Name: Mesenchymale Stammzellregulation der Makrophagen-Phagozytose; Quantifizierung und Bildgebung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Erfahren Sie, wie mesenchymale Stammzellen die Makrophagen-Phagozytose regulieren. Diese Co-Kultur-Methode mit pH-sensitiven Fluoreszenzpartikeln ermöglicht die Quantifizierung und Bildgebung zellulärer Interaktionen.

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Diese Arbeit wurde vom NSF Major Research Instrument-Mechanismus unter den Fördernummern 1626093 und 1919583 unterstützt.

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Die Analyse der Phagozytose unter Verwendung von Biopartikeln, die an einen pH-empfindlichen Farbstoff konjugiert sind, ist ein relativ neues Werkzeug, das sich gegenüber herkömmlichen fluoreszenzmarkierten Partikeln als vorteilhaft erwiesen hat12,19,20. Bei herkömmlichen fluoreszenzmarkierten Partikeln ist nur eine Endpunktanalyse möglich. Der Nachweis erfolgt mit Fluoreszenzmikroskopie und/oder Spektrofluorometrie nach dem Was...

Mesenchymale Stammzellen (MSC) sind Vorläuferzellen, aus denen Bindegewebszellen entstehen. MSC sind in adulten Säugetiergeweben vorhanden und können aus dem Knochenmark isoliert werden1. Aufgrund ihrer immunmodulatorischen Eigenschaften werden diese Zellen umfassend untersucht2. Frühe Studien konzentrierten sich auf die MSC-Regulation von T-Zellen3,4,5,6, aber in jüngerer Zeit hat ihre Regulation von Makrophagenzellen (MΦ), einer wichtigen zellulären Komponente der angeborenen Immunität, erhöhte Aufmerksamkeit erhalten7,8,9,10,11,12,13,14 . Die Bedeutung der MSC-MΦ-Interaktion bei der Behandlung entzündlicher Erkrankungen wird durch die Tatsache unterstrichen, dass die Depletion von Monozyten/Makrophagen die therapeutischen Wirkungen von MSC in Tiermodellenaufhebt 8. Hier liegt der Fokus auf der Zellkontakt-Interaktion des MSC mit MΦ. MSC haben die Fähigkeit, den Phänotyp von MΦ zu regulieren, indem sie den Wechsel von entzündlichen zu entzündungshemmenden Reaktionen fördern, was zu Gewebereparaturaktivitätenführt 8,9,10,11, und es wurde viel getan, um diese Regulationsmechanismen zu demonstrieren. Unter anderen Umständen kann MSC eine MΦ-getriebene Entzündungsreaktion12,13 unterstützen oder verschlimmern und die phagozytische Aktivität von MΦverbessern 14,15. Es besteht jedoch ein kritischer Mangel an vorhandenen Daten, die die Mechanismen und die Bedingungen identifizieren, unter denen MSC die phagozytische Aktivität von MΦ regulieren.
MΦ haben Familien von Rezeptoren, die entweder opsonisierte (Antikörper oder Komplement-beschichtete) oder nicht-opsonisierte Pathogene erkennen, die zu Phagozytose führen16. Die Aktivierung und Aktivität der letzteren ist weniger gut untersucht17. In einer nicht-entzündlichen In-vitro-Umgebung verstärken MSC die MΦ-Phagozytose von nicht opsonisierten Krankheitserregern13. Die Erkennung von nicht-opsonisierten Krankheitserregern durch MΦ kann jedoch nach Exposition gegenüber einer entzündlichen Umgebung, die von Lymphozyten während einer adaptiven Immunantwort produziert wird, reduziert werden. IFN-γ, das von natürlichen Killerzellen und Effektor-Lymphozyten freigesetzt wird, hat eine hemmende Wirkung auf die MΦ-Phagozytose von nicht opsonisierten Partikeln18. Ein Kokulturmodell wurde entwickelt, um die Mechanismen der MSC-Direktkontaktregulation der MΦ-Phagozytose zu untersuchen. Ziel des hier vorgestellten Experiments ist es, festzustellen, ob MSC die MΦ-Phagozytose von nicht-opsonisierten Erregern regulieren, nachdem MΦ IFN-γ ausgesetzt wurde (Abbildung 1).

