Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung der Sinoatrialknoten-Feuerrate zur Identifizierung intrinsischer Herzschrittmacherfehler bei Mäusen

Die Messung der intrinsischen Herzfrequenz ist ein wichtiger Indikator für die Herzgesundheit. Diese Technik misst diese Rate genau und schließt gleichzeitig die Mehrheit der verwirrenden Einflüsse auf den Sinusknoten aus. Die MEA-Aufzeichnung der intrinsischen Herzfrequenz erfasst genaue Feuerratendaten ähnlich wie Einzelzellaufnahmen ohne umfangreiche Elektrophysiologie-Schulung.

Personen, die diese Technik verwenden, können Schwierigkeiten haben, in frühen Experimenten gesunde Gewebepräparate zu erhalten, also üben Sie die Dissektion und optimieren Sie die Puffer und Datenerfassungseinstellungen, bevor Sie mit der eigentlichen Datenerfassung beginnen. Demonstrieren wird das Verfahren von den Ärzten Man Si und Praveen Kumar, Postdoktoranden in meinem Labor. Beginnen Sie, indem Sie die Haut der eingeschläferten Maus mit einem Hämostat halten und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen Querschnitt in die Haut direkt unter dem Boden des Brustkorbs vom linken Rippenbogen zum rechten Rippenbogen zu machen.

Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um das Peritoneum aufzuschneiden und die Leber vorsichtig vom Zwerchfell zu trennen, ohne die Leber zu verneinen, um übermäßige Blutungen zu verhindern. Schneiden Sie das Zwerchfell entlang des Thorax ein, um die Brusthöhle freizulegen. Verwenden Sie die chirurgische Schere, um die Seitenwände des Brustkorbs von den Rändern der Rippenbögen bis zu den Klappendecken zu schneiden, um das Herz freizulegen, und verwenden Sie dann eine 23-Gauge-Spritzennadel, um den Brustkorb über die Schulter zu stecken.

Verwenden Sie eine Transferpipette, um warme, heparinisierte komplette Tyrode-Lösung auf das Herz zu geben, um es feucht zu halten. Halten Sie die Lunge mit einer extra feinen Graefe-Truppe und durchtrennen Sie die Luftröhre mit einer chirurgischen Schere, um die Lunge zu entfernen. Um das Herz zu entfernen, halten Sie die Spitze des Herzens mit einer extra feinen Graefe-Zette und schneiden Sie die Aorta und die Vena cava inferior mit einer chirurgischen Schere.

Übertragen Sie das Herz auf eine Petrischale mit ausgehärtetem Silikonelastomer und verwenden Sie eine Transferpipette zum Baden des Herzens mit zwei bis drei Millilitern warmer, heparinisierter Tyrode-Komplettlösung. Befestigen Sie die Spitze des Herzens mit einem Sezierstift an der Schüssel. Halten Sie die Vena cava inferior mit der Dumont 2 Laminektomie-Heerzette.

Führen Sie eine 22-Gauge-Spritzennadel durch die untere und obere Hohlvene ein, um ihre Position im rechten Vorhof zu lokalisieren, die auch die ungefähre Position des Sinusknotens identifiziert. Halten Sie das rechte Vorhoffnungsanhängsel mit der Dumont 2 Laminektomie-Pinge und legen Sie einen Sezierstift durch das rechte Vorhoffnungsteil, um es an Ort und Stelle zu halten. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang für das linke Vorhoffnungsbeid und entfernen Sie dann die Spritzennadel, die die Hohlvene überspannt.

Verwenden Sie eine Castroviejo-Schere, um die Spitze des Herzens zu entfernen, indem Sie einen Querschnitt über die Ventrikel machen, um das Blut aus dem Herzen freizusetzen, und waschen Sie dann das Herz, indem Sie warme, heparinisierte vollständige Tyrode-Lösung hinzufügen. Verwenden Sie eine Castroviejo-Schere, um entlang des atrioventrikulären Septums zu schneiden, bis die Vorhöfe von den Ventrikeln getrennt sind, und halten Sie den Schnitt näher am Ventrikel. Schneiden Sie entlang des interarteriellen Septums, um das linke Atrium zu entfernen.

Platzieren Sie die Sezierstifte in der Peripherie des rechten Vorhofs, damit sie flach liegen. Entfernen Sie mit der Castroviejo-Schere verbleibendes Fett, Gefäße oder Gewebe aus dem Vorhof und lokalisieren Sie den Sinusknoten im rechten Vorhof. Fügen Sie die Lösung von Tyrode zum Eingabelösungsmodell hinzu und schalten Sie den Fluss des Carbogengases ein, um die Lösung der Tyrode mit Sauerstoff zu versorgen.

Stellen Sie die Peristaltikpumpe auf 25 U / min ein, was eine Durchflussrate von zwei Millilitern pro Minute ergibt. Stellen Sie nach dem Starten der Pumpe sicher, dass der Puffer nicht aus dem System austritt und stellen Sie den Temperaturregler auf 37 Grad Celsius ein. Verwenden Sie die Dumont 55-Zette, um das sezierte Gewebe von der sezierenden Petrischale auf das Mikroelektroden-Array-Gitter zu übertragen.

