Name: Schnelle, kostengünstige und unkomplizierte Herstellung von bakteriellem zellfreiem Lysat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Erfahren Sie eine schnelle Methode zur Herstellung bakterieller Lysate für zellfreie Genexpression mit Escherichia coli. Dieses Protokoll ermöglicht Forschern kostengünstige und zuverlässige Proteinexpression ohne lebende Zellen.

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Die Autoren danken Zachary Sun und Richard Murray (California Institute of Technology) für die freundliche Bereitstellung des Plasmids P_araBAD-gamS und Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) für die freundliche Bereitstellung einer Hochgeschwindigkeits-Kühlzentrifuge. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health und des ARO MURI-Programms unterstützt und teilweise von der Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Japan, unterstützt.

1. Bereiten Sie Medien und Puffer vor.
<ol><li>Bereiten Sie 2xYTPG Medium vor.<ol>
<li>Mischen Sie 62 g 2xYT Pulver, 5,99 g Kaliumphosphat monobasisch, 13,93 g Kaliumphosphat zweibasisch und entionisiertes Wasser zu 2 L.</li>
		<li>Autoklav auf Flüssigkeitszyklus mit einer Einwirkzeit von 30 min14.</li>
		<li>Auf 400 ml 2xYTP-Medien aus 1.1.2 werden 7,2 g D-Glucose (Dextrose) zugegeben und bis zur Auflösung gemischt.</li>
		<li>Filter-Sterilisieren Durch einen 0,2 μm Filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie den S30A-Puffer vor.<ol>
<li>Mischen Sie Tris-HCl (pH 7,7, 50 mM Endkonzentration), Kaliumglutamat (60 mM end) und Magnesiumglutamat (14 mM Endkonzentration).</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert mit 10 M KOH auf 7,7 ein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie Lösung 1 vor (siehe Tabelle 1).<ol>
<li>Resuspend 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure (HEPES) in 2 mL Wasser.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 8,0 ein.</li>
		<li>Fügen Sie alle anderen Komponenten aus Tabelle 1 hinzu.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert mit 10 M KOH auf 7,6 ein. Filter-sterilisieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2,5-fache Vormischungslösung zubereiten (siehe Tabelle 2).<ol>
<li>Mischen Sie alle Komponenten in Tabelle 2.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 7,5 ein.</li>
		<li>Aliquot und bei -80 °C einfrieren. HINWEIS: Eine 20-μL-Reaktion verwendet 8,9 μL Vormischung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bereiten Sie Zellen vor.
<ol><li>Die Autolysatzellen mit einer Impfschleife auf LB-Agarplatten mit 50 μg/ml Ampicillin streifen und bei 37 °C wachsen (siehe Anmerkung 1).</li>
	<li>Eine einzelne Kolonie mit einer Pipettspitze in eine Starterkultur aus LB/Ampicillin-Medium aufnehmen und über Nacht bei 37 °C wachsen lassen.</li>
	<li>400 ml 2xYTPG-Medium mit 50 μg/ml Ampicillin mit 400 μL Starterkultur impfen und bei 37 °C in einem 1 L Erlenmeyerkolben unter Schütteln bei 300 U/min wachsen.</li>
	<li>Messen Sie periodisch die optische Dichte der Kultur bei 600 nm (OD600) mit einem Spektralphotometer, um eine optische Küvette mit einer Weglänge von 1 cm abzulesen. Wenn der OD600 1 überschreitet, beginnen Sie vor den Messungen mit der 5-fachen Verdünnung der Kultur, um sicherzustellen, dass die Messungen im linearen Bereich eines typischen Laborspektrophotometers bleiben. Züchten Sie die Zellen weiter, bis die 5-fach verdünnte Kultur OD600 von 0,3 erreicht (entsprechend einer Kultur OD600 von 1,5).</li>
</ol>3. Bereiten Sie das Lysat vor.
