Name: Extraktion von Cofaktor F420 zur Analyse der Polyglutamat-Schwanzlänge aus methanogenen Reinkulturen und Umweltproben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Lernen Sie die optimierte Extraktion von Cofaktor F420 aus methanogenen Reinkulturen und Umweltproben. Diese Methode ermöglicht die Analyse der Polyglutamat-Schwanzlänge mittels Flüssigchromatographie und liefert wertvolle Einblicke in den prokaryotischen Stoffwechsel.

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Wir danken Prof. Colin Jackson für die Unterstützung mit gereinigtem Cofaktor F420. Diese Forschung wurde vom Tiroler Wissenschaftsfonds (TWF) und der Universität Innsbruck (Publikationsfonds) unterstützt. Wir danken der Unterstützung von GPS, HK, SB, GG und HB sehr.

HINWEIS: Die Extraktion und Analyse von Cofaktor F420 ist ein dreistufiger Prozess, der Probenlyse, Cofaktor-Vorreinigung durch Festphasenextraktion (SPE) und Cofaktordetektion über Ionen-gepaarte RP-HPLC (IP-RP-HPLC) mit Fluoreszenzdetektion umfasst. Bereiten Sie vor Beginn die materialien und Reagenzien gemäß Tabelle 1 vor.
1. Probenlyse
<ol><li>Geben Sie bis zu 5 g Probe in geeignete Röhrchen (z. B. 50 ml konische Röhrchen).</li>
	<li>5 ml des Lysepuffers (2x Stammlösung, Tabelle 1) zu den Proben geben.</li>
	<li>Mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 10 mL bringen, um eine Endkonzentration von 0,5 g·ml-1 zu erreichen.</li>
	<li>Wirbeln Sie die verdünnten Proben für 20 s.</li>
	<li>Autoklav für 30 min bei 121 °C.</li>
	<li>Für trockene Proben wie Waldboden nach dem Autoklavieren mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 20 ml bringen und die verdünnte Probe verwirbeln. VORSICHT: Temperaturanstieg während des Autoklavierens kann dazu führen, dass Schläuche platzen.</li>
</ol>2. Vorreinigung des Cofaktors F 420 mittels Festphasenextraktion (SPE)
HINWEIS: Alle Schritte von SPE werden bei Raumtemperatur durchgeführt
<ol><li>Kühlen Sie die Proben auf Raumtemperatur ab.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die autoklavierten Proben für 5 min bei 11.000 x g.</li>
	<li>Bereiten Sie 5 ml SPE-Säulen vor, die mit 100 mg schwachem Anion-Mixed-Mode-Polymersorbens gefüllt sind.</li>
	<li>Konditionierung des Anionenaustauschers mit 3 ml Methanol (Konditionslösung, Tabelle 1).</li>
	<li>Den Anionenaustauscher mit 3 ml destilliertem Wasser ausgleichen (Gleichgewichtslösung, Tabelle 1).</li>
	<li>Laden Sie bis zu 9,0 ml des Überstandes aus dem zentrifugierten Lysat auf die SPE-Säule.</li>
	<li>Verunreinigungen mit 5 mL 25 mM Ammoniumacetat abwaschen (SPE-Waschlösung 1, Tabelle 1).</li>
	<li>Verunreinigungen mit 5 ml Methanol abwaschen (SPE-Waschlösung 2, Tabelle 1).</li>
	<li>Eluieren Sie den Cofaktor F420 in 1,0 ml Elutionspuffer (Tabelle 1). HINWEIS: Bereiten Sie frischen Elutionspuffer vor. Aufgrund des aufgebrachten Vakuums und des hohen Dampfdrucks des Elutionspuffers können sich die Elutionsvolumina von Probe zu Probe unterscheiden. Um das gleiche Endvolumen in allen Proben zu sichern, empfiehlt es sich, die Auffanggefäße vor und nach der Elution zu wiegen und das effektive Elutionsvolumen zu berechnen. Gleichen Sie die Differenzen durch Hinzufügen von Elutionspuffer aus.</li>
</ol>3. Nachweis des Cofaktors F420
<ol><li>Stellen Sie den Ofen auf 40 °C und den Fluoreszenzdetektor auf 420 nm Extinktionswellenlänge und 470 nm Emissionswellenlänge. Erreichen Sie die Trennung über den Gradientenmodus mit den mobilen Phasen A und B (Tabelle 1): 0-3 min: 26% B; 3-24 min: 26%-50% B; 24-25 min: 50% B; 25-27 min: 50%-26% B; 27-35 min: 26% B bei einem Durchfluss von 0,75 ml·min-1. ANMERKUNG: Gewährleisten Sie das Gleichgewicht der Spaltenbedingungen vor dem Einspritzen von Proben, indem Sie die Säule mindestens mit 3 Spaltenvolumina von 74 % mobiler Phase A und 26 % mobiler Phase B spülen (Tabelle 1).<ol>
<li>Filtern Sie die eluierten Proben aus der SPE mit einem PTFE-Filter mit einer Porengröße von 0,22 μm in HPLC-Fläschchen. HINWEIS: PTFE-Filter mit einer Porengröße von 0,22 μm werden empfohlen.</li>
		<li>50 μL der eluierten Probe in das HPLC-System injizieren, um die Zusammensetzung und Konzentration des Cofaktors F420 zu analysieren. HINWEIS: Da in diesem Protokoll kein quantitativer Standard verwendet wird, müssen Proben und Varianten nach Peakfläche verglichen werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+biochemistry%2C+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).</li>
<li>Bashiri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+biosynthetic+pathway+for+the+cofactor+F420+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes.</a> Nature Communications. 10 (1), 451(2019).</li>
<li>Grinter, R., Greening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+F420%3A+an+expanded+view+of+its+distribution%2C+biosynthesis%2C+and+roles+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2021).</li>
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<li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methanogenic+redox+cofactor+F420+is+widely+synthesized+by+aerobic+soil+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria.</a> The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).</li>
<li>Braga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathway+rerouting+in+Paraburkholderia+rhizoxinica+evolved+long-overlooked+derivatives+of+coenzyme+F420%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420.</a> ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).</li>
<li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+coenzyme+F420+and+properties+of+its+hydrolytic+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments.</a> Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).</li>