<table><tbody><tr><td>96-Well-Mikrotiterplatte aus schwarzem Polystyrol</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3603-48EA</td><td></td></tr><tr><td>0,4 % Trypanblau-Lösung</td><td>MilliporeSigma</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>15 ml und 50 mL konische sterile Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen</td><td>ThermoFisher</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>4-Well-Deckglas mit nicht abnehmbaren Wells</td><td>ThermoFisher</td><td>155382PK</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum (100X)&nbsp; Gibco</td><td>ThermoFisher</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Axiobserver 7 Bildgebungssystem</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>MilliporeSigma</td><td>A8806-1G</td><td></td></tr><tr><td>Zelllifter</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3008-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Kulturflaschen, Gewebekultur behandelt, Oberfläche 75&nbsp; cm2, schräger Hals, mit Kappe, gefiltert</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7231-120EA</td><td></td></tr><tr><td>D1 ORL UVA [D1]</td><td>ATCC</td><td>CRL-12424</td><td>Maus MSC Zelllinie</td></tr><tr><td>DMEM,</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum mit hohem Glukosegehalt, qualifiziert, hitzeinaktiviertes</td><td>ThermoFisher</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>FisherScientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>I-11.15</td><td>ATCC</td><td>CRL-2470</td><td>Maus M&Phi; Zelllinie</td></tr><tr><td>LADMAC Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>CRL-2420</td><td>LADMAC-Zellen sezernieren den Wachstumsfaktor Kolonie-stimulierender Faktor 1 (CSF-1).</td></tr><tr><td>Lebendzell-Imaging-Lösung</td><td>ThermoFisher</td><td>A14291DJ</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>ThermoFisher</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Green Zymosan Biopartikel Konjugat</td><td>ThermoFisher</td><td>P35365</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante Maus IFN-& gamma;</td><td>Preprotech</td><td>315-05</td><td></td></tr><tr><td>Spectramax i3X</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Einweg-Vakuumfiltereinheiten, 250 mL, 0,2 & Mikro; m</td><td>ThermoFisher</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Spritzenvorsatzfilter, 0,2 Mikrometer</td><td>ThermoFisher</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>Mit Gewebekulturen behandelte Kulturschalen, 100 mm x 20 mm</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS430167-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr></tbody></table>

mesenchymale stammzellregulation der makrophagen-phagozytose; quantifizierung und bildgebung

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Mesenchymale Stammzellen (MSC) wurden traditionell auf ihre regenerativen Eigenschaften untersucht, aber in jüngster Zeit standen ihre immunregulatorischen Eigenschaften im Vordergrund. Sie interagieren mit und regulieren die Aktivität von Immunzellen. Der Schwerpunkt dieser Studie liegt auf der MSC-Regulation der phagozytären Aktivität von Makrophagen. Makrophagen (MΦ) Phagozytose ist ein wichtiger Teil der angeborenen Reaktion des Immunsystems auf infektionen, und die Mechanismen, durch die MSC diese Reaktion modulieren, werden aktiv untersucht. Hier wird eine Methode zur Untersuchung der MΦ-Phagozytose von nicht opsonisierten Zymosanpartikeln vorgestellt, die in Kokultur mit MSC zu einem pH-empfindlichen fluoreszierenden Molekül konjugiert sind. Wenn die phagozytische Aktivität zunimmt und die markierten Zymosanpartikel in der sauren Umgebung des Phagolysosoms eingeschlossen sind, erhöht sich die Fluoreszenzintensität des pH-empfindlichen Moleküls. Mit den entsprechenden Anregungs- und Emissionswellenlängen wird die phagozytische Aktivität mit einem Fluoreszenzspektrophotometer gemessen und kinetische Daten werden als Änderungen der relativen Fluoreszenzeinheiten über einen Zeitraum von 70 Minuten dargestellt. Um diese quantitativen Daten zu unterstützen, wird die Veränderung der phagozytischen Aktivität mittels dynamischer Bildgebung visualisiert. Die Ergebnisse dieser Methode zeigen, dass MSC in Kokultur die MΦ-Phagozytose von nicht opsonisiertem Zymosan sowohl von naivem als auch von IFN-γ MΦ verbessert. Diese Daten ergänzen das aktuelle Wissen über die MSC-Regulation des angeborenen Immunsystems. Diese Methode kann in zukünftigen Untersuchungen angewendet werden, um die zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen vollständig abzugrenzen.