<ol><li>Bereiten Sie den S30A-Puffer vor, der mit 2 mM Dithiothreitol (DTT) ergänzt wird. Mischen Sie 3 ml S30A-Puffer mit 6 μL DTT-Stammlösung bei 1 M. Legen Sie sie zur Verwendung in Schritt 3.7 auf Eis.</li>
	<li>Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 1800 × g für 15 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie ihn abgießen und mit einem Pipett die verbleibende Flüssigkeit entfernen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 45 ml kaltem (4-10 °C) S30A-Puffer mit einem Wirbelmischer.</li>
	<li>Wiegen Sie ein leeres 50-ml-Zentrifugenröhrchen, übertragen Sie die Zellen hinein und wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.3, um die Zellen zu waschen.</li>
	<li>Wiegen Sie das Pellet und ziehen Sie das Gewicht eines leeren 50-ml-Rohres ab. Achten Sie darauf, den verbleibenden Überstand vorsichtig abzusaugen, um eine genaue Messung des Pelletgewichts zu gewährleisten. HINWEIS: Eine typische Ausbeute beträgt ~1,3 g Zellpellet aus 400 ml Produktionskultur.</li>
	<li>Fügen Sie 2 Volumina kalten S30A-Puffers hinzu, ergänzt mit 2 mM Dithiothreitol, d. H. 2 ml Puffer pro 1 g Zellpellet, und resuspendieren Sie die Zellen durch kräftiges Wirbelmischen.</li>
	<li>Frieren Sie die Zellen ein. Legen Sie das 50-ml-Röhrchen mit den Zellen in einen Gefrierschrank mit -20 °C oder -80 °C, bis das Pellet gründlich eingefroren ist. HINWEIS: Der Gefrierschritt ist ein guter Haltepunkt für den Tag.</li>
	<li>Tauen Sie die Zellen in einem Wasserbad bei Raumtemperatur auf.</li>
	<li>2-3 min kräftig wirbeln.</li>
	<li>Bei 37 °C für 45 min mit Schütteln bei 300 U/min inkubieren.</li>
	<li>Reinigen Sie die Probe von schweren Zelltrümmern durch Zentrifugieren in transparenten Zentrifugenröhrchen bei 30.000 × g für 45 min bei 4 °C. HINWEIS: Wenn eine Zentrifuge mit einer Kapazität von 30.000 x g nicht verfügbar ist, zentrifugieren Sie für 45 min bei 21.000 × gund seien Sie in Schritt 3.13 besonders vorsichtig, da das Pellet weniger kompakt ist.</li>
	<li>Übertragen Sie den Überstand vorsichtig mit einem Pipett in ein neues Rohr, um das Pellet so weit wie möglich zu stören. Wenn der übertragene Überstand mit Material aus dem Pellet verunreinigt ist, wiederholen Sie den vorherigen Schritt.</li>
	<li>Den Überstand auf 1,5 mL Zentrifugenröhrchen umfüllen und bei 21.000 × g (oder der Höchstgeschwindigkeit einer Tischzentrifuge) für 5 min noch einmal zentrifugieren.</li>
	<li>Aliquotieren Sie das gereinigte Autolysat in die gewünschten Volumina, vermeiden Sie sorgfältig verbleibende Pellets und frieren Sie bei -80 °C ein oder verwenden Sie es sofort. HINWEIS: Eine einzelne 20-μL-Reaktion verwendet 8 μL Autolysat.</li>
</ol>4. Zellfreie Genexpression
HINWEIS: Das Autolysat ist nun für jede gewünschte Endverwendung bereit. Im Folgenden finden Sie ein Beispiel für ein Standardprotokoll für die zellfreie Genexpression.
<ol><li>Für eine 20 μL-Reaktion mischen Sie auf Eis 8 μL Autolysat und 8,9 μL Premix. Siehe HINWEIS am Ende des Protokollabschnitts bezüglich der Optimierung der Magnesiumglutamat- und PEG 8000-Konzentrationen.</li>
	<li>Fügen Sie DNA (z. B. pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 auf eine Endkonzentration von 8 nM), andere Reagenzien und Wasser auf 20 μL hinzu.</li>
	<li>Platzieren Sie die Reaktion in einer 384-Well-Mikroplatte und messen Sie den Fluoreszenzzeitverlauf und/oder die Endpunkte mit einem Plattenleser. Verwenden Sie für grün fluoreszierendes Protein (GFP) eine Anregungswellenlänge von 485 nm und eine Emissionswellenlänge von 520 nm.</li>
</ol>5. Protokolländerungen
HINWEIS: Die folgenden Änderungen des Protokolls ermöglichen es, andere Anwendungen zu bedienen.
