Shuttle Box Assay als assoziatives Lernwerkzeug zur kognitiven Beurteilung in Lern- und Gedächtnisstudien mit erwachsenen Zebrafischen
12. Juli 2021
Lernen und Gedächtnis sind starke Metriken bei der Untersuchung von entwicklungsbedingten, krankheitsabhängigen oder umweltbedingten kognitiven Beeinträchtigungen. Die meisten kognitiven Bewertungen erfordern spezielle Ausrüstung und umfangreiche Zeitverpflichtungen. Der Shuttle-Box-Assay ist jedoch ein assoziatives Lernwerkzeug, das eine herkömmliche Gelbox zur schnellen und zuverlässigen Beurteilung der Kognition von erwachsenen Zebrafischen verwendet.
Der Shuttle Box Assay verfolgt reproduzierbar das Fortschreiten und die Genesung kognitiver Beeinträchtigungen nach einem stumpfen Krafttrauma oder einer anderen Art von Hirnverletzung bei Zebrafischen. Der Shuttle Box Assay ermöglicht eine relativ einfache, schnelle und robuste Messung des assoziativen Lernens sowohl im Kurz- als auch im Langzeitgedächtnis bei Zebrafischen. Bereiten Sie zunächst die Shuttle Box vor, indem Sie eine 30,5 x 19 x 7,5 Zentimeter große Gelbox mit einem 5 x 19 Zentimeter großen Stück Plexiglas in Aquarienqualität modifizieren, das auf jeder Seite in einem Winkel von 45 Grad hinzugefügt wird.
Machen Sie dann eine Linie, die den halben Weg des Tanks markiert, um zu beurteilen, wann Fische die Mitte des Tanks überquert haben. Nachdem Sie 800 Milliliter Systemwasser in die Shuttle Box gegeben haben, legen Sie zwei bis drei Fische in einen Auffangbehälter mit Systemwasser. Lassen Sie den Tank in dem dunklen Raum, in dem der Shuttle Box Assay durchgeführt wird.
Als nächstes legen Sie im dunklen Raum einen Fisch in die Mitte der Shuttle-Box. Befestigen Sie den Deckel und befestigen Sie die Elektroden an einem Netzteil. Der Fisch sollte im Dunkeln akklimatiert werden.
Schalten Sie alle Lichter aus und gewöhnen Sie den Fisch für 15 Minuten an die Shuttle Box. Eine erfolgreiche Akklimatisierung kann in Betracht gezogen werden, wenn der Fisch das Aquarium frei erkundet. Nach erfolgreicher Akklimatisierung der Fische leuchten Manuell eine 800 Lumen rote Linsen-Taschenlampe etwa zwei Zentimeter von der Gelkastenwand entfernt auf die vom Fisch besetzte Seite.
Starten Sie keinen Versuch, wenn der Fisch neben dem Platindraht ruht. Leuchten Sie den Lichtreiz direkt auf den Fisch und verfolgen Sie manuell jede seitliche Bewegung des Fisches mit dem Licht, um eine kontinuierliche Visualisierung des Reizes zu gewährleisten. Setzen Sie den Lichtreiz fort, bis eine der folgenden Bedingungen für eine erfolgreiche oder fehlgeschlagene Studie erfüllt ist.
Betrachten Sie den Versuch als erfolgreich, wenn der Fisch innerhalb von 15 Sekunden nach Lichteinwirkung die Hälfte des Tanks überquert. Sobald der Fisch die Hälfte des Wegs überquert hat, stoppen Sie den Lichtreiz sofort. Wenn der Versuch fehlgeschlagen ist, verwenden Sie ein Elektrophorese-Netzteil, um einen negativen Schockreiz von 20 Millivolt auf ein Ampere anzuwenden, abwechselnd zwei Sekunden ein, zwei Sekunden aus für 15 Sekunden mit maximal vier Stößen oder bis der Fisch die Hälfte der Box passiert.