Nach der Berechnung der mittleren ± REM für jede Gruppe zu allen Zeitpunkten werden die Daten im Liniendiagrammformat mit der Y-Achse als relative Fluoreszenzintensität und der X-Achse als Zeit dargestellt. Ergänzende Datei 1 enthält ein Beispiel für Rohdaten aus einem kinetischen Lesen der 96-Well-Platte in einem Tabellenkalkulationsformat.
In dieser Studie zeigen die in Abbildung 3Aund Tabelle 3 dargestellten optimalen Ergebniss...

Hier wird ein Protokoll zur Quantifizierung und Erzeugung dynamischer Bilder der mesenchymalen Stammzell (MSC) vermittelten Regulation der Makrophagen (MΦ) Phagozytose von nicht opsonisierten Hefepartikeln (Zymosan) vorgestellt, die zu einem pH-empfindlichen fluoreszierenden Molekül konjugiert sind.

Mesenchymale Stammzellregulation der Makrophagen-Phagozytose; Quantifizierung und Bildgebung

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Diese Kokulturmethode wird dazu beitragen, Schlüsselfragen rund um die Zellkontaktmechanismen hinter der mesenchymalen Stammzellregulation der Makrophagen-Phagozytose zu beantworten und damit die Rolle von MSC bei der Regulierung der angeborenen Immunität zu beleuchten. Diese Technik kann in Hochdurchsatzanalysen angewendet werden. Die an pH-empfindlichen Farbstoffe konjugierten Biopartikel fluoreszieren nur in sauren Phagolysosom-Umgebungen.Daher sind Waschen und Abschrecken notwendig. Diese Methode kann auch auf eine Vielzahl von Kokulturmodellen angewendet werden, die Neutrophile und andere Phagozyten umfassen. Das Verfahren wird Ethan Chetkof, ein Student, der sich derzeit in meinem Labor befindet, demonstrieren.Beobachten Sie zunächst den Zusammenfluss von kultivierten mesenchymalen Stammzellen. Wenn eine Konfluenz von 70-80% erreicht ist, saugen Sie das Wachstumsmedium aus den kultivierten Zellen in einer 100-Millimeter-Schale ab und fügen Sie fünf Milliliter PBS hinzu. Nach dem Absaugen des PBS zwei Milliliter 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung hinzufügen und die Zellen drei Minuten lang inkubieren.Überprüfen Sie nach drei Minuten die Zellablösung mit einem inversen Mikroskop. Und we

mesenchymal-stem-cell-regulation-macrophage-phagocytosis-quantitation

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Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Eine neuartige Methode, um Makrophagen aus primären Kultur von Leberzellen zu erhalten, ist beschrieben. Diese Methode nutzt die Proliferation von Makrophagen in der Kultur, durch Schütteln der Kulturflaschen und Reinigung durch selektive Bindung an Plastikschalen gefolgt. Diese Technik bietet effiziente Leber Makrophagen ohne komplexe Anlagen und Fähigkeiten.

Eine einfache und effiziente Methode, um Makrophagen aus Mixed primären Kulturen von adulten Leber Zellen zu isolieren

Dieses Video zeigt einen Assay zur Untersuchung der Regulation der mesenchymalen Stammzellen (MSC) der Makrophagen-Phagozytose in einer Co-Kultur. Bei der Co-Kultivierung von MSC mit Makrophagen werden nicht-opsonisierte Zymosanpartikel, die an ein pH-empfindliches Fluorophor konjugiert sind, zugegeben, die von den Makrophagen phagozytiert werden. Mit zunehmender Phagozytose steigt die Fluoreszenzintensität an, was die Bestimmung der MSC-vermittelten Regulation der phagozytären Aktivität...

