Name: Definition von Genfunktionen in der Tumorgenese durch Ex-vivo-Ablation von Flox-Allelen in bösartigen peripheren Nervenscheidentumorzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Erfahren Sie eine Ex-vivo-Ablation-Methode zur Untersuchung embryonaler letaler Gen-Knockouts in bösartigen peripheren Nervenscheidentumorzellen. Diese Technik ermöglicht die Analyse essenzieller Gene in vivo.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353, R01 NS109655), des National Cancer Institute (R01 CA122804), des Verteidigungsministeriums (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 und W81XWH-15-1-0193) und der Children's Tumor Foundation (2014-04-001 und 2015-05-007) unterstützt.

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die hier vorgestellten detaillierten Methoden wurden unter Verwendung eines GEM-Modells von MPNSTs entwickelt. Wenn das interessierende Tumorgewebe jedoch in einzelne Zellen zerstreut werden kann, sind diese Methoden leicht für verschiedene Tumorarten anpassbar, die in GEMs auftreten. Es ist wichtig sicherzustellen, dass das floxierte Allel nicht zu i) vermindertem Überleben führt, das es schwierig machen kann, genügend Mäuse zu erhalten, um nach Tumoren zu suchen, oder ii) einer erhöhten Tumorlatenz, die es schwierig ma...

