Name: Chemische Modifikation des Tryptophan-Rückstands in einer rekombinantenCa2+-ATPase-N-Domäne zur Untersuchung von Tryptophan-ANS FRET (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Erfahren Sie die chemische Modifikation von Tryptophan-Rückständen in rekombinanten Ca2+-ATPase-N-Domänen zur Untersuchung von ANS-FRET. Diese Methode klärt die Rolle von Tryptophan bei Proteinbindungsstudien auf.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch die FAI-UASLP-Fördernummer C19-FAI-05-89.89 und die CONACYT-Zuschussnummer 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021)finanziert. Die Autoren danken der technischen Unterstützung von Julian E. Mata-Morales in der Videoausgabe.

1. Bestimmung (in silico) der ANS- und SERCA-N-Domänen-Interaktion
<ol><li>Generieren Sie eine dreidimensionale (3D) Struktur des Proteins (SERCA N-Domäne) durch molekulare Modellierung mit der bevorzugten Proteinmodellierungssoftware50.</li>
	<li>Identifizieren Sie die Aminosäurereste, die die Nukleotidbindungsstelle bilden, mit der bevorzugten Molekularstruktursoftware51und bestimmen Sie das Vorhandensein von Arg- und Lys-Rückständen35; diese werden für die ANS-Bindung und zur Erhöhung der Fluoreszenzintensität (Quantenausbeute) benötigt.</li>
	<li>Führen Sie molekulares Andocken (mit der bevorzugten Docking-Software)52,53,54 durch, um die Wechselwirkungen von ATP, Fluoresceinisothiocyanat (FITC) (das eine kovalente Bindung mit Lys515 bildet, das die Nukleotidbindungsstelle markiert) und ANS mit Aminosäureresten in der Nukleotidbindungsstelle zu bestimmen ( Abbildung1).</li>
	<li>Berechnen Sie den molekularen Abstand (Å) zwischen Trp-Rückstand und gebundenem ANS mit dem Messwerkzeug in der bevorzugten Software.</li>
	<li>Durchführung einer molekulardynamischen Simulation des ANS-N-Domänenkomplexes, um die Stabilität der Wechselwirkung zu bestimmen52,54. Führen Sie dann die In-vitro-Experimente durch, wenn die Stabilität des Komplexes bestätigt wurde.</li>
</ol>2. Expression und Reinigung der rekombinanten N-Domäne
<ol><li>Synthetisieren Sie das Gen, das für die N-Domäne40kodiert.</li>
	<li>Entwerfen und konstruieren Sie das Plasmid, das das synthetische Gen enthält, das für die N-Domäne40 kodiert.</li>
	<li>Express und Reinigung durch Affinitätschromatographie (Ni-NTA), die entwickelte rekombinante N-Domäne. Führen Sie eine SDS-PAGE des gereinigten Proteins durch, um die Reinheit zu bestimmen (Abbildung 2)40.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Proteinkonzentration durch Untersuchung der Absorption bei λ von 280 nm mit dem N-Domänen-Extinktionskoeffizienten (ε= 11.960 M-1·cm-1)40.</li>
</ol>3. Überwachen Sie die Bildung des ANS-N-Domänenkomplexes basierend auf ANS- und N-Domänen-Fluoreszenzintensitätsänderungen.
<ol><li>Bereiten Sie eine ANS-Stammlösung in N,N-Dimethylformamid vor.<ol>
<li>Wiegen Sie eine kleine Menge (1-5 mg) ANS und lösen Sie es in 1 ml des Endvolumens von N,N-Dimethylformamid, z. B. 3,2 mg (10,69 mM Endkonzentration).</li>
		<li>Eine 100 μM ANS wässrige Stammlösung unter Verwendung der ANS-Lösung in N,N-Dimethylformamid herstellen, z. B. 9,4 μL der 10,69 mM ANS-Lösung zu 990,6 μL 50 mM Phosphatpuffer mit pH 8,0 hinzufügen, um ein Endvolumen von 1 ml zu erhalten.</li>
		<li>Mischen Sie die Lösungen durch Vortexing 3 - 5 mal für 15 s. HINWEIS: Verwenden Sie im folgenden Experiment nur die ANS-wässrige Stammlösung. Bereiten Sie die wässrige ANS-Stammlösung frisch vor, bevor Sie mit den Experimenten beginnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die NBS-Stammlösung in N,N-Dimethylformamid vor.<ol>