<li>Michaelis, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+reefs+in+the+Black+Sea+fueled+by+anaerobic+oxidation+of+methane%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane.</a> Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).</li>
<li>Knittel, K., Lösekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+distribution+of+methanotrophic+archaea+at+cold+seeps%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).</li>
<li>Lin, X. -L., White, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+Coenzyme+F420+and+Its+y-Monoglutamyl+derivative+in+nonmethanogenic+archaebacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria.</a> Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).</li>
<li>Spang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+ammonia-oxidizing+Candidatus+Nitrososphaera+gargensis%3A+insights+into+metabolic+versatility+and+environmental+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations.</a> Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).</li>
<li>Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+conservation+and+hydrogenase+function+in+methanogenic+archaea%2C+in+particular+the+genus+Methanosarcina%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).</li>
<li>Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formate-dependent+H2+production+by+the+mesophilic+methanogen+Methanococcus+maripaludis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).</li>
<li>Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+conservation+via+hydrogen+cycling+in+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+barkeri%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li>
<li>Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+in+Mycobacterium+and+Nocardia+species%2C+but+absence+from+Streptomyces+and+Corynebacterium+species+and+methanogenic+Archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea.</a> FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).</li>
<li>Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+novel+coenzyme+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+from+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).</li>
<li>McCormick, J. R. D., Morton, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+of+cosynthetic+factor+I+of+Streptomyces+aureofaciens+and+fragment+FO+from+coenzyme+F420+of+Methanobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species.</a> Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).</li>
<li>Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -S. T., Yurek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+production%2C+and+biological+assay+of+an+unusual+flavenoid+cofactor+involved+in+lincomycin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis.</a> The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).</li>
<li>Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+the+Streptomyces+scabies+coronafacoyl+phytotoxins+involves+a+novel+biosynthetic+pathway+with+an+F420+-dependent+oxidoreductase+and+a+short-chain+dehydrogenase%2Freductase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase.</a> Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).</li>
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<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+F420H2-dependent+reductases+promiscuously+reduce+diverse+compounds+through+a+common+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1000(2017).</li>
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<li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+tail+length+modulates+catalysis+of+bacterial+F420-dependent+oxidoreductases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1902(2017).</li>
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<li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+preparation+for+the+cultivation+of+microorganisms+under+strictly+anaerobic%2Fanoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155(2019).</li>
<li>Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogenotrophic+methanogenesis+and+autotrophic+growth+of+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22Archaea%22%5BJournal%5D)">Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila.</a> Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).</li>
<li>Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+acetate%3A+Propionate+ratios+on+the+methanogenic+community+during+thermophilic+anaerobic+digestion+in+batch+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments.</a> Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).</li>
<li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation%2C+preservation%2C+and+storage+for+volatile+fatty+acid+quantification+in+biogas+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants.</a> Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).</li>
<li>Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+cofactor+F420+production+in+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis.</a> PloS one. 5 (12), 15803(2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Zur Beurteilung des Cofaktors F420 aus methanogenen Reinkulturen kann eine mikroskopische Auswertung durchgeführt werden, um das Wachstum und die Aktivität (Fluoreszenzmikroskopie) der beteiligten Mikroorganismen sichtbar zu machen (Abbildung 1). Für Proben aus natürlichen Umgebungen ist die Verwendung der Mikroskopie zum Nachweis oder zur Quantifizierung von F420 aufgrund von Interferenzen mit anderen fluoreszierenden Mikroorganismen, organischen und anorganischen Part...