Positionieren Sie das Gewebe vorsichtig mit einem weichen Pinsel, um den sinusalen Knotenbereich des Elektrodengitters zu überlagern. Legen Sie dann das Netz mit der Knochenzette oder einer gekrümmten Zange über das Gewebe. Positionieren Sie mit der Knochenzette den Harfenanker auf dem Netz, um alles an Ort und Stelle zu halten.

Ordnen Sie die Mikroelektroden-Array-Schüssel auf der Anschlussplatte an. Legen Sie die Perfusionskappe vorsichtig auf die Mikroelektroden-Array-Schüssel, ohne den Harfenscheibenanker zu stören, und sichern Sie den Perfusionsspalt mit Klebeband. Schalten Sie den Verstärker ein und richten Sie einen Workflow für die Aufnahme in der Software ein.

Wählen Sie beat_recording aus. moflo Vorlage. Öffnen Sie es und stellen Sie die Anzahl der Leiterbahnen, die Leiterbahndauer, das Leiterbahnintervall, die Eingangsspannung, die Abtastrate und andere Aufzeichnungsparameter entsprechend den gewünschten Aufzeichnungsbedingungen ein.

Klicken Sie auf die Schaltfläche "Aufnehmen und Wiedergeben", um die Aufzeichnung zu starten und Daten für 10 Spuren von einer Minute Dauer mit zwei Minuten Intervallen zwischen den Ablaufverfolgungen zu erfassen. Pausieren Sie die Pumpe und schalten Sie den Pumpenzuflussschlauch von der normalen Aufzeichnungslösung auf Tyrodes Lösung um, die das gewünschte Medikament der Wahl enthält. Starten Sie die Pumpe neu und setzen Sie die Aufnahme fort.

Sobald die mit dem Medikament angereicherte Tyrode-Lösung das Gewebe erreicht hat, zeichnen Sie 10 Spuren auf die gleiche Weise auf, wie dies zuvor für die Baseline-Aufnahmen der Standardwertaufnahmen der Standard war. Machen Sie ein abschließendes Bild von der Positionierung des Gewebes auf dem Mikroelektrodenarray. Öffnen Sie die gespeicherte aufgezeichnete Datendatei in der Beatfrequenzanalysevorlage der Analysesoftware.

Klicken Sie auf die Wiedergabe und lassen Sie die gesamte Aufzeichnung zur Datenvisualisierung laufen und weisen Sie dann entsprechende Analyseparameter zu. Wählen Sie die Kanäle aus, die in die Analyse einbezogen werden sollen, und legen Sie die gewünschten Amplitudenmaxima oder Amplitudenminima-Schwellenwerte für die automatisierte Wellenform-Peak-Identifizierung fest. Klicken Sie erneut auf das Wiedergabesymbol, um das Dataset erneut auslaufen zu lassen und zu bestätigen, dass die Analyseparameter für eine Spike-Extraktion geeignet sind.

Identifizieren Sie für die Analyse die drei stabilsten aufeinanderfolgenden Spuren, die während des Ausgangszeitraums des Experiments eine stabile Schlagrate für jede Spur über die meisten Kanäle aufweisen, und weitere drei aufeinanderfolgende stabile Spuren während der Arzneimittelexpositionsperiode. Klicken Sie auf das Wiedergabe- und Aufnahmesymbol, um die Analyse zu starten. Die Daten wurden von einer 45 Tage alten männlichen wildtypischen schwarzen Schweizer Maus für die sinoatriale Knoten-Beat-Frequenzmessung gesammelt.

Die Wellenformen mit unterschiedlichen Formen und Amplituden wurden in verschiedenen Kanälen beobachtet und alle Kanäle zeigten identische Interspike-Intervalle und Feuerfrequenzen. Der Grad des Gewebekontakts mit der Elektrode kann jedoch auch die Wellenformeigenschaften wie die Amplitude beeinflussen. Aus den 10 aufgezeichneten Spuren wurden die drei aufeinanderfolgenden Kanäle mit stabiler Taktfrequenz und Interspike-Intervall für die weitere Analyse ausgewählt.

Die schlecht extrahierten Spike-Muster sollten fehlen, aber wenn vorhanden, sind sie entweder durch Rauschen beeinflusst oder instabil. Die Wellenformen, die den einzelnen Herzschlägen entsprechen, spiegeln die intrinsische Herzschrittmacheraktivität wider. Das Mikroelektroden-Array-System ermöglicht die einfache Anwendung von Arzneimitteln zur Analyse der pharmakologischen Wirkungen.

Die intrinsische Feuerrate ausgewählter drei Spuren über alle 64 Kanäle hinweg betrug in den Abtastdaten etwa 320 Schläge pro Minute. Die Einführung von 4-Aminopyrimidin erhöhte die Interspike-Intervalle wie erwartet, was die Taktfrequenz von 320 auf 210 Schläge pro Minute verringerte. Um zuverlässige Daten für die Analyse zu sammeln, ist es wichtig zu bestätigen, dass das Gewebe während der Aufzeichnung gesund ist, indem überprüft wird, ob die Spuren stabil sind und die Standardkriterien erfüllen.

MEAs können verwendet werden, um die Herzaktivität in anderen Regionen des Herzens aufzuzeichnen, was eine detaillierte regionsspezifische Charakterisierung ermöglicht, die die Auswirkungen genetischer und pharmakologischer Manipulation untersuchen kann.