<li>Wiegen Sie eine kleine Menge (1-5 mg) NBS und lösen Sie es in 1 ml N,N-Dimethylformamid, z. B. 5,3 mg in 1 ml (29,78 mM Endkonzentration).</li>
		<li>Eine 1 mM NBS wässrige Stammlösung unter Verwendung der NBS-Lösung in N,N-Dimethylformamid herstellen, z. B. 3,36 μL der 29,78 mM NBS-Lösung zu 96,64 μL 50 mM Phosphatpuffer mit pH 8,0 hinzufügen, um ein Endvolumen von 0,1 ml zu erhalten.</li>
		<li>Mischen Sie die Lösungen durch Vortexing 3 - 5 mal für 15 s. HINWEIS: Bereiten Sie die nbS-wässrige Stammlösung frisch vor, bevor Sie mit den Experimenten beginnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Titrieren Sie die N-Domäne mit ANS und zeichnen Sie die Fluoreszenzspektren durch Anregung bei λ=295 nm bei 25 °C auf.<ol>
<li>Erhalten Sie die Ausgangslinie des Fluoreszenzspektrums.<ol>
<li>1 ml 50 mM Phosphatpuffer mit pH 8,0 in eine 1 mL Fluoreszenzquarzküvette geben.</li>
			<li>Positionieren Sie die Zelle in der thermo-angegebenen Zellkammer (25 °C) des Spektrofluorometers und stellen Sie die Anregung λ auf 295 nm ein.</li>
			<li>Zeichnen Sie das Fluoreszenzspektrum auf (305 - 550 nm). HINWEIS: Das Fluoreszenzspektrum des 50 mM Phosphatpuffers mit pH 8,0, der als Blindprobe dient, wird von allen erhaltenen Fluoreszenzspektren abgezogen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Erhalten Sie das intrinsische Fluoreszenzspektrum der N-Domäne.<ol>
<li>900 μL 50 mM Phosphatpuffer mit pH 8,0 in eine Fluoreszenzquarzküvette geben.</li>
			<li>Fügen Sie 100 μL N-Domänen-Suspension (10 μM) hinzu, um eine 1 μM N-Domänen-Endkonzentration in einem Endvolumen von 1 ml zu erhalten.</li>
			<li>Vorsichtig homogenisieren Sie mit einer Mikropipette 20 Mal, um die Homogenität der Lösung zu gewährleisten. HINWEIS: Das Protein sollte frisch gereinigt werden, um hochwertige intrinsische Fluoreszenzspektren zu erhalten, z. B. darf die gereinigte rekombinante N-Domäne nur eine Woche nach der Reinigung verwendet werden.</li>
			<li>Positionieren Sie die Zelle in der thermo-angegebenen Zellkammer (25 °C) des Spektrofluorometers und stellen Sie die Anregung λ auf 295 nm ein.</li>
			<li>Erfassen Sie das intrinsische Fluoreszenzspektrum der N-Domäne (305-550 nm).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fügen Sie ANS hinzu und erhalten Sie das Fluoreszenzspektrum durch Anregung bei λ = 295 nm.<ol>
<li>Der suspendierten N-Domäne (1 μM) wird ein 2 μL Aliquot von 100 μM ANS wässriger Stammlösung hinzugefügt, um eine ANS-Endkonzentration von 0,2 μM zu erhalten.</li>
			<li>Vorsichtig homogenisieren Sie mit einer Mikropipette 20 Mal, um die Homogenität der Lösung zu gewährleisten.</li>
			<li>Positionieren Sie die Zelle in der thermostabilen Zellkammer (25 °C) des Spektrofluorometers und stellen Sie die Anregung λ auf 295 nm ein.</li>
			<li>Zeichnen Sie das Fluoreszenzspektrum auf (305-550 nm).</li>
			<li>Wiederholen Sie die ANS-Additionen und Fluoreszenzspektren, die über der 1:1-Molarenbeziehung ANS:N-Domäne aufgezeichnet wurden.</li>
			<li>Subtrahieren Sie das Leerespektrum von jedem Spektrum mit geeigneter Software.</li>
			<li>Zeichnen Sie alle Spektren in einem einzigen Diagramm auf.</li>
			<li>Bestimmen Sie, ob die Spektren ein FRET-ähnliches Muster bilden. Die ANS-N-Domänen-Fluoreszenzspektren bilden ein FRET-ähnliches Muster (Abbildung 3A).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. N-Domäne intrinsische Fluoreszenztitration durch Trp chemische Modifikation mit NBS.
