Vorbereitung von Hochtemperatur-Probengittern für Kryo-EM
26. Juli 2021
Dieses Papier enthält ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung von Probengittern bei Temperaturen von bis zu 70 °C vor dem Einfrieren von Proben für Kryo-EM-Experimente.
Die Funktionen von Proteinen sind temperaturabhängig und bei der Temperatur optimal. Dieses Protokoll bietet eine Möglichkeit, Proteinstrukturen bei höheren Temperaturen zu lösen. Dieser Ansatz kann funktionell relevante Strukturen liefern und das Verständnis der Temperaturabhängigkeit von Proteinstrukturen verbessern.
Yuan-Chih Chang, Manager der Academia Sinica Cryo EM-Anlage, wird das Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie mit einem Loch von einem Zentimeter in einem 50-Millimeter-Zentrifugenröhrchen an seinem geschlossenen Ende. Legen Sie das Rohr in die Kammer der Verglasungsapparatur am Ultraschallwasserauslass.
Stellen Sie die Temperatur des Verglasungsgeräts auf die angegebene Temperatur ein und lassen Sie die Verglasungsgerätekammer 55 Grad Celsius und 100% relative Luftfeuchtigkeit erreichen. Lassen Sie es mindestens eine halbe Stunde stehen, um die Bedingungen zu stabilisieren, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Stellen Sie das Wasserbad auf eine Kochplatte und stellen Sie die Heizplatte auf die gewünschte Temperatur.
Überprüfen Sie mit einem Thermometer, ob das Wasser 55 Grad Celsius erreicht. Inkubieren Sie die Probe im Wasserbad und heizen Sie die Pipettenspitze am Rand der Heizplatte zwei Minuten oder länger vor dem Blotting-Experiment vor. Glow-Entladung eines löchrigen kohlenstoffgestützten Gitters bei 25 Milliampere für 30 Sekunden.
Legen Sie das Vitrifikationsfilterpapier frühestens fünf Minuten vor dem Blotting-Versuch in die Kammer des Vitrifikationsapparates. Inkubieren Sie die Pinzette mit dem Gitter im Vitrifikationsapparat für zwei Minuten oder länger. Bauen Sie den Ethanbehälter mit Ethan nach Standardverfahren, um sicherzustellen, dass das Ethan nicht überläuft.
Verwenden Sie eine Pipette, um sieben bis neun Mikroliter der Probe auf das Gitter aufzutragen. Warten Sie dann ein bis zwei Sekunden, tupfen Sie ein bis eineinhalb Sekunden ein und tauchen Sie die Probe schnell in flüssiges Ethan. Übertragen Sie das Gitter von flüssigem Ethan in die Kryobox, die in flüssigem Stickstoff gespeichert ist.
Clippen Sie die Gitter und entladen Sie sie, um das Elektronenmikroskop oder das Kryo-EM-Instrument zu erfassen. Verwenden Sie den Bildschirm des Cryo EM-Instruments und die Niedrigdosisfunktion der Software, um den Eiszustand auf dem Gitter und die Verteilung der Probe auf dem Gitter zu überprüfen. Wenn die Qualität des resultierenden Rasters nicht gut ist, wiederholen Sie den Prozess der Netzvorbereitung mit verschiedenen Bedingungen wie Wartezeit, Löschzeit usw.
Wenn die Qualität des resultierenden Gitters gut ist, wiederholen Sie die gleichen Schritte, um Gitter mit einer anderen Temperatur zu erstellen. Übertragen Sie die qualitativ hochwertigen Gitter auf ein hochauflösendes Cryo EM-Instrument. Führen Sie Datenerhebung und Datenanalysen nach festgelegten Verfahren durch.
Im Falle des erfolgreichen Gitters bildete sich ein Eisgradient mit dickerem Eis oben links im Gitter und dünnerem Eis unten rechts. Im erfolgreichen Raster wurden blaue und grüne Kästchen beobachtet, die für die Datenerfassung geeignet sind. Im anderen Raster wurde ein heller Kontrast beobachtet.
Dies zeigt eine dünne Eisschicht oder eine Abwesenheit von Eis an. Nur zwei Quadrate wurden für die Datenerfassung im zweiten Raster als geeignet befunden. Eines der Gitter bestand hauptsächlich aus Eis in Kristallform, was für die Datenerhebung ungeeignet war.
Auf der anderen Seite zeigte das andere Raster, dass sich die Eisschicht meist in einem amorphen Zustand befand, der für die Datenerhebung geeignet war. Die Vorbereitung des Behälters und anderer muss nach einem bestimmten Zeitpunkt abgeschlossen sein. Zeitkontrolle und das schnelle und genaue Beenden des Experiments sind am wichtigsten.
Abhängig von den Ergebnissen, die mit diesem Protokoll erzielt wurden, muss der Forscher möglicherweise bei der Einrichtung der einfachen Bedingungen vorsichtiger sein.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von Probenrastern bei Temperaturen bis zu 70 °C vor der Eintauchvitrifizierung für Kryo-EM-Experimente bereit. Dieser Ansatz verbessert das Verständnis der Temperaturabhängigkeit von Proteinstrukturen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Kryoelektronenmikroskopie (Cryo-EM)
- Proteinstrukturanalyse
- Temperaturwirkungen auf Proteine
Hintergrund
- Die Funktion von Proteinen ist temperaturabhängig.