Beenden Sie dann sowohl den leichten als auch den negativen Reiz. Sorgen Sie vor der Einarbeitungszeit für eine erfolgreiche Akklimatisierung an die Shuttle Box, indem Sie den Fisch 15 Minuten lang unter dunklen Bedingungen stehen lassen. Dann leuchten Manuell eine 800 Lumen rote Linsen taschenlampe etwa zwei Zentimeter von der Gelboxwand auf der vom Fisch besetzten Seite.
Strahlen Sie den Lichtreiz direkt auf den Fisch und folgen Sie jeder seitlichen Bewegung des Fisches mit dem Licht, um eine kontinuierliche Visualisierung des Reizes zu gewährleisten. Während das Licht auf den Fisch scheint, gleichzeitig den nachteiligen Schockreiz von 20 Millivolt auf ein Ampere anwenden, abwechselnd zwei Sekunden ein, zwei Sekunden aus für 15 Sekunden mit maximal vier Stößen oder bis der Fisch die Hälfte der Box passiert. Sobald dies erreicht ist, beenden Sie den leichten und nachteiligen Reiz.
Wiederholen Sie diesen Vorgang für 25 Iterationen. Nach Abschluss dem Fisch eine weitere Eingewöchnungszeit von 15 Minuten unter dunklen Bedingungen einrennen. Führen Sie während der ersten Testphase eine erfolgreiche Akklimatisierung in der Shuttle Box für 15 Minuten durch, tragen Sie dann bis zu 15 Sekunden lang nur den Lichtreiz auf und zeichnen Sie die Reaktionen auf.
Betrachten Sie den Versuch als erfolgreich, wenn der Fisch innerhalb von 15 Sekunden nach Dem Start des Lichtreizes die Hälfte der Shuttle-Box überquert und den Lichtreiz sofort stoppt, wenn der Fisch die Hälfte des Wegs überquert. Betrachten Sie den Versuch als fehlgeschlagen, wenn der Fisch 15 Sekunden nach dem Start des Lichtreizes nicht die Hälfte der Shuttle Box überquert und den Lichtreiz nach 15 Sekunden stoppt. Wenden Sie während des ersten Tests nach einem fehlgeschlagenen Versuch keinen negativen Stimulus an.
Führen Sie Kurzzeitgedächtnistests unmittelbar nach dem ersten Testzeitraum durch. Induzieren Sie dramatische Hirnverletzungen und warten Sie vier Stunden vor dem Testen. Dann akklimatisieren Sie den Fisch in der Shuttle Box für 15 Minuten.
Beurteilen Sie das Kurzzeitgedächtnis, indem Sie bis zu 15 Sekunden lang nur den Lichtreiz anwenden und aufzeichnen, ob der Fisch die Hälfte der Box überquert, bevor das Licht ausgeschaltet wird, als bestandener Versuch betrachtet wird oder den Halbzeitpunkt nicht innerhalb der 15 Sekunden überschreitet, die als fehlgeschlagener Versuch gelten. Wiederholen Sie den obigen Schritt 25 Mal mit einer 30-sekündigen Ruhezeit zwischen jeder Studie und notieren Sie die Anzahl der erfolgreichen und fehlgeschlagenen Studien. Führen Sie vier Tage nach dem ersten Test Langzeitgedächtnistests durch.
Induzieren Sie ein Schädel-Hirn-Trauma und warten Sie vier Stunden vor dem Test, dann akklimatisieren Sie den Fisch in der Shuttle Box für 15 Minuten. Beurteilen Sie das Langzeitgedächtnis, indem Sie bis zu 15 Sekunden lang nur den Lichtreiz anwenden und aufzeichnen, ob der Fisch die Hälfte der Box überquert, bevor das Licht ausgeschaltet wird, als bestandener Versuch betrachtet wird oder den Halbzeitpunkt nicht innerhalb der 15 Sekunden überschreitet, die als fehlgeschlagener Versuch gelten. Wiederholen Sie die oben genannten 25 Mal mit einer 30-sekündigen Ruhezeit zwischen jeder Studie und notieren Sie die Anzahl der erfolgreichen und fehlgeschlagenen Studien.