<ol><li>Wiederholen Sie die Schritte 3.3.1 und 3.3.2.</li>
	<li>Der suspendierten N-Domäne (1 μM) wird ein 1 μL Aliquot von 1 mM NBS wässriger Stammlösung hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 1 μM NBS zu erhalten.</li>
	<li>Vorsichtig homogenisieren, indem Sie eine Mikropipette 20 Mal verwenden, um die Homogenität der Lösung zu gewährleisten.</li>
	<li>Positionieren Sie die Zelle in der thermostabilen Zellkammer (25 °C) des Spektrofluorometers und stellen Sie die Anregung λ auf 295 nm ein.</li>
	<li>Zeichnen Sie das Fluoreszenzspektrum (305-550 nm) auf (Abbildung 3B).</li>
	<li>Wiederholen Sie die Aufzeichnung der NBS-Addition und der Fluoreszenzspektren, bis eine minimale N-Domänen-intrinsische Fluoreszenzabschreckung beobachtet wird40. In der N-Domäne geschieht dies normalerweise bei einem molaren Verhältnis von 5-6 NBS/N-Domäne40. HINWEIS: NBS löscht schnell (<5 s) die intrinsische Fluoreszenz der N-Domäne; eine Abnahme der Fluoreszenzintensität wird beobachtet. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort, da NBS auch mit anderen Aminosäureresten reagieren kann47.</li>
	<li>Subtrahieren Sie das Leerespektrum von jedem Spektrum mit geeigneter Software.</li>
	<li>Zeichnen Sie alle Spektren in einem einzigen Diagramm auf (Abbildung 3B).</li>
</ol>5. Titrieren Sie die NBS-modifizierte N-Domäne mit ANS, indem Sie Fluoreszenzspektren bei 25 °C aufzeichnen.
<ol><li>Führen Sie Schritt 3.3.3 mit der NBS-modifizierten N-Domäne aus, die in Schritt 4 generiert wurde.</li>
	<li>Subtrahieren Sie das Leerespektrum von jedem Spektrum mit geeigneter Software.</li>
	<li>Zeichnen Sie alle Spektren in einem einzigen Diagramm auf (Abbildung 3C).</li>
	<li>Die erzeugten Fluoreszenzspektren (Abbildung 3C) unterstützen oder widerlegen das Auftreten von FRET, d.h. wenn FRET auftritt, steigt die ANS-Fluoreszenz nicht an und umgekehrt.</li>
</ol>6. Nachweis der ANS-Bindung an die chemisch modifizierte N-Domäne durch Anregung bei λ=370 nm.
<ol><li>Führen Sie Schritt 3.3.3 mit der NBS-modifizierten N-Domäne aus, die in Schritt 4 generiert wurde, ändern Sie jedoch die Anregung λ auf 370 nm.</li>
	<li>Subtrahieren Sie das Leerespektrum von jedem Spektrum mit geeigneter Software.</li>
	<li>Zeichnen Sie alle Spektren in einem einzigen Diagramm auf (Abbildung 3D).</li>
	<li>Bestätigen Sie die ANS-Bindung an die N-Domäne, indem Sie die Zunahme der ANS-Fluoreszenzintensität beobachten. Die ANS-Bindung an die N-Domäne zeigt einen Fluoreszenzanstieg, wenn sie bei λ=370 nm angeregt wird (Abbildung 3D). Als Kontrolle wurde das Fluoreszenzspektrum von ANS (allein) in 50 mM Phosphatpuffer mit pH 8,0 bei λ von 295 und 370 nm anregend erhalten(Abbildung 4,nicht im Video gezeigt). HINWEIS: Die stöchiometrische Beziehung von NBS:Trp, die für die chemische Modifikation erforderlich ist, hängt vom Grad der Vergrabenung der Trp-Rückstände in dem untersuchten Protein46,47,55,56ab . Daher empfiehlt es sich, das Molverhältnis NBS:Protein/(Trp) vorher zu bestimmen.</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Fluoreszenzspektren des ANS-N-Domänenkomplexes zeigen ein FRET-ähnliches Muster, wenn sie bei einem λ von 295 nm angeregt werden, während der molekulare Abstand (20 Å) zwischen dem Trp-Rückstand und ANS das Auftreten von FRET zu unterstützen scheint (Abbildung 1). Die chemische Modifikation von Trp durch NBS führt zu einer weniger fluoreszierenden N-Domäne (Abbildung 3B, Spektrum f); daher ist eine Energieübertragung nicht möglich. Die ANS-Fluoreszenzspektren äh...

Föster-Resonanz-Energietransfer (FRET) ist zu einer Standardtechnik zur Bestimmung des Abstands zwischen molekularen Strukturen nach Bindung oder Interaktion in Proteinstruktur- und Funktionsstudien1,2,3,4geworden. In P-Typ ATPasen wurde FRET verwendet, um die Struktur und Funktion des sarko-endoplasmatischen RetikulumsCa2+-ATPase (SERCA)2,5,6,7,8zu untersuchen, z. B. wurden strukturelle Fluktuationen während des katalytischen Zyklus im gesamten Protein mit FRET7analysiert.