<ol><li>Zellfreie Genexpression mittels linearer DNA-Templates<ol>
<li>Führen Sie die Schritte in Abschnitt 4 durch und ergänzen Sie die Reaktion mit 2,2 μM gereinigtem GamS-Protein (exprimiert und gereinigt wie beschrieben12),bevor die lineare DNA hinzugefügt wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zellfreie Genexpression mit Proteinabbau<ol>
<li>Verwenden Sie in Schritt 2.1 Autolysatzellen, die das Plasmid pACYC-FLAG-dN6-His enthalten (siehe Materialtabelle). In allen Wachstumsmedien zusätzlich 34 μg/ml Chloramphenicol enthalten.</li>
		<li>In Schritt 2.3 werden 40 μM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) in das Wachstumsmedium aufgenommen, um die Expression aus dem Plasmid zu induzieren.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.4 (Waschen) zwei weitere Male (für insgesamt drei Wäschen), um die vollständige Entfernung von Chloramphenicol, einem Translationsinhibitor, sicherzustellen. Für die ersten beiden Waschungen (Schritt 3.4) ersetzen Sie den S30A-Puffer durch phosphatgepufferte Kochsalzlösung (pH 7,4).</li>
		<li>Ergänzen Sie in Schritt 4.2 ein zusätzliches 3 mM ATP (zugesetzt aus einer Stammlösung von 100 mM ATP in Wasser, pH 7,2) und 4,5 mM Magnesiumglutamat (unter Verwendung einer 1 M Stammlösung in Wasser) (Endkonzentrationen), um den hohen ATP-Einsatz durch ClpXP sowie die Chelatbildung von Magnesium durch das zusätzliche ATP auszugleichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zellfreie Genexpression mittels LacZ-basierter Auslesungen (einschließlich kolorimetrischer)<ol>
<li>Verwenden Sie in Schritt 2.1 Autolysatzellen, die LacZ nicht nativ exprimieren (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternativ können Sie das Lysat direkt aus gefriergetrockneten Zellen herstellen.<ol>
<li>Führen Sie alle Schritte von 1.1 bis 3.7 aus.</li>
		<li>Mischen Sie 8 μL Zellsuspension mit 8,9 μL Premix.</li>
		<li>Fügen Sie Plasmid-DNA (falls gewünscht), andere benutzerdefinierte Reagenzien und Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 20 μL zu erreichen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Reaktion auf eine 384-Well-Mikrotiterplatte und trocknen Sie sie gefrier. HINWEIS: Gefriergetrocknete Proben können bis zu einer Woche und möglicherweise länger gelagert werden.</li>
		<li>Um die Reaktion zu beginnen, rehydrieren Sie es mit 18 μL deionisiertem Wasser, ergänzt mit einer beliebigen DNA oder anderen Reagenzien.</li>
		<li>Verfolgen Sie die Fluoreszenzdynamik in einem Plattenleser.</li>
	</ol>
</li>
</ol>HINWEIS 1: Autolysatzellen sind so konzipiert, dass sie bei einem Gefrier-Tau-Zyklus lysieren, daher ist es besonders wichtig, kryoprotektiv bei der Herstellung von gefrorenen Beständen zu verwenden. Wir haben Bestände in 24% Gew./Vol.-Glycerin eingefroren und bei -80 °C gelagert.
ANMERKUNG 2: Magnesiumionen und PEG 8000 sind entscheidend für die Lysatleistung. Die Basen-2,5-fache Vormischung enthält auf der Grundlage zuvor veröffentlichter Daten 6 mM Magnesiumglutamat und 4,8 % Gew./Vol. PEG 8000, die in der Endreaktion zu 2,4 mM bzw. 1,9 % werden. Das mit dem hier hergestellten Autolysat funktioniert typischerweise am besten mit einem zusätzlichen 5 mM Mg-Glutamat und 1,5% PEG 8000 in der Endreaktion. Dies kann jedoch im Bereich von einem zusätzlichen 0-10 mM Mg Glutamat und einem zusätzlichen 0-3% PEG 8000 (im Vergleich zum Basenvormix) optimiert werden. Um die Vormischung mit den empfohlenen zusätzlichen 5 mM Mg-Glutamat und 1,5% PEG 8000 (Endkonzentrationen) herzustellen, mischen Sie 380 μL Vormischung mit 4,75 μL Magnesiumglutamat bei 1 M und 36,1 μL PEG 8000 bei 40% Gewicht/Volumen.