Der lehrreiche Überblick über die Lern- und Gedächtnisparadigmen für die kognitive Bewertung wird hier gezeigt. Der unbeschädigte Fisch mit acht Monaten, junger Erwachsener, 18 Monate, Erwachsener mittleren Alters und 24 Monate, älterer Erwachsener, erforderte eine ähnliche Anzahl von Versuchen, um das Verhalten der Vermeidung des roten Lichts zu lernen. Nach der Verwendung des Schweren Stumpfkraft-Trauma-Hirnverletzungsmodells (STBI) benötigten die Fische in verschiedenen Altersgruppen eine ähnliche Anzahl von Versuchen, um den Assay ein bis fünf Tage nach der Verletzung zu beherrschen.
Am ersten Tag nach STBI benötigten Fische jeden Alters eine ähnliche Anzahl von Versuchen, um das Verhalten zu erlernen, das signifikant größer war als die unbeschädigten Kontrollen. Der unbeschädigte Fisch meisterte die Shuttle Box schnell und erzielte fünf aufeinanderfolgende positive Versuche in etwa 17 Versuchen, während Fische eines Tages nach einer leichten Hirnverletzung oder einem leichten TBI eine signifikante Zunahme der Anzahl der Versuche zeigen, um das Verhalten zu lernen. Dieses Defizit erhöhte sich nach zwei leichten TBI und war nach drei leichten TBI-Verletzungen weiter erhöht.
Unbeschädigte Fische zeigen einen leichten Anstieg der prozentualen Differenz erfolgreicher Versuche im unmittelbaren Gedächtnis und im verzögerten Gedächtnis im Vergleich zum anfänglichen Testzeitraum. Nach einem einzigen milden TBI zeigten Fische im Vergleich zu unbeschädigten Fischen signifikante und sofortige Gedächtnisdefizite. Dieser Trend setzte sich mit wiederholten Verletzungen mit zunehmenden Defiziten nach zwei leichten TBI und drei leichten TBI fort.
Der Zeitpunkt der angewendeten unerwünschten Reize ist entscheidend. Die Paarung der negativen Reize mit dem Licht und ihrer gleichzeitigen Entfernung festigt ihre Assoziation und ist entscheidend für das Paradigma. Der Assay ermöglicht eine schnelle Beurteilung oder komplexes assoziatives Lernen, mit dem Entwicklungs-, Alterungs- und Umweltauswirkungen auf kognitive Beeinträchtigungen untersucht werden können.
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Übersicht
Der Shuttle-Box-Test ist ein kognitives Bewertungsinstrument, das zur Messung des assoziativen Lernens bei adulten Zebrafischen verwendet wird, insbesondere im Kontext kognitiver Beeinträchtigungen aufgrund von Traumata. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Bewertung von kurz- und langfristigem Gedächtnis nach Hirnverletzungen und erleichtert die Untersuchung der Dynamik von Lernen und Gedächtnis in einem einfachen Versuchsaufbau.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Verhaltensbiologie
- Kognition
Hintergrund
- Der Shuttle-Box-Test ist ein innovatives Werkzeug, das die kognitive Bewertung bei Zebrafischen verbessert.
- Er vereinfacht den Bewertungsprozess im Vergleich zu herkömmlichen Methoden, die aufwendige Ausrüstung erfordern.
- Dieses Modell eignet sich besonders zur Untersuchung der kognitiven Auswirkungen von stumpfen Traumen und anderen neuralen Verletzungen.
- Der Test untersucht sowohl das Lernvermögen als auch die Erholungsdynamik nach einer Verletzung.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Verfolgung der kognitiven Erholung bei Zebrafischen nach Gehirnverletzungen.
- Untersuchung, wie Alter und Verletzung das Lernen und Gedächtnis beeinflussen, wie durch den Shuttle-Box-Test bewertet.