FRET-Donatoren sind vielfältig und reichen von kleinen fluoreszierenden (extrinsischen) Molekülen bis hin zu fluoreszierenden Proteinen9,10. Tryptophan (Trp)-Rückstände (aufgrund ihrer Fluoreszenz) sind nützlich, um strukturelle Veränderungen in Proteinaminosäuresequenzen zu identifizieren11,12. Die Fluoreszenzintensität von Trp hängt wesentlich von der Polarität seiner Umgebung ab13,14. Die Ligandenbindung erzeugt in der Regel strukturelle Umlagerungen in Proteinen/Enzymen15,16. Wenn Trp an oder in der Nähe der Proteinbindungsstelle vorhanden ist, beeinflussen strukturelle Schwankungen häufig den Grad der Trp-Exposition gegenüber wässrigen Medien13,14; somit führt die Änderung der Polarität zum Abschrecken der Trp-Fluoreszenzintensität13,14. Daher ist die fluoreszierende Eigenschaft von Trp nützlich für die Durchführung von Ligandenbindungsstudien für Enzyme. Andere physikalische Phänomene können auch zu Trp-Fluoreszenzabschreckung17,18,19,20, z. B. FRET und Änderungen der mittleren Polarität führen. Auch der Energietransfer vom angeregten Zustand von Trp auf ein Fluorophor hat Anwendungsmöglichkeiten, z. B. die Affinitätsbestimmung kleiner Liganden in Proteinen21. Tatsächlich wurde Trp in erster Linie als Fluoreszenzdonor in FRET-Studien in Proteinen22,23,24verwendet, z. B. in Terbium (Tb3+) FRET-Studien wird ein Trp-Rückstand häufig als Antenne zur Energieübertragung auf Tb3+25,26,27verwendet. Trp zeigt verschiedene Vorteile gegenüber anderen FRET-Spendern aufgrund seines inhärenten konstitutiven Charakters in der Proteinstruktur, wodurch die Notwendigkeit präparativer Prozesse, die die Funktion / Struktur des untersuchten Proteins beeinflussen können, eliminiertwird 24. Daher ist die Identifizierung von Strahlungszerfällen (Energietransfer und Veränderungen der mittleren Polarität, die durch proteinstrukturelle Umlagerungen induziert werden) wichtig, um genaue Rückschlüsse auf die Ligandenbindung in Proteinstrukturstudien zu ziehen13,14,19,28.
In Proteinstrukturstudien wurde ein extrinsisches Fluorophor, nämlich 8-Anilino-1-naphthalinsulfonat (ANS), hauptsächlich in Experimenten im Zusammenhang mit der Proteinfaltung / -entfaltungverwendet 28,29. ANS bindet an Proteine/Enzyme im nativen Zustand, meist an den Bindungsstellen der Substrate31,32,33; eine Erhöhung der ANS-Fluoreszenzquantenausbeute (ΦF) (nämlich eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität) wird durch Anregen des Proteins bei λ=370 nm induziert, wenn geeignete Wechselwirkungen von ANS mit Arg und His-Rückständen in hydrophoben Taschen auftreten34,35,36,37. In verschiedenen Studien wurde das Auftreten von FRET (bei Anregung bei λ innerhalb von 280-295 nm) zwischen Trp-Rückständen (Spendern) und ANS (Akzeptor) berichtet, das auf Folgendem basiert: 1) Überlappung des Fluoreszenzemissionsspektrums von Trp und des Anregungsspektrums von ANS, 2) Identifizierung eines geeigneten Abstands zwischen einem oder mehreren Trp-Resten und ANS für die Energieübertragung, 3) hohe ANS-Quantenausbeute bei Bindung in Proteintaschen und 4) charakteristisches FRET-Muster in den Fluoreszenzspektren des Proteins in Gegenwart von ANS3,17,27,37,38.
Kürzlich wurde die Ligandenbindung an die Nukleotidbindungsdomäne (N-Domäne) in SERCA und anderen P-Typ-ATPasen unter Verwendung von technisch hergestellten rekombinanten N-Domänen40,41,42,43,44,45,46untersucht. Molecular Engineering der SERCA N-Domäne wurde verwendet, um den einzigen Trp-Rückstand (Trp552Leu) in eine dynamischere Struktur (Tyr587Trp) zu bewegen, die sich in der Nähe der Nukleotidbindungsstelle befindet, wo Fluoreszenzvariationen (Quenching) verwendet werden können, um strukturelle Veränderungen bei Ligandenbindung zu überwachen34. Experimentelle Ergebnisse haben gezeigt, dass ANS (als ATP) an die Nukleotidbindungsstelle in der gereinigten rekombinanten SERCA N-Domäne34bindet. Interessanterweise nimmt die ANS-Fluoreszenz bei der Bindung an die N-Domäne bei Anregung bei einem λ von 295 nm zu, während die intrinsische Fluoreszenz der N-Domäneum 34abnimmt, wodurch ein FRET-Muster erzeugt wird, das auf die Bildung eines Trp-ANS-FRET-Paares hindeutet.