Vor den letzten zwei Jahrzehnten stützte sich die Behandlung von menschlichen Krebserkrankungen stark auf Strahlentherapie und Chemotherapeutika, die im Großen und Ganzen auf sich schnell vermehrende Zellpopulationen abzielten, indem sie die DNA schädigten oder die DNA-Synthese hemmten. Obwohl diese Ansätze das Wachstum von Krebszellen hemmten, hatten sie auch schädliche Nebenwirkungen auf normale, sich schnell vermehrende Zelltypen wie Darmepithelzellen und Haarfollikelzellen. In jüngerer Zeit hat die Krebstherapie begonnen, Chemotherapeutika zu verwenden, die genau auf Proteine innerhalb von Signalwegen abzielen, die für das Wachstum des Neoplasmas eines einzelnen Patienten von entscheidender Bedeutung sind. Dieser Ansatz, der gemeinhin als "Precision Medicine" bezeichnet wird, hat zur Entwicklung eines ständig wachsenden Repertoires an monoklonalen Antikörpern und kleinen molekularen Inhibitoren geführt. Diese Wirkstoffe hemmen effektiv die Proliferation und das Überleben von Tumorzellen und vermeiden gleichzeitig die schädlichen Nebenwirkungen auf normale Zelltypen, die bei herkömmlichen Chemotherapeutika und Strahlentherapie beobachtet werden. Monoklonale Antikörper, die zur Behandlung von Krebs beim Menschen eingesetzt werden, zielen am häufigsten auf Zelloberflächenmoleküle wie Wachstumsfaktorrezeptoren 1 (z. B. die große Familie membranübergreifender Rezeptor-Tyrosinkinasen) und Immunantwortmodulatoren 2 (z. B. programmiertes Zelltodprotein 1, programmierter Todesligand1) ab. Kleine molekulare Inhibitoren können entweder Zelloberflächenproteine oder Signalproteine, die sich intrazellulär befinden, hemmen3. Um diese neuen therapeutischen Wirkstoffe effektiv einsetzen zu können, muss jedoch festgestellt werden, dass eine bestimmte Krebserkrankung von dem Molekül abhängt, auf das ein Therapiekandidat abzielt.
Obwohl diese neuen Therapeutika fokussiertere Wirkungen haben, hemmen viele von ihnen immer noch die Wirkung von mehr als einem Protein. Darüber hinaus sind oft mehrere Wirkstoffe mit unterschiedlicher Wirksamkeit und Spezifität verfügbar, um auf ein bestimmtes Protein abzuzielen. Daher ist es ratsam, bei präklinischen Studien zusätzliche Ansätze wie die genetische Ablation zu verwenden, um ein Kandidatenprotein als therapeutisches Ziel zu validieren. Ein besonders nützlicher Ansatz zur Validierung eines Proteins als therapeutisches Ziel besteht darin, das Gen, das für das Kandidatenprotein kodiert, in einem gentechnisch veränderten Tiermodell abzutragen, das die spezifische Krebsart von Interesse entwickelt. Dieser Ansatz kann relativ einfach sein, wenn Mäuse mit einer Nullmutation (entweder eine natürliche Mutation, eine gentechnisch veränderte Nullmutation [ein "Knockout") oder eine Nullmutation, die durch eine Genfalle eingeführt wurde) verfügbar sind und die Mäuse bis ins Erwachsenenalter lebensfähig sind. Leider sind Mäuse mit einer Nullmutation, die diese Kriterien erfüllen, oft nicht verfügbar, typischerweise weil die Nullmutation zum embryonalen Tod oder in den ersten Tagen des postnatalen Lebens führt. Unter diesen Umständen können Mäuse, die dazu neigen, den interessierenden Tumortyp zu entwickeln, stattdessen zu Mäusen gekreuzt werden, bei denen Schlüsselsegmente des interessierenden Gens von loxP-Stellen flankiert werden ("floxed"), wodurch das Gen abgetragen werden kann, indem eine transgenexprimierende Cre-Rekombinase in die Tumorzellen eingeführt wird (ein bedingter Knockout). Dieser Ansatz bietet mehrere Vorteile. Erstens, wenn ein Cre-Treiber verfügbar ist, der im Tumor exprimiert wird, aber nicht in dem Zelltyp, der bei herkömmlichen Knockouts zum Tod führte, kann dieser Ansatz möglicherweise das therapeutische Ziel validieren. Zweitens ermöglicht die Ablation des Gens, das für das Kandidatenprotein kodiert, in Tumorzellen, aber nicht in anderen intratumoralen Elementen wie tumorassoziierten Fibroblasten oder Immunzellen, dem Prüfarzt, zwischen zellautonomen und nicht-zellautonomen Effekten des therapeutischen Ziels zu unterscheiden. Schließlich ermöglicht ein Tamoxifen-induzierbarer Cre-Treiber (CreERT2) dem Prüfarzt, das Gen von Interesse in verschiedenen Stadien der Tumorentwicklung zu löschen und das Fenster zu definieren, in dem der therapeutische Wirkstoffkandidat am wahrscheinlichsten wirksam ist.
Leider gibt es auch technische Probleme, die die Verwendung von bedingten Knockouts bei Tumoren, die in GEM-Modellen auftreten, einschränken können. Zum Beispiel ist ein Cre-Treiber, der in Tumorzellen exprimiert wird und Gendeletion in normalen lebensnotwendigen Zellen vermeidet, möglicherweise nicht verfügbar. Ein weiteres Problem, das unterschätzt werden kann, ist, dass Cre- und CreERT2-Treiber oft variabel floxierte Allele in Mäusen abtragen, was zu Mosaikismus für die Nullmutation in einem GEM-Krebs führt. Wenn dies geschieht, werden Tumorzellen, in denen das Zielgen nicht abgetragen wurde, weiterhin schnell vermehren und die Tumorzellen mit abgetragenen Allelen überwuchern. Mosaikismus in Cre-Treiberlinien kann aufgrund einer nicht allgegenwärtigen Cre-Expression in der Ziellinie und durch fehlgeschlagene Rekombination in einzelnen Zellen unabhängig von der Cre-Expressionauftreten 4. Dies ist ein bekanntes Phänomen von Cre-Treibern, das vom Zelltyp abhängig ist und bei der Versuchsplanung und Dateninterpretation berücksichtigt werden sollte. Mosaikismus kann die Wirkung des Knockouts maskieren und einen Forscher dazu bringen, fälschlicherweise zu dem Schluss zu kommen, dass das Gen von Interesse für die Proliferation und/oder das Überleben von Tumorzellen nicht essentiell ist und somit kein gültiges therapeutisches Ziel ist.