F420 ist ein weit verbreiteter, aber oft vernachlässigter Cofaktor, der als obligater Zwei-Elektronenhydrid-Träger in primären und sekundären Stoffwechselprozessen von Archaeen und Bakterien fungiert1,2. F420 ist ein 5-Deazaflavin und strukturell flavin ähnlich, wobei seine chemischen und biologischen Eigenschaften eher mit denen von NAD+ oder NADP+ vergleichbar sind. Aufgrund der Substitution von Stickstoff durch Kohlenstoff an Position 5 des Isoalloxazinrings ist es ein starkes Reduktionsmittel und weist somit ein geringes Standard-Redoxpotential von -340 mV1,3 auf. F420 besteht aus einem 5-Deazaflavin-Ring und einem 2-Phospho-L-Lactat-Linker (F420-0). Ein Oligoglutamatschwanz, der n+1 Glutamatmonomere enthält, kann an das Molekül (F420-n+1)4 gebunden sein.
Lange Zeit wurde der Cofaktor F420 ausschließlich mit Archaeen und Actinobakterien in Verbindung gebracht. Dies wurde weitgehend rückgängig gemacht. Jüngste Analysen ergaben, dass F420 auf verschiedene anaerobe und aerobe Organismen der Phyla Proteobakterien, Chloroflexi und möglicherweise Firmicutes verteilt ist, die eine Vielzahl von Lebensräumen wie Böden, Seen und den menschlichen Darm bewohnen1,5. Im Jahr 2019 zeigten Braga et al.6, dass das Proteobakterium Paraburkholderia rhizoxinica ein einzigartiges F420-Derivat produziert, das ein 3-Phosphoglycerat anstelle eines 2-Phospholactat-Schwanzes enthält, das in verschiedenen Lebensräumen weit verbreitet sein könnte. Innerhalb der Domäne Archaea wurde F420 in mehreren Linien gefunden, darunter methanogenic7, methanotrophic8,9 und sulfatreduzierende Ordnungen10, und soll in Thaumarchaeota11 hergestellt werden. F420 ist am besten als essentielles Redox-Coenzym in der hydrogenotrophen und methylotrophen Methanogenese bekannt. Die reduzierte Form von F420 (F420H2) fungiert als Elektronendonor zur Reduktion von Methylentetrahydromethanopterin (Methylen-H4MPT, Mer) und Methenyl-H4MPT12,13. Es kann auch als Elektronenträger in H2-unabhängigen Elektronentransportwegen von Methanogenen verwendet werden, die Cytochrome enthalten12,14. Darüber hinaus weist die oxidierte Form von F420 eine charakteristische blau-grüne Fluoreszenz bei Anregung bei 420 nm auf, die den mikroskopischen Nachweis von Methanogenen erleichtert (Abbildung 1). Aufgrund seines geringen Redoxpotentials erleichtert F420 (i) die exogene Reduktion eines breiten Spektrums von ansonsten widerspenstigen oder toxischen organischen Verbindungen, (ii) die Synthese von Tetracyclin- und Lincosamid-Antibiotika oder Phytotoxinen in Streptomyceten (Stamm-Actinobakterien) und (iii) die Resistenz gegen oxidativen oder nitrosativen Stress oder andere ungünstige Bedingungen in Mykobakterien (Stamm-Actinobakterien)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Folglich sind F420-abhängige Oxidoreduktasen vielversprechende Biokatalysatoren für industrielle und pharmazeutische Zwecke sowie für die Bioremediation kontaminierter Umgebungen1,23. Trotz dieser jüngsten Erkenntnisse sind die genauen Rollen des Cofaktors F420 bei Actinobakterien oder anderen Bakterienstämmen noch marginal bekannt.