Die Verwendung von NBS wurde vorgeschlagen, um den Gehalt an Trp-Rückständen in Proteinen47 durch Absorptionstest modifizierter Proteine zu bestimmen. NBS modifiziert die hochabsorbierende Indolgruppe von Trp zum weniger saugfähigen Oxindol47,48. Daraus ergibt sich der Verlust (Abschrecken) der Trp-Fluoreszenzeigenschaft40. Daher kann die NBS-vermittelte chemische Modifikation von Trp-Rückständen als Assay verwendet werden, um die Rolle von Trp (als Spender) zu definieren, wenn FRET hypothetisch ist.
Dieses Protokoll beschreibt die chemische Modifikation des einzigen Trp-Rückstands durch NBS in der technisch rekombinanten N-Domäne von SERCA als Proteinmodell. Experimentelle Ergebnisse zeigen, dass die ANS-Fluoreszenzintensität in der chemisch NBS-modifizierten N-Domäne34,der eine intrinsische Fluoreszenz fehlt, noch zunimmt. Daher ist der Assay nützlich, um das Fehlen von FRET zwischen dem Trp-Rückstand und ANS nachzuweisen, wenn es an die N-Domäne34,40,49gebunden ist . Daher ist dieser Assay (NBS chemische Modifikation von Trp) nützlich, um das Vorhandensein des Trp-ANS FRET-Paares in Proteinen nachzuweisen.

<table><tbody><tr><td>Acrylamid</td><td>Bio-Rad</td><td>1610107</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Bio-Rad</td><td>1610700</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1028</td><td>Fluorophor</td></tr><tr><td>Bis-acrylamid</td><td>Bio-Rad</td><td>1610125</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>N-Bromosuccinimid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B81255</td><td>Chemikalie Modifikation</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamid</td><td>J.T. Baker</td><td>9213-12</td><td>Herstellung von Stammlösungen</td></tr><tr><td>Fluorescein-Isothiocyanat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>Chemisches Fluoreszenzmarkierungsmittel</td></tr><tr><td>Fluoreszenzküvette</td><td>Hellma</td><td>Z801291</td><td>Fluoreszenzassay</td></tr><tr><td>Fluoreszenzspektrofluorometer</td><td>Shimadzu</td><td>RF 5301PC</td><td>Fluoreszenzassay</td></tr><tr><td>HisTrap & Handel; FF</td><td>GE Healtcare</td><td>11-0004-59</td><td>Proteinaufreinigung</td></tr><tr><td>IPTG, Dioxanfrei</td><td>American Bionalytical</td><td>AB00841-00010</td><td>Proteinexpression</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513-25G</td><td>Proteinaufreinigung</td></tr><tr><td>LB Medien</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Pipetman L P10L</td><td>Gilson</td><td></td><td>FA10002M Fluoreszenz Assay</td></tr><tr><td>Pipetman L P100L</td><td>Gilson</td><td>FA10004M</td><td>Fluoreszenzassay</td></tr><tr><td>Pipetman L P200L</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td>Fluoreszenzassay</td></tr><tr><td>Pipetman L P1000L</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td>Fluoreszenzassay</td></tr><tr><td>Pipetman L P5000L</td><td>Gilson</td><td>FA10007</td><td>Fluoreszenzassay</td></tr><tr><td>Precision plus std</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Bio-Rad</td><td>1610302</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td>J.T. Baker</td><td>3828-19</td><td>Pufferaufbereitung</td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch</td><td>J.T. Baker</td><td>3818-01</td><td>Puffervorbereitung</td></tr><tr><td>Spritzenfilter 0,2 μm</td><td>Millipore</td><td>GVWP04700</td><td>Lösungsfiltration</td></tr><tr><td>Temed</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td>SDB-SEITE</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Bio-Rad</td><td>1610719</td><td>SDB-PAGE</td></tr></tbody></table>

chemische modifikation des tryptophan-rückstands in einer rekombinantenca2+-atpase-n-domäne zur untersuchung von tryptophan-ans fret

Chemical Modification of the Tryptophan Residue in a Recombinant Ca2+-ATPase N-domain for Studying Tryptophan-ANS FRET