Mehrere dieser Probleme traten in einer früheren Studie auf, in der versucht wurde zu bestimmen, ob die Rezeptor-Tyrosinkinase erbB4 ein potenzielles therapeutisches Ziel in MPNST-Zellenwar 5. In diesen Studien wurden Mäuse verwendet, die ein Transgen exprimieren, das für denneuregulin-1 (NRG1) isoformen glialen Wachstumsfaktor-β3 (GGFβ3) kodiert, unter der Kontrolle des Schwann-Zell-spezifischen Myelinprotein-Nullpromotors (P 0-GGFβ3-Mäuse). P 0-GGFβ3-Mäuse entwickeln mehrere plexiforme Neurofibrome, die über einen Prozess, der die Prozesse der Neurofibrom-Pathogenese und der plexiformen Neurofibrom-MPNST-Progression rekapituliert, die bei Patienten mit dem autosomal-dominanten Tumorsuszeptibilitätssyndrom Neurofibromatose Typ 1 (NF1)6 beobachtet wurden, zu MPNSTs werden. Bei Kreuzung mit Mäusen mit einer Trp53-Nullmutation ergibt sich das resultierende P 0-GGFβ3; Trp53+/- Mäuse entwickeln MPNSTs de novo, wie sie in cis-Nf1+/-; Trp53+/- Mäuse.
Diese MPNSTs rekapitulieren die Entwicklung von Läsionen der Weltgesundheitsorganisation (WHO) Grad II zu WHO-Grad IV, die beim Menschen beobachtet wurden7. Bei P 0-GGFβ3-Mäusen entstehen MPNSTs innerhalb bereits bestehender plexiformer Neurofibrome im Trigeminusnerv (58%) und spinalen dorsalen Nervenwurzeln (68%)7; die MPNSTs, die in P 0-GGFβ3 entstehen; Trp53+/- Mäuse haben eine sehr ähnliche Verteilung. Beim Menschen entstehen MPNSTs am häufigsten im Ischiasnerv, gefolgt vom Plexus brachialis, den Spinalnervenwurzeln, dem Vagus, dem Femur, dem Median, dem Plexus sacralis, dem Obturator popliteus und den hinteren Tibia- und Ulnarnerven8. Diese Tumorverteilung in diesen GEM-Modellen unterscheidet sich etwas von dem, was beim Menschen beobachtet wird. Die MPNSTs, die in P 0-GGFβ3 und P0-GGFβ3 auftreten; Trp53+/- Mäuse sind histologisch identisch mit menschlichen MPNSTs, tragen viele der gleichen Mutationen, die bei menschlichen MPNSTs beobachtet wurden, und rekapitulieren den Prozess der Neurofibrom-MPNST-Progression, der bei NF1-Patienten beobachtet wurde. Die Erzeugung von P 0-GGFβ3 oder P0-GGFβ3; Trp53+/- Mäuse, die Erbb4-/- waren, waren nicht durchführbar, da Mäuse mit zwei Erbb4-Null-Allelen in utero am Embryonaltag 10,5 nach Herzfehlernstarben 9. Denn die Rettung der Erbb4-Expression im Herzen durch die Einführung eines herzspezifischen Erbb4-Transgens (α-Myosin-Schwerkette (MHC)-Erbb4) führt zu lebensfähigen Erbb4-/-Mäusen 10, der Erzeugung von Mäusen mit einem komplizierten P 0-GGFβ3; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- Genotyp wurde versucht.
Die Paarungen produzierten jedoch keine Mäuse in den erwarteten Mendelschen Verhältnissen, was darauf hindeutet, dass der gewünschte Genotyp schädlich war. Daher ist die Erzeugung von P 0-GGFβ3; Trp53+/- Mäuse mit floxierten Erbb4-Allelen11 und einem CreERT2-Treiber wurde versucht, die Löschung von Erbb4 in den MPNSTs, die in diesen Mäusen entstehen, zu ermöglichen. Bei diesen Tieren waren noch zahlreiche Tumorzellen mit intakten Erbb4-Allelen vorhanden (Mosaikismus). Der beobachtete Mosaikismus könnte auf eine ineffiziente Tamoxifenabgabe zurückzuführen sein, die zu Unterschieden in der Rekombinationseffizienz innerhalb des Gewebes führte. Die Möglichkeit spontaner Kompensationsmechanismen könnte weiter zum Mosaikismus in der Tamoxifen-vermittelten Rekombination beitragen, indem die Anforderung an die Erbb4-Expression umgangen wird. Es ist möglich, dass der Verlust von Trp53 Tumorzellen anfällig für zusätzliche spontane "permissive" Mutationen macht, die die Interpretation der Daten verwirren könnten. Da es wahrscheinlich schien, dass die Erbb4-intakten MPNST-Zellen die Folgen der Ablagerung von Erbb4 in anderen Tumorzellen maskieren würden, wurde dieser Ansatz aufgegeben.
Diese Hindernisse führten zur Entwicklung einer Methodik zur Ablation von Erbb4 in sehr frühen Passage MPNST-Zellen unter Verwendung eines Adenovirus, das Cre-Rekombinase und eGFP exprimiert. Diese Zellen können mit FACS von nicht infizierten Zellen getrennt werden, was den Mosaikismus für das ablatierte Erbb4-Gen deutlich reduziert. Im Folgenden werden die Methoden beschrieben, die verwendet werden, um dies zu erreichen, zusammen mit den Methoden, die verwendet werden, um die Auswirkungen der Genablation in vitro und in vivo zu bewerten. Das folgende Protokoll ist ein Beispiel dafür, wie tumortragende Mäuse erzeugt werden können, die Tumore mit gefloxten Allelen embryonaler tödlicher Gene hervorbringen, die für die Ex-vivo-Exzision vor der Beurteilung des In-vivo-Allotransplantat-Tumorwachstums von Interesse sind. Dazu gehört eine Beschreibung der Ansätze, die verwendet werden, um die Wirkung zu analysieren, die die Erbb4-Ablation auf die Proliferation, das Überleben und die Genexpression von Tumorzellen in vitro sowie auf Proliferation, Überleben und Angiogenese in orthotopen Allotransplantaten ausübt.