Es gibt mindestens drei Wege für die F420-Biosynthese2,6,24. Zu Beginn wird der Biosyntheseweg in eine 5-Deazaflavin-Biosynthese und einen 2-Phospholactat-Stoffwechselzweig aufgeteilt. Der reaktive Teil des F420-Moleküls wird über FO-Synthase unter Verwendung der Substrate Tyrosin und 5-Amino-6-Ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion synthetisiert. Das Ergebnis ist das Riboflavin-Level-Chromophor FO. Innerhalb des derzeit akzeptierten Laktatstoffwechselzweigs wird L-Laktat durch eine L-Laktatkinase (CofB) zu 2-Phospho-L-Lactat phosphoryliert; 2-Phospho-L-lactat wiederum wird durch 2-Phospho-L-Lactat-Guanylyltransferase (CofC) zu L-Lactyl-2-diphospho-5'-guanosin guanyliert. Im nächsten Schritt wird L-Lactyl-2-diphospho-5'-guanosin durch eine 2-Phospho-L-Lactat-Transferase (CofD) mit FO zu F420-02 verknüpft. Schließlich ligat das Enzym F420-0:ɣ-Glutamylligase (CofE) Glutamatmonomere zu F420-0 und bildet den endgültigen Cofaktor6 in unterschiedlicher Anzahl23,25. Verschiedene Organismen zeigen unterschiedliche Muster in der Anzahl der angehängten Glutamatrückstände, wobei kürzere Schwänze für Methanogene gefunden wurden als in Mykobakterien2,25,26. Im Allgemeinen zeigen Methanogene Schwanzlängen von zwei bis drei, mit bis zu fünf im acetoklastischen Methanogen Methanosarcina sp., während die Schwanzlängen in Mycobacterium sp. zwischen fünf und sieben Glutamatresten lagen2,25,26,27. Neuere Erkenntnisse zeigten jedoch, dass langkettiges F420 an F420-abhängige Oxidoreduktasen mit einer höheren Affinität bindet als kurzkettiges F420; Darüber hinaus erhöht gebundenes langkettiges F420 die Substrataffinität, verringert aber die Fluktuationsrate der jeweiligen Enzyme23.
Der Nachweis des Cofaktors F420 basiert oft auf seiner Fluoreszenz. Dabei wurden seine Oligoglutamatderivate mittels Reversed-Phase (RP)-HPLC27,28 getrennt. Kürzlich verwendeten Ney et al. Tetrabutylammoniumhydroxid als Ionenpaarungsreagenz für den negativ geladenen Glutamatschwanz, um die Trennung auf RP-HLPC erfolgreich zu verbessern5. Hier stellen wir eine Methode zur Probenvorbereitung, anschließenden Lyse, Extraktion, Reinigung, Trennung und Quantifizierung des Cofaktors F420 nicht nur aus Reinkulturen, sondern auch aus verschiedenen Umweltproben (d.h. Böden und Faulschlamm) vor.