Das sarko-/endoplasmatische Retikulum Ca2+-ATPase (SERCA) ist eine P-Typ-ATPase, die in verschiedenen Konformationen kristallisiert wurde. Detaillierte funktionelle Informationen können jedoch aus isolierten rekombinanten Domänen gewonnen werden. Die entwickelte (Trp552Leu und Tyr587Trp) rekombinante Nukleotidbindungsdomäne (N-Domäne) zeigt eine Fluoreszenzabschreckung bei ligandenbindung. Ein extrinsisches Fluorophor, nämlich 8-Anilino-1-naphthalinsulfonat (ANS), bindet über elektrostatische und hydrophobe Wechselwirkungen mit Arg-, His-, Ala-, Leu- und Phe-Rückständen an die Nukleotidbindungsstelle. Die ANS-Bindung wird durch die Zunahme der Fluoreszenzintensität bei Einer Anregung bei einer Wellenlänge (λ) von 370 nm nachgewiesen. Bei einer Anregung bei λ von 295 nm scheint die Zunahme der Fluoreszenzintensität jedoch an das Abschrecken der intrinsischen N-Domänenfluoreszenz gekoppelt zu sein. Fluoreszenzspektren zeigen ein Föster-Resonanzenergieübertragungsmuster (FRET)-ähnliches Muster, was auf das Vorhandensein eines Trp-ANS FRET-Paares hindeutet, das durch die kurze Entfernung (~20 Å) zwischen Tyr587Trp und ANS unterstützt zu werden scheint. Diese Studie beschreibt eine Analyse des Trp-ANS FRET-Paares durch chemische Trp-Modifikation (und Fluoreszenzabschreckung), die durch N-Bromosuccinimid (NBS) vermittelt wird. In der chemisch modifizierten N-Domäne erhöhte sich die ANS-Fluoreszenz bei einer Anregung bei einem λ von 295 nm, ähnlich wie bei einer Anregung bei einem λ von 370 nm. Daher kann die NBS-vermittelte chemische Modifikation des Trp-Rückstands verwendet werden, um das Fehlen von FRET zwischen Trp und ANS zu untersuchen. In Abwesenheit von Trp-Fluoreszenz sollte man keinen Anstieg der ANS-Fluoreszenz beobachten. Die chemische Modifikation von Trp-Rückständen in Proteinen durch NBS kann nützlich sein, um FRET zwischen Trp-Rückständen zu untersuchen, die sich in der Nähe des gebundenen ANS befinden. Dieser Assay wird wahrscheinlich auch bei der Verwendung anderer Fluorophore nützlich sein.

Molekulares Andocken zeigt die Bindung von ANS an die Nukleotidbindungsstelle der N-Domäne über elektrostatische sowie hydrophobe Wechselwirkungen (Abbildung 1). Der molekulare Abstand (20 Å) zwischen dem Trp-Rückstand und ANS (gebunden an die Nukleotidbindungsstelle) unterstützt das Auftreten von FRET (Abbildung 1). Die entworfene (engineered) rekombinante N-Domäne wurde bei hoher Reinheit durch Affinitätschromatographie (Abbildung 2</stron...

ANS bindet an die ca2+-ATPase rekombinante N-Domäne. Fluoreszenzspektren zeigen bei Anregung bei einer Wellenlänge von 295 nm ein FRET-ähnliches Muster. NBS-vermittelte chemische Modifikation von Trp löscht die Fluoreszenz der N-Domäne, was zum Fehlen eines Energietransfers (FRET) zwischen dem Trp-Rückstand und ANS führt.

Chemische Modifikation des Tryptophan-Rückstands in einer rekombinantenCa2+-ATPase-N-Domäne zur Untersuchung von Tryptophan-ANS FRET

The sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) is a P-type ATPase that has been crystallized in various conformations. Detailed functional ...

Diese Assays können helfen, die Rolle von Tryptophan-Rückständen in Proteinen bei der Durchführung von ANS-Bindungsstudien zu klären. Die ANS-Fluoreszenz nimmt bei bindung an bestimmte Strukturstellen in Proteinen zu. Manchmal befindet sich die ANS-Bindungsstelle in der Nähe eines Tryptophan-Rückstands mit einem Abstand, der auf die Existenz von FRET zwischen Tryptophan und ANS hindeutet.NBS vermittelt die chemische Modifikation von Tryptophanrückständen in Proteinen und löscht deren Fluoreszenz ab. Daher erlauben diese Assays zu bestimmen, ob Tryptophanrückstände zur Erhöhung der ANS-Fluoreszenzintensität durch FRET beitragen. In dieser Arbeit verwenden wir eine entwickelte rekombinante Nukleotidbindungsdomäne aus SERCA, die Mutationen enthält, mit dem Ziel, ein Tryptophan in der Nähe der Nukleotidbindungsstelle zu lokalisieren, an der auch ANS bindet.Dieser Assay ist schnell und einfach durchzuführen, daher sein Hauptvorteil. Bestimmung der ANS- und SERCA-N-Domänen-Interaktion in silico. Generieren Sie eine dreidimensionale Struktur des Proteins durch molekulare Modellierung mit der bevorzugten Proteinmodellierungssoftware.Identifizieren Sie die Aminosäurereste, die die Nukleotidbindungsstelle