<table><tbody><tr><td>Ad5CMV-eGFP</td><td>Gentransfer-Vektor-Kern, Universität von Iowa</td><td>VVC-U von Iowa-4</td><td></td></tr><tr><td>Ad5CMVCre-eGFP</td><td>Gentransfer-Vektor-Kern, Universität von Iowa</td><td>VVC-U von Iowa-1174</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568 Sekundärantikörper</td><td>Thermo/Fisher</td><td>GaR A11036</td><td></td></tr><tr><td>Bioconductor Open-Source-Software für Bioninformatics</td><td>Bioconductor</td><td>http://www.bioconductor.org</td><td>alternatives statistisches Analysewerkzeug für Schritt 4.4</td></tr><tr><td>CD31</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>Celigo Image Cytometer</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cell</td><td>Corning</td><td>25-056-Cl</td><td>Mischung aus Chelatoren</td></tr><tr><td>DAB-Färbekit</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7800</td><td></td></tr><tr><td>DAVID (Datenbank für Annotation, Visualisierung und integrierte Entdeckung)</td><td>DAVID</td><td>https://david.ncifcrf.gov</td><td>Software zur Analyse der funktionellen Anreicherung für Schritt 4.5</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>15-013-Cl</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq und Puffer (Genotypisierung, PCR)</td><td>Thermo/Fisher</td><td>EP0701 und K1072</td><td></td></tr><tr><td>erbB4 Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-284</td><td></td></tr><tr><td>erbB4 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab35374</td><td></td></tr><tr><td>erbB4 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>HFR1: 05-1133</td><td></td></tr><tr><td>FACS Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>Aria II</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>GenomeSpace Tools und Datenquellen</td><td>GenomeSpace</td> https://genomespace.org/support/tools/ <td>allgemeine Ressource für verschiedene Arten von Open-Source-Bioinformatik-Tools für Schritt 4.5</td><td></td></tr> <tr><td>Glutamin</td><td>Corning</td><td>25-005- </td><td></td>Cl</tr><tr><td>Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool</td><td>Gorilla</td><td>N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il</td><td>Software zur Analyse der funktionellen Anreicherung für Schritt 4.5</td></tr><tr><td>GSEA Gene Set Enrichment Analysis</td><td>Broad Institute</td><td>N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp</td><td>Software zur Analyse der funktionellen Anreicherung für Schritt 4.5</td></tr><tr><td>HSD: Athymic Nude-FOxn1nu Mäuse</td><td>Envigo (ehemals Harlan Labs)</td><td>69</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq2500 (DNA-Sequenzierer der nächsten Generation)</td><td>Illumina</td><td>Hi Seq 2500</td><td>DNA-Sequenzierer für Schritt 4.2</td></tr><tr><td>Lasergene: ArrayStar Genexpression und Variantenanalyse</td><td>DNAStar LaserGene-Software</td><td>N/</td><td>A-Software Statistische und Normalisierungsanalyse für Schritt 4.4</td></tr><tr><td>LaserGene: SeqMan NGen-Sequenzausrichtungseinheit</td><td>Softwareausrichtung für Schritt 4.3</td><td>N/A</td><td>Softwareausrichtung für Schritt 4.3</td></tr><tr><td>Matrigel, Basalmembranmatrix mit niedrigem Wachstumsfaktor</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>NRG1-beta</td><td>Im eigenen Haus</td><td>Von SLC generiert, auch kommerziell erhältlich von R & D Systems(396-HB-050/CF).</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Stain Hoeschst 33342</td><td>Thermo</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Panther Gene Ontology Classification System</td><td>Panther</td><td>http://pantherdb.org</td><td>Software zur Analyse der Funktionsanreicherung für Schritt 4.5</td></tr><tr><td>Partek (BWA-Aligner und -Analysator)</td><td>Partek, Ver 7</td><td>N/A</td><td>Softwareausrichtung und Statistik/Normalisierung für Schritt 4.3</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Grundierung 1: 5&prime;-CAAATGCTCTCTCTGTGTT GTCTG- 3&prime;</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Primer 1 + 2: 250&thinsp; bp ErbB4 Nullprodukt und ein 350&thinsp; bp Floxed ErbB4 Produkt;</td><td></td></tr><tr><td>Grundierung 2: 5&prime;-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3&prime;</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Primer 1 + 2: 250&thinsp; bp ErbB4 Nullprodukt und ein 350&thinsp; bp Floxed ErbB4 Produkt;</td><td></td></tr><tr><td> Primer 3: 5&prime;-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA ACCCAG-3&prime; </td><td>Eurofins Genomics</td><td>Primer 1 + 3: 350&thinsp; bp Wildtyp-ErbB4-Produkt.</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iod</td><td>Fisher</td><td>51-351-0</td><td></td></tr><tr><td>Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays</td><td>R& D Systems</td><td>ARY003B</td><td></td></tr><tr><td>Real time glo</td><td>Promega</td><td>G9712</td><td>Biolumineszenz-Zellviabilitätsassay</td></tr><tr><td>ToppGene Suite</td><td>ToppGene</td><td>https://toppgene.cchmc.org</td><td>Software zur Analyse der Funktionsanreicherung für Schritt 4.5</td></tr><tr><td>Trizol (Reagenz auf Säure-Quanidinium-Phenol- und Choloroform-Basis)</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Tyramid Signalamplifikationskit</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL721001EA</td><td></td></tr></tbody></table>