<table><tbody><tr><td>Autoklav</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biokompatibles HPLC-System ausgestattet mit Gradientenmodul, Ofen und Fluoreszenzdetektor</td><td>Shimadzu</td><td></td><td>HPLC-System</td></tr><tr><td>Zentrifuge und Rotor für 50 mL " Falke" Röhrchen (11.000 rcf) und passende Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC Säule: Gemini NX C18, 5 &mu; m, 150 x 3 mm</td><td>Phenomenex</td><td></td><td>HPLC Säule</td></tr><tr><td>PTFE Filter (Porengröße 0,22 & Mikro; m) zur Entfernung von Feinstaub vor der HPLC-Analyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Harz für SPE: Strata-X-AW 33 &mu; m als schwaches Anionen-Mischmode-Polymer-Sorptionsmittel</td><td>Phenomenex</td><td></td> schwaches <td>Anionen-Mischmoden-Polymer-Sorptionsmittel</td></tr><tr><td>Vakuumverteiler für SPE und geeignete Sammelröhrchen</td><td></td><td></td><td>SPE-Ausrüstung</td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

extraktion von cofaktor f420 zur analyse der polyglutamat-schwanzlänge aus methanogenen reinkulturen und umweltproben

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

Der Cofaktor F420 spielt als Hydridträger eine zentrale Rolle im Primär- und Sekundärstoffwechsel vieler bakterieller und archaealer Taxa. Der Cofaktor ist vor allem für seine Rolle in der Methanogenese bekannt, wo er thermodynamisch schwierige Reaktionen ermöglicht. Da der Polyglutamat-Schwanz zwischen verschiedenen Organismen in der Länge variiert, könnten Längenprofilanalysen ein leistungsfähiges Werkzeug zur Unterscheidung und Charakterisierung verschiedener Gruppen und Wege in verschiedenen Lebensräumen sein. Hier beschreibt das Protokoll die Extraktion und Optimierung der Cofaktor-F420-Detektion durch Anwendung der Festphasenextraktion in Kombination mit einer leistungsstarken Flüssigkeitschromatographie-Analyse unabhängig von kultur- oder molekularbiologischen Ansätzen. Die Methode wurde angewendet, um zusätzliche Informationen über die Expression des Cofaktors F420 aus mikrobiellen Gemeinschaften in Böden, anaeroben Schlämmen und Reinkulturen zu gewinnen und wurde durch Spiking-Experimente bewertet. Dabei gelang es der Studie, unterschiedliche F420-Schwanzlängenprofile für hydrogenotrophe und acetoklastische Methanogene in kontrollierten methanogenen Reinkulturen sowie aus Umweltproben wie anaeroben Fermenterschlamm und Böden zu generieren.

Reinkulturen von Methanosarcina thermophila und Methanoculleus thermophilus, beide thermophile methanogene Archaeen, wurden wie zuvor beschrieben in geeigneten Medien gezüchtet29,30. Für Methanosarcina thermophila wurde Methanol als Energiequelle verwendet, während Methanoculleus thermophilus auf H2/CO2 gezüchtet wurde. Das Wachstum wurde durch mikroskopische Auswertung überprüft, während die Akti...

Eine Methode zur Extraktion des Cofaktors F420 aus Reinkulturen wurde für die flüssigkeitschromatographische Trennung und Analyse der F420-Schwanzlänge in Reinkultur- und Umweltproben optimiert.

Extraktion von Cofaktor F420 zur Analyse der Polyglutamat-Schwanzlänge aus methanogenen Reinkulturen und Umweltproben

The cofactor F420 plays a central role as a hydride carrier in the primary and secondary metabolism of many bacterial and archaeal taxa. The cofactor is ...