- Gewinnung von Erkenntnissen über die Mechanismen des assoziativen Lernens als Reaktion auf Reize.
Verwendete Methoden
- Die verwendete Hauptplattform ist eine modifizierte Gelelektrophoresekammer, die für die Verhaltensbewertung von Zebrafischen konzipiert wurde.
- Das primäre biologische Modell besteht aus adulten Zebrafischen, die nach einer Hirnverletzung kognitiven Tests und Herausforderungen ausgesetzt werden.
- Die Methode umfasst systematische Eingewöhnungsphasen, Lichtreize und leichte elektrische Schocks zur Beurteilung des Gedächtnisses.
- Die Tests bestehen aus sequenziellen Versuchen, die sowohl die kurz- als auch die langfristige Gedächtnisleistung zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verletzung bewerten.
- Das Training wird über mehrere Durchläufe wiederholt, um eine konsistente Messung der Lernleistungsfähigkeit zu gewährleisten.
Hauptergebnisse
- Der Shuttle-Box-Test zeigte einen signifikanten Zusammenhang zwischen der Schwere der Hirnverletzung und der Anzahl der Versuche, die Zebrafische benötigten, um Vermeidungsverhalten zu erlernen.
- Gesunde Zebrafische beherrschten das Vermeidungsverhalten schnell, während verletzte Tiere mehr Versuche benötigten.
- Reaktionen wurden in verschiedenen Altersgruppen beobachtet, was auf konsistente Lernmuster nach Verletzung unabhängig vom Alter hinweist.
- Langzeit- und Kurzzeitgedächtnisbewertungen ergaben unterschiedliche Erholungsprofile, die sich nach dem Zeitpunkt der kognitiven Beurteilung nach der Verletzung richteten.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie bestätigt den Shuttle-Box-Test als wertvolles Instrument zur Untersuchung kognitiver Beeinträchtigungen und der Erholung.
- Die gewonnenen Erkenntnisse tragen zu einem besseren Verständnis assoziativer Lernprozesse bei Zebrabärblingen bei, mit Konsequenzen für die Forschung zu Hirnverletzungen.
- Die Ergebnisse unterstreichen das Potenzial von Zebrabärblingen als effektives Modell zur Erforschung neurokognitiver Erholungsmechanismen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Der Shuttle-Box-Test bietet eine schnelle, reproduzierbare Methode zur Beurteilung assoziativen Lernens und des Gedächtnisses bei Zebrafischen und ermöglicht die frühe Erkennung kognitiver Defizite nach einer traumatischen Hirnverletzung. Seine Einfachheit und geringen Anforderungen an die Ausrüstung unterstützen eine skalierbare Untersuchung in der entdeckungsorientierten Neurowissenschaft und erleichtern die Validierung von Zielstrukturen für neuroprotektive oder neurorestaurative Substanzen. Die Fähigkeit des Tests, den kognitiven Verlauf und die Erholung über verschiedene Altersgruppen hinweg zu verfolgen, erhöht das Vorhersagevertrauen in präklinische Modelle neurodegenerativer Erkrankungen und traumatischer Hirnverletzungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht therapeutische Hypothesen, indem Lern- und Gedächtnisdefizite nach einer Hirnverletzung quantifiziert werden, was der Zielinteraktion und der Aufklärung von Signalwegen dient.
- Operativer Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch reproduzierbare Messung kognitiver Beeinträchtigungen und Erholung in einem Wirbeltiermodell.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem Verbindungen identifiziert werden, die Lerndefizite beheben, und somit die Entscheidungen über Fortführung oder Einstellung in der frühen Forschung verbessert.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für die anschließende Testung von Substanzen vor, indem die Baseline-Lernleistung und verletzungsbedingte Defizite etabliert werden.
- Operationaler Wert: Liefert standardisierte, quantitative Messgrößen (Versuche bis zur Kriterienerreichung), die die Reproduzierbarkeit des Assays und die Konsistenz zwischen verschiedenen Laboren verbessern.