definition von genfunktionen in der tumorgenese durch ex-vivo-ablation von flox-allelen in bösartigen peripheren nervenscheidentumorzellen

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Die Entwicklung neuer Medikamente, die genau auf Schlüsselproteine bei menschlichen Krebserkrankungen abzielen, verändert die Krebstherapeutika grundlegend. Bevor diese Medikamente jedoch eingesetzt werden können, müssen ihre Zielproteine als therapeutische Ziele bei bestimmten Krebsarten validiert werden. Diese Validierung wird häufig durchgeführt, indem das Gen, das für das therapeutische Ziel in einem gentechnisch veränderten Mausmodell (GEM) von Krebs kodiert, ausgeschaltet und bestimmt wird, welche Auswirkungen dies auf das Tumorwachstum hat. Leider schränken technische Probleme wie die embryonale Letalität bei konventionellen Knockouts und der Mosaikismus bei bedingten Knockouts diesen Ansatz oft ein. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein Ansatz zur Ablation eines abgeloxierten embryonalen tödlichen Gens entwickelt, das in Kurzzeitkulturen von bösartigen peripheren Nervenscheidentumoren (MPNSTs) von Interesse ist, die in einem GEM-Modell erzeugt wurden.
Dieses Papier beschreibt, wie man ein Mausmodell mit dem entsprechenden Genotyp etabliert, kurzfristige Tumorkulturen von diesen Tieren ableitet und dann das floxierte embryonale tödliche Gen mit einem adenoviralen Vektor abträgt, der Cre-Rekombinase und verbessertes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) exprimiert. Die Reinigung von Zellen, die mit Adenovirus transduziert wurden, mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) und die Quantifizierung der Auswirkungen, die die Genablation auf die Zellproliferation, Lebensfähigkeit, das Transkriptom und das orthotope Allotransplantatwachstum ausübt, wird dann detailliert beschrieben. Diese Methoden bieten einen effektiven und generalisierbaren Ansatz zur Identifizierung und Validierung therapeutischer Ziele in vitro und in vivo. Diese Ansätze bieten auch eine erneuerbare Quelle für von Tumoren abgeleitete Zellen mit niedriger Passage mit reduzierten In-vitro-Wachstumsartefakten. Auf diese Weise kann die biologische Rolle des Zielgens in verschiedenen biologischen Prozessen wie Migration, Invasion, Metastasierung und interzellulärer Kommunikation, die durch das Sekretom vermittelt werden, untersucht werden.