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</ol>

J.H. ist Mitbegründer von GenCirq Inc., die sich auf Krebstherapeutika konzentrieren. Er ist Mitglied des Board of Directors und hat Eigenkapital in GenCirq.

Das hier beschriebene Protokoll liefert hochaktives bakterielles Lysat für die zellfreie Genexpression. Der Schlüssel liegt darin, Zellen zu verwenden, die das Plasmid pAD-LyseR tragen, das den Lambda-Phagen Endolysin zytosolisch exprimiert. Diese Zellen werden potenziert, um sich bei der Permeabilisierung der inneren Membran selbst zu lysieren, so dass das Endolysin Zugang zur Zellwand erhält, was die Methode durch einen einfachen Gefrier-Tau-Zyklus erreicht. Da sich die Zellen effektiv selbst lysieren, wird das Produkt...

Die Genexpression in zellfreien Lysaten hat mehrere Vorteile gegenüber der Verwendung lebender Zellen1,2,3,4. Lysate können leicht biochemisch modifiziert und unter Bedingungen verwendet werden, die für lebende Zellen schädlich oder unmöglich zu erreichen sein könnten. Genexpressionsschaltkreise müssen nicht mit biologischen Prozessen des Wirts konkurrieren oder konkurrieren, und das Testen neuer genetischer Schaltkreise ist so einfach wie das Hinzufügen von DNA. Aus diesen Gründen hat die zellfreie Genexpression verschiedene Anwendungen gefunden, von den Biosensoren5,6 über das schnelle Prototyping synthetischer Genschaltkreise7,8 bis hin zur Entwicklung künstlicher Zellen9. Die meisten zellfreien Genexpressionen verwenden zelluläre Lysate, die hochgradig verarbeitet wurden und im Allgemeinen lange und komplexe Protokolle, spezielle Ausrüstung und / oder empfindliche Schritte erfordern, die zu erheblichen Abweichungen zwischen Benutzern und Chargen führen können10,11.
Dieses Papier beschreibt eine einfache, effiziente Methode zur Herstellung von zellfreiem Lysat, die minimale Verarbeitung und Expertise erfordert (Abbildung 1A)12. Die Methode basiert auf E. coli-Zellen, die so konstruiert sind, dass sie nach einem einfachen Gefrier-Tau-Zyklus lysieren. Die Zellen exprimieren ein Endolysin aus Phagen-Lambda, das die Zellwand abbaut. Während die Zellen wachsen, verbleibt dieses Endolysin im Zytoplasma, abgetrennt von der Zellwand. Ein einfacher Gefrier-Tau-Zyklus stört jedoch die zytoplasmatische Membran und setzt das Endolysin in das Periplasma frei, wo es die Zellwand abbaut, was zu einer schnellen Zelllyse führt. Das Protokoll kann mit nur wenigen Stunden praktischer Arbeit abgeschlossen werden und erfordert nur einen Gefrierschrank, eine Zentrifuge mit einer Kapazität von 30.000 × g (für optimale Ergebnisse; niedrigere Geschwindigkeiten können mit mehr Sorgfalt verwendet werden, um das Pellet nicht zu stören), einen Wirbelmischer und eine einfache Pufferlösung. Funktionelles Lysat kann sogar hergestellt werden, indem die Zellen gefriergetrocknet und in siturehydriert werden. Diese Methode produziert jedoch Lysate mit geringerer Aktivität, vermutlich aufgrund der verbleibenden Zelltrümmer.
Die Lysate sind hochaktiv für die zellfreie Genexpression und können je nach Endverwendung auf verschiedene Weise verbessert werden. Die Geschwindigkeit der Proteinsynthese kann weiter erhöht werden, indem das Lysat unter Verwendung von Standard-Spinkonzentratoren konzentriert wird. Lineare DNA kann durch Zugabe von gereinigtem GamS-Protein vor dem Abbau geschützt werden. Der Proteinabbau, der für komplexere Schaltkreisdynamiken wie Oszillation notwendig ist, kann durch Co-Exprimation eines ClpX-Hexamers im autolysatproduzierenden Stamm13erreicht werden. Schließlich werden LacZ-basierte visuelle Auslesungen ermöglicht, indem ein Autolysat-Stamm ohne lacZverwendet wird. Insgesamt erzeugt dieses Verfahren ein hochaktives zellfreies Lysat, das sich für ein breites Anwendungsspektrum eignet.