bilden, mit der bevorzugten molekularen Struktursoftware und bestimmen Sie das Vorhandensein von Arginin- und Lysinresten. Diese werden für die ANS-Bindung benötigt und erhöhen die Fluoreszenzintensität. Aufgrund des Vorhandenseins von Arginin- und Lysinresten in der Nukleotidbindungsstelle von SERCA stellen wir die Hypothese auf, dass ANS an die N-Domäne gebunden ist.Im 3D-Modell werden die Aminosäurereste, die die ATP-Bindungsstelle bilden, identifiziert und orange hervorgehoben. In ähnlicher Weise ist die Tyrosin-zu-Tryptophan-Mutation blau lokalisiert und hervorgehoben. Führen Sie molekulares Andocken mit ATP, FITC und ANS durch.Die Docking-Ergebnisse zeigen, dass ANS ähnlich wie ATP und FITC gut in die Nukleotidbindungsstelle passt. FITC kennzeichnet die Nukleotidbindungsstelle. Berechnen Sie den molekularen Abstand zwischen dem Tryptophan-Rückstand und ANS.20 Angström scheint ein angemessener Abstand für FRET zu sein. Führen Sie eine molekulardynamische Simulation des ANS-N-Domänenkomplexes durch, um die Stabilität der Wechselwirkung zu bestimmen. Eine Simulationszeit von 10 Nanosekunden zeigt die Stabilität des Komplexes.Fahren Sie mit der Durchführung der In-vitro-Experimente fort. Expression und Reinigung der rekombinanten N-Domäne. Drücken und reinigen Sie durch Affinitätschromatographie die entwickelte rekombinante N-Domäne.Führen Sie eine SDS-PAGE des gereinigten Proteins durch, um die Reinheit zu bestimmen. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration durch Absorption bei einer Wellenlänge von 280 Nanometern mit dem N-Domänen-Extinktionskoeffizienten. Überwachen Sie die Bildung des ANS-N-Domänenkomplexes basierend auf ANS- und N-Domänen-Fluoreszenzintensitätsänderungen.Bereiten Sie eine ANS-Stammlösung in N, N-Dimethylformamid vor. Wiegen Sie eine kleine Menge ANS zwischen einem und fünf Milligramm. ANS in einem ml Endvolumen von N, N-Dimethylformamid auflösen.Bereiten Sie eine 100 mikromolare ANS-Stammlösung mit der ANS-Lösung in N, N-Dimethylformamid vor. Mischen Sie die Lösung durch Drei- bis Fünffaches. Bereiten Sie die NBS-Stammlösung in N, N-Dimethylformamid vor.Wiegen Sie eine kleine Menge NBS, ein bis fünf Milligramm. Lösen Sie das NBS in einem ml N,N-Dimethylformamid auf. Bereiten Sie eine ein millimolare NBS-Stammlösung mit der NBS-Lösung in N, N-Dimethylformamid vor.Mischen Sie die Lösung durch Drei- bis Fünffaches. Titrieren Sie die N-Domäne mit ANS und zeichnen Sie die Fluoreszenzspektren zur Anregung bei einer Wellenlänge von 295 Nanometern bei 25 Grad auf. Erhalten Sie die Ausgangslinie des Fluoreszenzspektrums.Legen Sie einen ml 50 Millimolarphosphatpuffer mit pH acht in eine ein ml Fluoreszenzquarzküvette. Positionieren Sie die Zelle in der thermostatisierten Zellkammer des Spektralphotometers und stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 295 Nanometer ein. Zeichnen Sie das Fluoreszenzspektrum auf.Das Fluoreszenzspektrum des Rohlings zeigt die Spitze des Wassers, die später subtrahiert werden muss. Erhalten Sie das intrinsische Fluoreszenzspektrum der N-Domäne. 900 Mikroliter 50 Millimolarphosphatpuffer mit pH 8 in eine Fluoreszenzquarzküvette geben.Fügen Sie 100 Mikroliter N-Domänensuspension hinzu, um eine mikromolare N-Domänen-Endkonzentration zu erhalten. Vorsichtig homogenisieren Sie mit einer Mikropipette, um die Homogenität der Lösung zu gewährleisten. Positionieren Sie die Zelle in der thermostatischen Kammer des Spektralphotometers.Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 295 Nanometer ein. Zeichnen Sie das intrinsische Fluoreszenzspektrum der N-Domäne auf. Fügen Sie ANS hinzu und erhalten Sie das Fluoreszenzspektrum durch Anregung bei einer Wellenlänge von 295 Nanometern.Fügen Sie der suspendierten N-Domäne ein Aliquot mit zwei Mikrolitern aus 100 Mikromolaren ANS-Stammlösung hinzu, um eine Endkonzentration von 0,2 Mikromolar ANS zu erhalten. Vorsichtig homogenisieren, indem Sie eine Mikropipette verwenden, um die Homogenität dieser Lösung zu gewährleisten. Zeichnen Sie das Fluoreszenzspektrum auf.Wiederholen Sie die ANS-Additionen und die Fluoreszenzspektralaufzeichnung wie oben beschrieben für eine 1:1 ANS N-Domänenmolarbeziehung. Subtrahieren Sie das leere Spektrum von jedem Spektrum mithilfe von Software. Zeichnen Sie alle Spektren in einem einzigen Diagramm Bestimmen Sie, ob ein FRET-ähnliches Muster durch das Spektrum gebildet wird.Die ANS-N-Domain-Fluoreszenzspektren bilden ein FRET-ähnliches Muster. N-Domain intrinsische Floreszenztitration durch Tryptophan-chemische Modifikation mit NBS. Erhalten Sie wieder das intrinsische Fluoreszenzspektrum der N-Domäne.Fügen Sie der suspendierten N-Domäne ein Aliquot von einem Mikroliter eines Millimolar-NBS-Stammlösung hinzu, um eine Endkonzentration von einem mikromolaren NBS zu erhalten. Vorsichtig homogenisieren Sie mit einer Mikropipette, um die Homogenität der Lösung zu gewährleisten. Zeichnen Sie das Fluoreszenzspektrum auf.Wiederholen Sie die NBS-Addition und die fluoreszenzspektrale Aufzeichnung, bis eine minimale intrinsische N-Domäne-Fluoreszenzabschreckung beobachtet wird. Vorsichtig homogenisieren Sie mit einer Mikropipette, um die Homogenität der Lösung zu gewährleisten. Subtrahieren Sie das leere Spektrum von jedem Spektrum mithilfe von Software.Zeichnen Sie alle Spektren in einem einzigen Diagramm auf. Titrieren Sie die NBS-modifizierte N-Domäne mit ANS, indem Sie Fluoreszenzspektren bei 25 Grad aufzeichnen. Fügen Sie ANS hinzu und erhalten Sie das Fluoreszenzspektrum durch Anregung bei einer Wellenlänge von 295 Nanometern.Vorsichtig homogenisieren Sie mit einer Mikropipette, um die Homogenität der Lösung zu gewährleisten. Zeichnen Sie das Fluoreszenzspektrum auf. Subtrahieren Sie das leere Spektrum von jedem Spektrum mithilfe von Software.Zeichnen Sie alle Spektren in einem einzigen Diagramm auf. Die erzeugten Fluoreszenzspektren unterstützen oder widerlegen das Auftreten von FRET. Wenn nämlich FRET auftritt, nimmt die ANS-Fluoreszenz nicht zu und umgekehrt.Nachweis einer ANS-Bindung an die chemisch modifizierte N-Domäne durch Anregung bei einer Wellenlänge von 370 Nanometern. Fügen Sie der NBS-modifizierten N-Domäne ANS hinzu und zeichnen Sie das intrinsische Fluoreszenzspektrum der N-Domäne durch Anregung bei einer Wellenlänge von 370 Nanometern auf. Subtrahieren Sie das leere Spektrum von jedem Spektrum mithilfe von Software.Zeichnen Sie alle Spektren in einem einzigen Diagramm auf. Bestätigen Sie die ANS-Bindung an die N-Domäne durch die zunehmende ANS-Fluoreszenzintensität. Die ANS-Bindung an die N-Domäne zeigt eine Fluoreszenzerhöhung, wenn sie bei einer Wellenlänge von 370 Nanometern angeregt wird.Ergebnisübersicht. Panel A.ANS N-Domain Komplex zeigt ein FRET-ähnliches Muster, wenn es bei einer Wellenlänge von 295 Nanometern anregen wird. Panel B.NBS löscht die intrinsische Fluoreszenz der N-Domäne durch chemische Modifikation des einzigen Tryptophan-Rückstands in der chemisch modifizierten N-Domäne.Panel C.Die ANS-Fluoreszenz nimmt zu, wenn sie bei einer Wellenlänge von 295 Nanometern anregen. Panel D.Die ANS-Fluoreszenz nimmt auch bei Einer Anregen bei einer Wellenlänge von 370 Nanometern zu. Daher ist die direkte Anregung von ANS bei einer Wellenlänge von 295 Nanometern die Hauptquelle der ANS-Fluoreszenz, wenn sie an die ATP-Bindungsstelle gebunden ist. Schlüsse.Diese Assays können verwendet werden, um das Vorhandensein von FRET zwischen Tryptophanrückständen und ANS in Proteinen zu bestimmen. Die Abklärung von FRET, Bestätigung oder nicht, zwischen Tryptophan und ANS wird es ermöglichen, bessere Schlussfolgerungen in Proteinstrukturstudien zu ziehen. Der Assay kann auch bei der Verwendung anderer Fluorophore nützlich sein.

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Chemische Modifikation des Tryptophan-Rückstands in einer rekombinantenCa2+-ATPase-N-Domäne zur Untersuchung von Tryptophan-ANS FRET (Video) | JoVE Journal

Chemische Modifikation des Tryptophan-Rückstands in einer rekombinanten^Ca2+-ATPase-N-Domäne zur Untersuchung von Tryptophan-ANS FRET

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