Abbildung 4 zeigt ein typisches Ergebnis, das bei der Umleitung von P 0-GGFβ3 erzielt wird; Trp53-/+; Erbb4 fl/fl MPNST-Zellen entweder mit dem Ad5CMV-eGFP-Adenovirus oder Ad5CMV-Cre/eGFP-Adenovirus (Abbildung 4A). Kulturen werden mit Fluoreszenzmikroskopie betrachtet, um eGFP-exprimierende Zellen zu identifizieren, und mit Phasenkontrastmikroskopie, um die Gesamtzahl der im selben Feld vorhandenen Zellen bei 10...

Hier stellen wir ein Protokoll für die Durchführung von Gen-Knockouts vor, die in vivo in gentechnisch veränderten Mausmodell-abgeleiteten Tumoren embryonal tödlich sind, und bewerten dann die Wirkung, die der Knockout auf Tumorwachstum, Proliferation, Überleben, Migration, Invasion und das Transkriptom in vitro und in vivo hat.

Definition von Genfunktionen in der Tumorgenese durch Ex-vivo-Ablation von Flox-Allelen in bösartigen peripheren Nervenscheidentumorzellen

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Dieses Protokoll bietet eine alternative In-vivo-Methode, um die Tumorwachstumsrolle eines embryonalen tödlichen Gen-Knockouts zu untersuchen. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass Gen-Knockouts, die normalerweise embryonal tödlich sind, in Tumoren durchgeführt werden können, die aus einem gentechnisch veränderten Mausmodell stammen, um ihre Funktionsverlusteffekte in vivo zu untersuchen. Diese Technik kann auf Krankheiten angewendet werden, die eine Untersuchung der In-vivo-Rolle embryonaler essentieller Gene erfordern, die von herkömmlichen Gen-Knockout-Mausmodellen nicht erreichbar sind.Die Erstellung des Tiermodells erfordert Zeit, und empirische Tests sind erforderlich, um den optimalen MOI für eine adenovirale Infektion zu bestimmen, um sicherzustellen, dass eine geeignete Rekombination erreicht wird. Identifizieren Sie zunächst die Maus mit dem gewünschten Genotyp. Wenn eine tumortragende Maus ihren humanen Endpunkt erreicht, euthanasieren Sie die Maus und verwenden Sie ein steriles Skalpellmesser, um den Tumor zu entfernen.Sezieren Sie den Tumor in drei Abschnitte in Brotlaib-Schnitten mit einem Skalpellmesser, um die Gewebesegmente für die Formalinfixierung Paraff

defining-gene-functions-tumorigenesis-ex-vivo-ablation-floxed-alleles

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Ein Verfahren zur sicheren Pfropfen Luciferase-markierten menschlichen malignen peripheren Nervenscheide Tumorzellen in den Ischiasnerv von immundefizienten Mäusen beschrieben. Der Einsatz von Biolumineszenz-Bildgebung, um die ordnungsgemäße Errichtung von Tumor Transplantate und Kriterien für die zufällige Trennung der Tiere in Arbeitsgruppen zeigen, werden ebenfalls diskutiert.

Orthotopen Xenografting of Human Luciferase-Tagged malignen peripheren Nervenscheide Tumorzellen für In vivo Prüfung von Kandidaten Therapeutika

Phänotypische Wildtyp-Astrozyten und neurale Stammzellen, die von Mäusen entnommen wurden, die mit floxierten, bedingten onkogenen Allelen gezüchtet und über virale Cre-vermittelte Rekombination transformiert wurden, können zur Modellierung der Astrozytom-Pathogenese in vitro und in vivo durch orthotope Injektion von transformierten Zellen in Gehirne von syngenen, immunkompetenten Wurfgeschwistern verwendet werden.