<table><tbody><tr><td>2xYT Medium</td><td>EMD Millipore</td><td>4.85008</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8877</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheit, 3 kDa Cutoff</td><td>Millipore Sigma UFC900308</td><td></td><td>optional, kann zum Konzentrieren von Lysat verwendet werden, Auswahl der Konzentratorkapazität, die für das zu konzentrierende Volumen geeignet</td></tr> ist <tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td>oder Carbenicillin, eine stabilere Variante</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8937</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9501</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4282</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>CTP</td><td>United States Biosciences</td><td>14121</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>D-Glucose (Dextrose)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1749603</td><td>oder äquivalentes</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>E. coli BL21-Gold (DE3) mit pAD-LyseR Addgene</td><td></td><td>99244</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL21-Gold (DE3) & Delta; lacZ mit pAD-LyseR</td>, <td>Addgene</td><td>99245</td><td></td></tr>, <tr><td>Folinsäure</td>, <td>Sigma Aldrich</td><td>F7878</td><td>oder gleichwertig</td></tr>, <tr><td>GTP</td><td>United States Biosciences</td><td>16800</td><td>oder gleichwertig</td></tr>, <tr><td>HEPES,</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>LB-Medium</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>DF0446075</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>Magnesiumglutamat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49605-250G</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>NAD</td>, <td>Sigma Aldrich</td><td>N6522</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>Kaliumglutamat,</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1501-100G</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid (KOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473-25G</td><td>zum Einstellen des pH-Werts</td></tr>, <tr><td>Kaliumphosphat, zweibasisch</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>monobasisches Kaliumphosphat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>85558</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>9310500GM</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>tRNA-Mix</td>, <td>Roche</td><td>10109541001</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>UTP</td><td>United States Biosciences</td><td>23160</td><td>oder gleichwertig</td></tr></tbody></table>

schnelle, kostengünstige und unkomplizierte herstellung von bakteriellem zellfreiem lysat

Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

Die zellfreie Genexpression bietet die Kraft der Biologie ohne die Komplikationen eines lebenden Organismus. Obwohl es viele solcher Genexpressionssysteme gibt, sind die meisten ziemlich teuer in der Anschaffung und / oder erfordern spezielle Ausrüstung und fein geschliffenes Fachwissen, um effektiv zu produzieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Herstellung von bakteriellem zellfreiem Lysat, das ein hohes Maß an Genexpression unterstützt, nur Standardlaborgeräte verwendet und nur minimale Verarbeitung erfordert. Die Methode verwendet einen Escherichia coli-Stamm, der ein Endolysin produziert, das das Wachstum nicht beeinflusst, aber ein geerntetes Zellpellet nach einem einfachen Gefrier-Tau-Zyklus effizient lysiert. Die einzige weitere Verarbeitung, die erforderlich ist, ist eine kurze Inkubation, gefolgt von einer Zentrifugation, um das Autolysat von Zelltrümmern zu befreien. Dynamische Genschaltkreise können durch heterologe Expression der ClpX-Protease in den Zellen vor der Ernte erreicht werden. Ein E. coli-Stamm, dem das lacZ-Gen fehlt, kann für hochempfindliche, zellfreie Biosensoranwendungen unter Verwendung einer kolorimetrischen oder fluoreszierenden Anzeige verwendet werden. Das gesamte Protokoll erfordert nur 8-9 Stunden, mit nur 1-2 Stunden praktischer Arbeit von der Impfung bis zur Fertigstellung. Durch die Reduzierung der Kosten und des Zeitaufwands für die Gewinnung von zellfreiem Lysat soll diese Methode die Erschwinglichkeit der zellfreien Genexpression für verschiedene Anwendungen erhöhen.