Der Cofaktor F420 spielt eine wichtige Rolle im Primär- und Sekundärstoffwechsel vieler Prokaryoten. Die Messung dieses Moleküls in Umweltproben ermöglicht ein tieferes Verständnis seiner Prävalenz und Funktion. Diese Technik ermöglicht die Analyse des Cofaktors in schwierigen Probenmaterialien wie Schlamm und Boden.Dabei sind die Lyse des Materials und die Vorreinigung vor der Analyse die zentralen Schritte. Das Protokoll umfasst verschiedene Schritte während der Probenvorbereitung. Diese Schritte müssen sehr gut geplant und vorbereitet werden, bevor mit der Probenbearbeitung begonnen wird.Zum Beispiel ist die Vorbereitung von frischen Puffern wichtig. Um mit der Probenlyse zu beginnen, legen Sie fünf Gramm der Probe in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Dann fügen Sie fünf Milliliter 2X Lysepuffer zu den Proben hinzu und bringen Sie das Volumen mit destilliertem Wasser auf 10 Milliliter, um eine Endkonzentration von 0,5 Gramm pro Milliliter zu erreichen.Wirbeln Sie die verdünnten Proben für 20 Sekunden vor, gefolgt von einem Autoklavieren für 30 Minuten bei 121 Grad Celsius. Für trockene Proben wie Waldboden nach dem Autoklavier mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 20 Millilitern bringen und die verdünnte Probe wie gezeigt erneut für 20 Sekunden wirbeln. Sobald die Proben abgekühlt sind, zentrifugieren Sie das Probenlysat für fünf Minuten bei 11.000 x g und sammeln Sie den Überstand.Bereiten Sie eine Fünf-Milliliter-Festphasenextraktion oder SPE-Säule vor, die mit 100 Milligramm schwachem Anionen-Mixed-Mode-Polymersorbens gefüllt ist und den Anionenaustauscher mit drei Millilitern Methanol konditioniert. Dann den Anionenaustauscher mit drei Millilitern destilliertem Wasser ausgleichen. Laden Sie bis zu neun Milliliter des Überstandes aus dem zentrifugierten Lysat auf die SPE-Säule.Waschen Sie die Verunreinigungen nacheinander aus der Säule mit fünf Millilitern 25-Millimol-Ammoniakacetat und fünf Millilitern Methanol. Nach dem Waschen den Cofaktor F420 mit einem Milliliter Elutionspuffer eluieren. Stellen Sie den Ofen auf 40 Grad Celsius ein und stellen Sie den Fluoreszenzdetektor auf 420 Nanometer Extinktionswellenlänge und 470 Nanometer Emissionswellenlänge ein.Als nächstes filtern Sie die eluierte Probe aus der SPE in HPLC-Fläschchen mit einem PTFE-Filter mit einer Porengröße von 0,22 Mikrometern. Injizieren Sie 50 Mikroliter der gefilterten Probe in das HPLC-System und trennen Sie den Cofaktor F420 über den Gradientenmodus unter Verwendung einer Kombination mobiler Phasen, wie im Manuskript beschrieben. Analysieren Sie die Zusammensetzung und Konzentration des Cofaktors F420.Das Wachstum von Reinkulturen von Methanogenen wurde durch Mikroskopie nachgewiesen. In der Phasenkontrastmikroskopie sind Agglomerate von Methanogenen sichtbar, die ein bläuliches Licht emittieren, wenn der Cofaktor F420 mit ultraviolettem Licht angeregt wird. Die Peakfläche des zurückgewonnenen Cofaktors F420 nach SPE mit unterschiedlichen Volumina der Methanoculleus thermophilus Kulturen wurde analysiert.Die Autoklavierungsstrategie erreichte die höchste Spitzenfläche und schloss die maximale Extraktionseffizienz durch eine Druck-Temperatur-Behandlung ab. Die Analyse der Schwanzlängenverteilung ergab die Unterschiede in der Gesamtkonzentration des Cofaktors F420 und der Verteilung der F420-Schwanzlänge der reinen methanogenen Kulturen in Umweltproben. Achten Sie bei der Anwendung dieses Verfahrens darauf, das Gesamtvolumen des Elutionspuffers vollständig zu erfassen oder das genaue Volumen des Durchflusses aufzuzeichnen.Diese Technik ebnet den Weg für die Erforschung des Cofaktors F420 in komplexeren Proben wie Böden und Schlämmen und ermöglicht tiefere Einblicke in die ökologischen Auswirkungen dieses Moleküls.

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Forschung

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Umwelt

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Profiling von Methyltransferasen und andere S-Adenosyl- L-Homocystein-bindende Proteine ​​von Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

DNA und Proteine ​​sequenzspezifisch mit Affinität oder fluoreszierenden Reportergruppen mit DNA- oder Protein-Methyltransferasen und synthetischen Cofaktor-Analoga bezeichnet. Abhängig von der Cofaktor-Spezifität der Enzyme, Aziridin- oder doppelt aktivierte Cofaktor-Analoga werden für ein- oder zweistufige Kennzeichnung verwendet.

Sequenzspezifische Markierung von Nukleinsäuren und Proteinen mit Methyltransferasen und Cofaktor-Analoga

Phospholipid-Fettsäuren liefern Informationen über die Struktur des Bodens mikrobiellen Gemeinschaften. Wir stellen Verfahren zur Extraktion aus Bodenproben mit einem einphasigen Gemisch von Chloroform, Fraktionierung des extrahierten Lipiden Festphasenextraktionssäulen verwendet und Methanolyse Fettsäuremethylester zu erzeugen, die durch Kapillar-Gaschromatographie analysiert.