Modellierung Astrozytom Pathogenese In-vitro- Und In Vivo Verwenden kortikale Astrozyten oder neuralen Stammzellen aus dem Bedingten, gentechnisch veränderte Mäuse

Mosaik Klonanalyse in Drosophila imaginären Scheibenepithelien ist ein leistungsfähiges Modellsystem, um die genetischen und zellulären Mechanismen der Tumorentstehung zu studieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion von Tumoren in Drosophila Flügel imaginären Scheiben mit dem GAL4-UAS-System, und führen Sie eine Diagnose-Methode, um die Tumor-Phänotypen zu klassifizieren.

Induktion und Diagnose von Tumoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Epithelia

Wir haben einen speziesübergreifenden vergleichenden Onkogenomik-Ansatz entwickelt, der genomische Analysen und funktionelle genomische Screenings verwendet, um therapeutische Ziele in Tumoren, die in gentechnisch veränderten Mausmodellen auftreten, und den entsprechenden menschlichen Tumortyp zu identifizieren und zu vergleichen.

Genetisches Profiling und Dropout-Screening im Genommaßstab zur Identifizierung therapeutischer Ziele in Mausmodellen für bösartige periphere Nervenscheidentumoren

Wir haben eine Methodik entwickelt, um zu beurteilen, ob Neubildungen des Nervensystems in gentechnisch veränderten Mäusen die Pathologie ihrer menschlichen Gegenstücke genau rekapitulieren. Hier wenden wir diese histologischen Techniken, definierten pathologischen Kriterien und Kulturmethoden auf Neurofibrome und maligne periphere Nervenscheidentumoren an, die im P 0-GGFβ3-Mausmodell auftreten.

Identifizierung, Diagnose und Einstufung bösartiger peripherer Nervenscheidentumoren in gentechnisch veränderten Mausmodellen

Die Neurofibromatose Typ 1 (NF1) führt zu gutartigen Tumoren der peripheren Nervenscheide (Neurofibrome), die für ihr Wachstum eine spezifische Nervenmikroumgebung benötigen. Es wurde ein optimiertes orthotopes Xenotransplantatmodell entwickelt, bei dem intraneurale Injektion von humanen Schwann-Zellen in NSG-Mäuse verwendet wurde. Dieses Modell rekapituliert humane Neurofibrome und bietet eine wertvolle Plattform zur Evaluierung therapeutischer Strategien.

Ein orthotopes Xenotransplantat des Ischiasnervs für Neurofibromatose Typ 1 Neurofibrome

Dieses Protokoll zeigt , wie fluoreszierend markiert, genetisch definierten klonalen Tumoren im Auge von Drosophila melanogaster / antennal Imaginalscheiben (EAD) zu erzeugen. Es beschreibt, wie der EAD und Gehirn aus dem dritten Larvenstadium zu sezieren und wie sie zu verarbeiten, zu visualisieren und zu Veränderungen der Genexpression und Tumorinvasivität quantifizieren.

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Bild resident Tumor infiltrieren CD8 T-Zellen beschriftet mit Gewebekulturen gekoppelten Antikörpern im menschlichen Lunge Tumor Scheiben. Diese Technik ermöglicht Echtzeit-Analysen von CD8 T Zelle Migration mit der konfokalen Mikroskopie.

Ex-Vivo Bildgebung von Resident CD8-T-Lymphozyten in menschlichen Lungentumor Scheiben mit konfokalen Mikroskopie

Low-Bereich (L-Band, 1,2 GHz) Elektron paramagnetischen Resonanz mit löslichen Nitroxyl und Trityl Sonden wird zur Beurteilung der physiologisch wichtigen Parameter in den Tumor Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs gezeigt.

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Paramyxoviruses für Tumor-gezielte Immunmodulation: Gestaltung und Evaluation Ex Vivo

Erfahren Sie eine Ex-vivo-Ablation-Methode zur Untersuchung embryonaler letaler Gen-Knockouts in bösartigen peripheren Nervenscheidentumorzellen. Diese Technik ermöglicht die Analyse essenzieller Gene in vivo.

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Definition von Genfunktionen in der Tumorgenese durch Ex-vivo-Ablation von Flox-Allelen in bösartigen peripheren Nervenscheidentumorzellen

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