Repräsentative Ergebnisse können beobachtet werden, indem man mit Autolysat GFP aus einem konstitutiv exprimierenden Plasmid, hier pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, exprimiert und einen Zeitverlauf der GFP-Fluoreszenz in einem Plattenleser aufzeichnet (Abbildung 1B). Eine Verdünnungsserie von Plasmid-DNA fand selbst bei 1 nM-DNA eine starke Expression. Im Vergleich zu einem handelsüblichen Lysat kann das Autolysat eine größere Gesamtausbeute erzeugen und eine größere maximale Produktionsrate...

Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle und einfache Methode zur Herstellung von bakteriellem Lysat für die zellfreie Genexpression unter Verwendung eines technisch hergestellten Stammes von Escherichia coli und erfordert nur Standardlaborgeräte.

Schnelle, kostengünstige und unkomplizierte Herstellung von bakteriellem zellfreiem Lysat

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

Mit diesem Protokoll können hochwertige bakterielle Zelllysate nur mit allgemein verfügbaren Laborgeräten hergestellt werden, so dass die zellfreie Genexpression für die meisten Forscher leicht zugänglich ist. Die Kombination der zellulären Autolyse des Programms mit einem Gefrier-Tau- oder Gefrier-Trocken-Zyklus ermöglicht die Schaffung eines praktischen, arbeits- und kostengünstigen Ansatzes für die schnelle Produktion von Bakteriellen Lysaten für die zellfreie Genexpression. Beginnen Sie mit einer Impfschleife, um die Zellen eines Autolyse-E. coli-Stammes auf LB-Agarplatten mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin zu streifen, und inkubieren Sie die Platten dann über Nacht bei 37 Grad Celsius.Am nächsten Tag wird mit einer Pipettenspitze eine einzelne Kolonie aus der Agarplatte entnommen und in ein Kulturröhrchen gegeben, das LB-Medium mit Ampicillin enthält. Bauen Sie diese Starterkultur über Nacht bei 37 Grad Celsius an. Am nächsten Tag werden 400 Mikroliter der Starterkultur in einen Ein-Liter-Erlenmeyerkolben gegeben, der 400 Milliliter 2xYTPG-Medium enthält, ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin.Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 300 U / min. Messen Sie mit einem Spektralphotometer und einer optischen Küvette mit einer Weglänge von einem Zentimeter regelmäßig die optische Dichte der Kultur bei 600 Nanometern. Wenn die optische Dichte eins überschreitet, beginnen Sie vor den Messungen mit der fünffachen Verdünnung der Kultur, um sicherzustellen, dass die Messungen im linearen Bereich eines typischen Laborspektrophotometers bleiben.Sobald die optische Dichte der fünffach verdünnten Kultur 0,3 erreicht hat, nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und fahren Sie mit der Vorbereitung des Lysat fort. Um das Lysat vorzubereiten, ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1.800 x g für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Gießen Sie den Überstand ab und entfernen Sie die restliche Flüssigkeit mit einer Pipette.Fügen Sie dem Pellet 45 Milliliter kalten S30A-Puffer hinzu und resuspendieren Sie das Pellet durch Wirbeln. Wiegen Sie dann ein leeres 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, bevor Sie die Zellen in das Röhrchen übertragen. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut und verwerfen Sie den Überstand.Aspirieren Sie den verbleibenden Überstand mit einer Pipette. Wiegen Sie das Rohr erneut und subtrahieren Sie das Gewicht des leeren Rohres von dem angezeigten Gewicht, um das Gewicht des Pellets zu erhalten. Für jedes Milligramm Zellpellet fügen Sie zwei Mikroliter kalten S30A-Puffer hinzu, der mit zwei Millimolar-Dithiothreitol ergänzt wird.Dann resuspendieren Sie die Zellen durch kräftiges Wirbeln. Als nächstes frieren Sie die Zellen ein, indem Sie sie in einen minus 20 oder minus 80 Grad Celsius gefrierenden Gefrierschrank legen, bis das Pellet gründlich eingefroren ist, dann die Zellen in einem Wasserbad bei Raumtemperatur auftauen und zwei bis drei Minuten lang kräftig wirbeln. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten mit Schütteln bei 300 U / min und reinigen Sie dann die Probe von schweren Zelltrümmern, indem Sie sie in transparenten Zentrifugenröhrchen bei 30.000 x g für 45 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.Den Überstand vorsichtig mit einer Pipette in ein neues Röhrchen überführen, wobei darauf zu achten ist, das Pellet nicht zu stören. Wenn der übertragene Überstand mit Material aus dem Pellet kontaminiert ist, wiederholen Sie die Zentrifugation. Den Überstand in 1,5 Milliliter Zentrifugenröhrchen überführen.Und noch einmal mit 21.000 x g oder der maximalen Geschwindigkeit einer Tischzentrifuge für fünf Minuten zentrifugieren. Aliquot das gereinigte Autolysat in gewünschte Mengen und lagern bei minus 80 Grad Celsius bis zum Gebrauch. Für die zellfreie Genexpression mit dem Autolysat mischen Sie acht Mikroliter Autolysat und 8,9 Mikroliter Pre-Mix auf Eis.Fügen Sie DNA zu einer Endkonzentration von acht Nanomol, andere notwendige Reagenzien und Wasser hinzu, um ein endgültiges Volumen von 20 Mikrolitern zu erhalten. Fügen Sie die Reaktion zu einer 384-Well-Mikroplatte hinzu und verwenden Sie einen Plattenleser, um den Fluoreszenzzeitverlauf und die Endpunkte zu messen. Die GFP-Expression unter Verwendung des Autolysats mit einer Verdünnungsreihe von Plasma-DNA führt zu einer starken Expression selbst bei einer nanomolaren DNA.Beim Vergleich der GFP-Expression zwischen einem kommerziell erhältlichen Lysat und dem Autolysat ergab das Autolysat vergleichbare GFP-Werte. Die Variabilität zwischen Lysatchargen, die in zwei verschiedenen Labors von verschiedenen Forschern hergestellt wurden, betrug etwa das Doppelte. Die drei kritischsten Variablen sind das Verhältnis von Zellpellets zu Puffer, die Übertragung von schmutzfreiem Überstand und die Verwendung einer optimalen PEG- und Magnesiumkonzentration in der endgültigen Reaktion.Sobald der Extrakt vorbereitet ist, kann ein großes Arsenal bestehender Protokolle verwendet werden, die für zellfreie E.coli-Expressionssysteme entwickelt wurden, wie z. B. ClpXP-vermittelte Degradation oder AHL-vermittelte Quorum-Sensing.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Zellfreie Proteinexpression unter Verwendung eines bakteriellen Rohzellextrakts

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die Kosten und die notwendige Ausrüstung für E. Colizu generieren-basierte Zellextrakte und in-vitro- Protein Synthesereaktionen innerhalb von 4 Tagen oder weniger zu implementieren. Um die flexiblen Charakter dieser Plattform für breite Anwendungen nutzen zu können, diskutieren wir Reaktionsbedingungen, die angepasst und optimiert werden können.

Escherichia coli-basierte zellfreie Proteinsynthese: Protokolle für eine robuste, flexible und zugängliche Plattform-Technologie

Zellfreie Expressionssysteme sind leistungsstarke und kostengünstige Werkzeuge für den Hochdurchsatz-Synthese und Screening von wichtigen Proteinen. Hier beschreiben wir die Vorbereitung der zellfreien Protein Expressionssystems mit Vibrio Natriegens für die schnelle Proteinproduktion Plasmid-DNA, lineare DNA und mRNA-Vorlage verwenden.