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Der Artikel beschreibt eine Methode, die den Durchsatz erhöht, während der Aufwand und die Genauigkeit für die Extraktion von Lipiden aus den Zellmembranen von Mikroorganismen zur Verwendung bei der Charakterisierung sowohl der Gesamtlipide als auch der relativen Häufigkeit von Indikatorlipiden zur Bestimmung der mikrobiellen Bodenstruktur in Studien mit vielen Proben ausgeglichen werden.

Eine Lipid-Extraktions- und Analysemethode zur Charakterisierung von Boden-Mikroben in Experimenten mit vielen Proben

Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Verfahren, um den Stoffwechsel von mehreren Nährstoffquellen quantitativ und umfassend zu untersuchen. Dieser Workflow, basierend auf einer Kombination von isotopischen Tracer Experimente und ein Analyseverfahren ermöglicht das Schicksal der konsumierten Nährstoffe und die metabolische Herkunft der Moleküle können durch Mikroorganismen bestimmt werden.

Workflow basiert auf der Kombination der isotopischen Tracer Experimente zu untersuchen, mikrobiellen Stoffwechsel von mehreren Nährstoffquellen

Ein Protokoll ist für gleichzeitig Extrahieren von Metaboliten, Proteine und Lipide aus einer einzigen Bodenprobe, ermöglicht reduzierte Probe Zubereitungszeiten und ermöglicht Multi-Omic Massenspektrometrie Analysen von Proben mit begrenzten Mengen vorgestellt.

Das MPLEx-Protokoll für Multi-Omic Analysen von Bodenproben

Dieses Protokoll beschreibt einen einzigen Durchsatz für ergänzende analytische und Omics Techniken, die ihren Höhepunkt in einer voll gepaart Charakterisierung von natürlichen organischen Stoffen und mikrobielle Proteomics in verschiedenen Ökosystemen. Dieser Ansatz ermöglicht die robuste Vergleiche zur Identifizierung von Stoffwechselwegen und Transformationen für Treibhausgasproduktion Beschreibung und Vorhersage Reaktionen auf Veränderungen der Umwelt wichtig.

Single-Durchsatz ergänzende hochauflösende Analysetechniken für die Charakterisierung von komplexen natürlichen organischen Substanz Mischungen

Die Expression und Reinigung von Fumarylacetoacetat-Hydrolase-Domänen-haltigen Proteinen wird anhand von Beispielen beschrieben (Expression in E. coli, FPLC). Gereinigte Proteine werden zur Kristallisation und Antikörperproduktion verwendet und für Enzym-Assays eingesetzt. Ausgewählte fotometrische Assays werden vorgestellt, um die Multifunktionalität von FAHD1 als Oxaloacetat-Decarboxylase und Acylpyruvathydrolase darzustellen.

Expression, Reinigung, Kristallisation und Enzym-Assays von Fumarylacetoacetat-Hydrolase-Domänen-haltigen Proteinen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Extraktion von Nicht-Protein-Aminosäuren aus biologischen Matrices mittels Trichloressigsäure (TCA)-Proteinfällung und Säurehydrolyse vor der Analyse mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie.

Extraktion von Nicht-Protein-Aminosäuren aus Cyanobakterien für die Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Analyse

Dieses Protokoll beschreibt eine zweiphasige Säure-Lösungsmittel-Extraktionsmethode zur Isolierung kurzkettiger Fettsäuren aus niedrig einbringenden Mauskotproben ohne Derivatisierung.

Extraktion von kurzkettigen Fettsäuren aus Mäusekot mittels einer zweiphasigen Säure-Lösungsmittel-Methode

Lernen Sie die optimierte Extraktion von Cofaktor F420 aus methanogenen Reinkulturen und Umweltproben. Diese Methode ermöglicht die Analyse der Polyglutamat-Schwanzlänge mittels Flüssigchromatographie und liefert wertvolle Einblicke in den prokaryotischen Stoffwechsel.

Extraktion von Cofaktor _F420 zur Analyse der Polyglutamat-Schwanzlänge aus methanogenen Reinkulturen und Umweltproben

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