- Strategischer Wert: Ermöglicht die Bereitschaft für Hochdurchsatzanalysen durch kurze Trainingszyklen und geringen Handhabungsaufwand und unterstützt so wiederholte Tests in verschiedenen Behandlungsgruppen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet klinische Relevanz, da kognitive Defizite bei adulten Zebrabärblingen nach einer traumatischen Hirnverletzung modelliert werden, wodurch klinische Phänotypen nachgebildet werden.
- Operativer Wert: Gewährleistet eine translationale Durchgängigkeit von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem die Erholung von unmittelbarem und verzögertem Gedächtnis über mehrere Tage verfolgt wird.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt die Entscheidungsfindung durch die Unterscheidung von Effekten auf unmittelbares und verzögertes Gedächtnis und leitet damit mechanismenspezifische therapeutische Strategien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Shuttle-Box-Test fügt sich in die Entdeckungskette von der Testung von Zielhypothesen bis hin zur Identifizierung von Leitsubstanzen ein und trägt zur mechanistischen Risikominderung bei kognitiven Endpunkten in Programmen zu neuropsychiatrischen und neurodegenerativen Erkrankungen bei.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem assoziatives Lernen als funktioneller Endpunkt der Integrität neuronaler Schaltkreise nach einer Verletzung gemessen wird.
- Screening: Bietet Bereitschaft für Assays durch standardisierte Akklimatisierung, Reizpaarung und bewertete Versuchsdurchläufe, wodurch eine zuverlässige Substanzprüfung ermöglicht wird.
- Analytik: Erzeugt quantitative abhängige Variablen (erfolgreiche Versuche innerhalb von 15 Sekunden), die statistische Vergleiche der Lernleistung unter verschiedenen Bedingungen erlauben.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem sowohl Kurzzeit- (4 Stunden) als auch Langzeitgedächtnis (4 Tage) bewertet werden, um die zeitlichen Dynamiken der kognitiven Erholung abzubilden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Dient als wiederverwendbare Plattform für iterative Tests über verschiedene Genotypen, Altersstufen und Behandlungsregime hinweg und reduziert so redundante Modellentwicklungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine vorhersagbare Sicherheit bei der Zielvalidierung, indem mechanistische Unklarheiten in Lern- und Gedächtniswegen verringert werden.
- Operativer Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit sicher durch feste Reizparameter (Lichtintensität, Schockdauer, Versuchslimits) und verblindete Bewertungskriterien.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem frühzeitige Erkennung kognitiver Beeinträchtigungen ermöglicht wird und das Risiko spätzeitiger Fehlschläge in der Wirkstoffentwicklung für das zentrale Nervensystem reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem Verbindungen identifiziert werden, die Lerndefizite beheben, ohne das verzögerte Gedächtnis zu beeinflussen, was auf eine Selektivität des Wirkmechanismus hinweist.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Zebrafischen, der Verhaltensneurowissenschaften und der grundlegenden Elektrophysiologie für die Stimuluspräsentation.
- Setzt den Zugang zu einem abgedunkelten Raum, einem Elektrophorese-Netzgerät und einer standardisierten Gelelektrophoresekammer mit Plexiglas-Trennwänden voraus.
- Erfordert eine standardisierte Abstimmung zwischen den Forschungsteams hinsichtlich Akklimatisierungsprotokollen, Stimulus-Timing und Definitionen der Versuchsdurchläufe, um die Vergleichbarkeit der Daten sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Übertragung auf larvale Modelle oder alternative Arten aufgrund von Unterschieden in Größe, Schocktoleranz und Sehschärfe.
- Ist durch die Empfindlichkeit des Tests gegenüber Stress- und Motivationszuständen begrenzt, die die Leistung unabhängig von kognitiven Funktionen beeinflussen können, wie in den Akklimatisierungsanforderungen des Protokolls beschrieben.