Zellfreien Protein Ausdruck mithilfe der rasch wachsenden Bakterium Vibrio natriegens

Dieses Protokoll beschreibt die Methode, Materialien, Ausrüstung und Schritte zur Bottom-up-Vorbereitung von RNA und Protein produzierenden synthetischen Zellen. Das innere wässrige Fach der synthetischen Zellen enthielt das in einer Lipid-Bilayer (d. h. stabile Liposomen) eingekapselte S30-Bakterienlysat, das mit einem Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahren verkapselt war.

Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer

Wir präsentieren eine schnelle und kostengünstige Methode zur Herstellung des rekombinanten PURE zellfreien TX-TL-Systems mit Standard-Laborgeräten.

OnePot PURE Zellfreies System

Die Studie beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung großer (μg-mg) Mengen an DNA für Protein-Screening-Kampagnen aus synthetischen Genfragmenten ohne Klonen oder Verwendung lebender Zellen. Die minimale Schablone wird enzymatisch verdaut und zirkuliert und dann mit isothermer Rollkreisamplifikation amplifiziert. Zellfreie Expressionsreaktionen könnten mit dem ungemeinigten Produkt durchgeführt werden.

Schnelle, enzymatische Methoden zur Amplifikation minimaler, linearer Templates für das Protein-Prototyping mit zellfreien Systemen

Diese Arbeit beschreibt die Herstellung von Zellextrakt aus Escherichia coli (E. coli ) gefolgt von zellfreien Proteinsynthesereaktionen (CFPS) in weniger als 24 Stunden. Die Erläuterung des CFAI-Protokolls (Cell-Free Autoinduction) beschreibt Verbesserungen, die vorgenommen wurden, um die Aufsicht der Forscher zu reduzieren und die Mengen des erhaltenen Zellextrakts zu erhöhen.

Von der Zelle zur zellfreien Proteinsynthese innerhalb von 24 Stunden mit zellfreiem Autoinduktions-Workflow

Leishmania Translational Extract (LTE) ist ein eukaryotisches zellfreies Proteinexpressionssystem, das aus dem einzelligen Parasiten Leishmania tarentolae gewonnen wird. Dieses optimierte Protokoll macht LTE einfach und kostengünstig in der Herstellung. Es eignet sich für verschiedene Anwendungen, die sich auf die multiparallele Expression und Untersuchung komplexer eukaryotischer Proteine und ihrer Wechselwirkungen konzentrieren.

Produktion und Optimierung von LTE, einem von Leishmania tarentolae abgeleiteten zellfreien Proteinexpressionssystem für die rekombinante Proteinproduktion

Dieses Protokoll beschreibt das System der zellfreien Proteinsynthese (CFPS), das beim Aufbau synthetischer Zellen verwendet wird. Es skizziert Schlüsselphasen mit repräsentativen Ergebnissen in verschiedenen Mikrokompartimenten. Das Protokoll zielt darauf ab, Best Practices für verschiedene Labore in der synthetischen Zellgemeinschaft zu etablieren und den Fortschritt in der Entwicklung synthetischer Zellen voranzutreiben.

Zellfreies Proteinsynthesesystem für den Aufbau synthetischer Zellen

Wir präsentieren ein aktualisiertes Protokoll für die Herstellung des OnePot-Systems "Protein synthesis Using Recombinant Elements" (PURE) und roher Ribosomen für die zellfreie Proteinsynthese, wobei der Schwerpunkt auf der Kontrolle des Zellwachstums liegt, um Variationen von Charge zu Charge zu minimieren.

Verfeinerung von OnePot PURE und Roh-Ribosomen-Produktion für reproduzierbare zellfreie Proteinsynthese

Erfahren Sie eine schnelle Methode zur Herstellung bakterieller Lysate für zellfreie Genexpression mit Escherichia coli. Dieses Protokoll ermöglicht Forschern kostengünstige und zuverlässige Proteinexpression ohne lebende Zellen.

Schnelle, kostengünstige und unkomplizierte Herstellung von bakteriellem zellfreiem Lysat

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