.

Für die RNA-Extraktion schneiden Sie jeden der drei Gewebeschnitte in etwa ein bis zwei Millimeter Würfel. Die kleineren Stücke in eine Zwei-Milliliter-Kryoflasche geben. Nachdem Sie die Kappen fest befestigt haben, frieren Sie die Fläschchen ein, indem Sie 30 Sekunden lang in flüssigen Stickstoff eintauchen, dann die Durchstechflasche zur Langzeitlagerung in den minus 80 Grad Celsius großen Gefrierschrank geben und diesen Vorgang für alle Gewebe wiederholen.

Homogenisieren Sie das Hartgewebe mit einem Mörtel und Stößel. Kühlen Sie vor der Homogenisierung den Mörtel, den Stößel und den Spatel mit flüssigem Stickstoff ab, um ein Auftauen der Probe zu verhindern. Verarbeiten Sie jeweils nur eine Probe.

Übertragen Sie die Gewebeprobe mit einem gekühlten Spatel auf Mörtel. Gießen Sie flüssigen Stickstoff auf das Gewebe. Nachdem der flüssige Stickstoff verdunstet ist, zerquetschen Sie das Gewebe mit einem Stößel.

Fügen Sie wiederholt flüssigen Stickstoff hinzu, während Sie das Gewebe mahlen, um feines Gewebepulver zu erhalten. Übertragen Sie das feine Gewebepulver in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen, das durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff für 30 Sekunden vorgekühlt wird. Fügen Sie einen Milliliter der eiskalten sauren Guanidiniumphenollösung zu jedem Röhrchen hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen 20 Minuten lang auf Eis.

Bevor Sie verschiedene Hartgewebe homogenisieren, reinigen Sie Mörtel, Stößel und Spatel gründlich mit 70% Ethanol, dann mit RNase-Dekontaminationsmittel, gefolgt von DEPC-behandeltem Wasser. Weichen Sie den Mörtel, den Stößel und den Spatel in 70% Ethanol ein und wischen Sie dann die restliche Flüssigkeit mit einem sauberen, fusselfreien Gewebe ab. Homogenisieren Sie das Weichgewebe mit dem Gewebehomogenisator.

Zur Desinfektion des Homogenisators waschen Sie die Sonde, indem Sie 30 Sekunden lang Röhrchen mit 70% Ethanol und RNase-Dekontaminationsmittel laufen lassen, dann mit DEPC-behandeltem Wasser waschen, gefolgt von zusätzlichen 70% Ethanol, jeweils für 30 Sekunden. Wischen Sie die restliche Flüssigkeit mit einem sauberen, fusselfreien Tuch ab. Geben Sie einen Milliliter saure Guanidiniumphenollösung in vormarkierte, fünf Milliliter runde Bodenröhrchen und übertragen Sie die Gewebeprobe in das Röhrchen.

Legen Sie die Röhre während des gesamten Verfahrens auf Eis und homogenisieren Sie das Gewebe für maximal fünf 32. Impulse oder bis das Gewebe visuell aufgelöst ist. Inkubieren Sie das homogenisierte Gewebe auf Eis, bis alle Gewebeproben verarbeitet sind. Desinfizieren und reinigen Sie den Homogenisator, bevor Sie die nächste Gewebeprobe verarbeiten.

Entfernen Sie mit einer sterilen Pinzette alle in den Zähnen der Sonde vorhandenen Gewebebrocken. Inkubieren Sie das gesamte homogenisierte Gewebe auf dem Eis für weitere 20 Minuten und übertragen Sie die Gewebeprobe dann in ein vormarkiertes, vorgekühltes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Sieben einzigartige menschliche Kniegelenkgewebe, die von Osteoarthritis-Patienten gewonnen wurden, wurden innerhalb von vier Stunden nach der chirurgischen Entfernung verarbeitet.

Die Gewebe wurden visuell identifiziert und durch histologische H& E-Färbung bestätigt. Die H&E-gefärbten Hartgewebeschnitte, gelenkiger Knorpel, subchondraler Knochen und Meniskus wurden mit sechsfacher Vergrößerung und 40-facher Vergrößerung visualisiert. In ähnlicher Weise wurden die H & E-gefärbten Weichteilschnitte, das infrapatellare Fettpolster, das vordere Kreuzband, die Synovia und der Musculus vastus medialis schräg mit sechsfacher Vergrößerung und dann mit 40-facher Vergrößerung visualisiert.

Die Qualitätsbewertung der extrahierten RNA zeigte das Vorhandensein von qualitativ hochwertigen Proben basierend auf Integrität, Ausbeute und Reinheit sowie von Proben von geringer Qualität, was darauf hindeutet, dass trotz der Verwendung einer optimierten Methode externe Faktoren wie die Schwere der Erkrankung die RNA-Qualität in verschiedenen Geweben desselben Patienten beeinflussen können. Die korrekte Identifizierung jedes Gewebetyps ist notwendig, um Intra- und Intergewebevergleiche innerhalb und zwischen Patientenproben zu ermöglichen, insbesondere angesichts der erheblichen Heterogenität der Primärerkrankungsgewebe. Sequenzierungstechnologien entwickeln sich rasant weiter, und die Isolierung hochwertiger RNA ist eine entscheidende Voraussetzung für die Verwendung dieser Technologien, um zugrunde liegende gewebespezifische Mechanismen bei komplexen, chronischen Krankheiten wie Osteoarthritis zu entschlüsseln.