Ein Assay zur Untersuchung der Regulation der Makrophagen-Phagozytose durch mesenchymale Stammzellen

Der Artikel beschreibt eine leicht einfach...

Untersuchung von Makrophagen-Polarisation mit Knochenmark-Makrophagen

Wir präsentieren Ihnen Methoden, um die phagocytic Fähigkeit der primären murinen Knochenmark stammenden Makrophagen mit Gewebekulturen beschrifteten Myelin Schutt und intrazellulären Lipid Droplet Färbung bewerten.

In-vitro- Phagozytose von Myelin Schutt durch Knochenmark stammenden Makrophagen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Quantifizierung der chemotaktischen Aktivität von Blutmonozyten in Mausmodellen vor, um die Auswirkungen ernährungsphysiologischer, pharmakologischer und genetischer Interventionen auf die Blutmonozyten zu bewerten und die von Denmonzyten abgeleiteten Makrophagen in Mausmodelle mit monocyt-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-geladenen Kellermembran-gelüfteten Gelsteckern.

Quantifizierung der monozytenchemotaktischen Aktivität in Vivo und Charakterisierung von Blutmonozyten abgeleiteten Makrophagen

Makrophagen-phagozytische Aktivität gegen Krebszellen, insbesondere 4T1 Maus-Mammakarzinom-Zellen, wurde in dieser Studie abgebildet. Das Modell der Kokultur von Lebenden Zellen wurde mit einer Kombination aus fluoreszierender und differentialer Interferenzkontrastmikroskopie erstellt und beobachtet. Diese Bewertung wurde mit Hilfe von Bildverarbeitungssoftware zur Entwicklung von Multipoint-Zeitraffervideos abget/die sich erstellt haben.

Time-Lapse 2D Imaging der phagozytischen Aktivität in M1 Macrophage-4T1 Maus-Mammary Karzinom-Zellen in Kokulturen

Dieses Protokoll beschreibt die robuste Erzeugung von Makrophagen aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen und Methoden für deren anschließende Charakterisierung. Zelloberflächenmarkerexpression, Genexpression und funktionelle Assays werden verwendet, um den Phänotyp und die Funktion dieser iPSC-abgeleiteten Makrophagen zu bewerten.

Produktion und Charakterisierung menschlicher Makrophagen aus pluripotenten Stammzellen

Neurodegenerative Erkrankungen sind mit dysregulierten Mikrogliafunktionen verbunden. Dieser Artikel beschreibt einen In-vitro-Assay der Phagozytose von Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen. Quantitative Mikroskopie-Auslesungen werden sowohl für die Zeitraffer-Bildgebung mit lebenden Zellen als auch für die High-Content-Bildgebung mit festen Zellen beschrieben.

In vitro Quantitative Imaging Assay für Phagozytose toter Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen

Hier beschreiben wir detailliert Methoden zur Extraktion von Makrophagen aus dem Knochenmark, der Milz und dem infarktierten Herzen und zur anschließenden Bestimmung des metabolischen Flusses in lebenden Zellen.

Analyse des ex vivo metabolischen Flusses in Milz- und Herzmakrophagen und Knochenmarkmonozyten

Dieses Protokoll beschreibt eine Zeitrafferaufnahme-Methode zur Live-Cell-Bildgebung, um die antikörperabhängige Phagozytose grün fluoreszierend markierter triple-negativer Brustkrebszellen durch aus peripheren mononukleären Blutzellen abgeleitete Makrophagen mithilfe eines automatisierten Mikroskops zu visualisieren.

Zeitraffer-Bildgebung der antikörpergesteuerten Phagozytose von grün fluoreszenzproteinmarkierten triple-negativen Brustkrebszellen durch Makrophagen

Erfahren Sie, wie mesenchymale Stammzellen die Makrophagen-Phagozytose regulieren. Diese Co-Kultur-Methode mit pH-sensitiven Fluoreszenzpartikeln ermöglicht die Quantifizierung und Bildgebung zellulärer Interaktionen.

Mesenchymale Stammzellregulation der Makrophagen-Phagozytose; Quantifizierung und Bildgebung

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