- Die optimalen Temperaturen können je nach Protein variieren.
- Das Verständnis der Proteinstrukturen bei höheren Temperaturen ist entscheidend.
- Dieses Protokoll zielt darauf ab, funktionell relevante Strukturen bereitzustellen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Probengitterpräparation bei erhöhten Temperaturen.
- Verbesserung des Verständnisses der Proteinstruktur und -funktion.
- Demonstration des Verfahrens für Kryo-EM-Experimente.
Verwendete Methoden
- Erstellen eines Lochs in einem Zentrifugenröhrchen.
- Verwendung einer Vitrifikationsvorrichtung.
- Eintauchgefrierung von Proben für die Kryo-EM.
- Demonstration durch Yuan-Chih Chang.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Herstellung von Probenrastern bei hohen Temperaturen.
- Verbessertes Verständnis temperaturabhängiger Proteinstrukturen.
- Veranschaulichtes Verfahren für eine effektive Kryo-EM-Analyse.
- Potenzial für funktionelle Relevanz in der Strukturbiologie.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ermöglicht die Untersuchung von Proteinen bei höheren Temperaturen.
- Es liefert Einblicke in die Temperaturabhängigkeit von Proteinstrukturen.
- Diese Methode kann für zukünftige Kryo-EM-Experimente von Vorteil sein.
Häufig gestellte Fragen
Exemplarische Branchenrelevanz
Die Probengitterpräparation bei hohen Temperaturen für die Kryo-EM ermöglicht die strukturelle Untersuchung von Proteinen unter physiologisch relevanten thermischen Bedingungen und schließt damit eine wichtige Lücke bei thermophilen Zielstrukturen. Diese Fähigkeit erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, da die beobachteten Konformationen funktionelle Zustände widerspiegeln. Die Integration einer temperaturgeregelten Kryo-EM-Gitterpräparation unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung strukturell komplexer oder temperatursensitiver Substanzen in frühen Entdeckungsprozessen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die strukturelle Analyse von Proteinen bei Temperaturen, die ihren nativen oder funktionellen Umgebungen entsprechen.
- Verbessert die biologische Ent风险bewertung, indem temperaturabhängige konformationelle Zustände aufgedeckt werden.
- Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung für thermophile und temperatursensitive Proteine.
- Erleichtert die Portfolio-Priorisierung, indem Artefakte von physiologisch relevanten Strukturen unterschieden werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte Kryo-EM-Gitter für nachgeschaltete hochauflösende Abbildungsverfahren vor.
- Standardisiert die Qualitätsbewertung von Gittern durch reproduzierbare Kontrolle von Temperatur und Luftfeuchtigkeit.
- Ermöglicht die quantitative Beurteilung der Eisdicke und der Probendistribution hinsichtlich der Eignung für das Screening.
- Unterstützt eine zuverlässige Wirkstoffbewertung, indem die strukturelle Relevanz der Assay-Ziele sichergestellt wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Stellt strukturelle Daten in Bezug auf krankheitsrelevante oder organismusspezifische Temperaturbedingungen aus.
- Verbessert die Translationalkontinuität, indem Diskrepanzen zwischen in-vitro- und in-vivo-Proteinzuständen verringert werden.
- Reduziert Risiken bei der präklinischen Entwicklung, indem die funktionelle Relevanz struktureller Befunde bestätigt wird.
- Unterstützt die Abstimmung von Biomarkern, wenn temperaturabhängige Konformationen mechanistisch mit der Krankheit verknüpft sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll erweitert die Kryo-EM-Arbeitsabläufe von der standardmäßigen Niedrigtemperaturpräparation auf Hochtemperaturbedingungen und schließt damit die Lücke zwischen früher Entdeckung und präklinischer Forschung für thermisch empfindliche Zielstrukturen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur temperaturabhängigen Proteinfunktion und -struktur.
- Screening: Bietet reproduzierbare, quantitative Metriken zur Gitterqualität für nachgeschaltete Bildgebung und Analyse.
- Analytik: Ermöglicht den direkten Vergleich struktureller Zustände unter verschiedenen Temperaturbedingungen anhand von Kryo-EM-Auslesungen.
- Translationale Forschung: Erleichtert die Abstimmung struktureller Daten mit physiologischen oder krankheitsrelevanten Umgebungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft ein wiederverwendbares Protokoll zur Herstellung von Gittern bei hohen Temperaturen für unterschiedliche Proteinziele.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem funktionell relevante Konformationen erfasst werden.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Gitterpräparation bei hohen Temperaturen, um Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit zu gewährleisten.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen, indem mechanistische Unklarheiten in strukturellen Daten verringert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Wirkstoffen mit temperaturabhängigen strukturellen Merkmalen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Probenvorbereitung für die Kryo-EM und im Umgang mit temperaturkontrollierten Proben.
- Benötigt eine spezialisierte Vitrifizierungsapparatur, die eine präzise Steuerung von Temperatur und Luftfeuchtigkeit ermöglicht.
- Setzt eine standardisierte Bewertung der Gitterqualität und der Protokolle für die Datenaufnahme über mehrere Arbeitsgruppen hinweg voraus.
- Kann Anpassungen für verschiedene Proteinklassen oder organismusspezifische Temperaturbereiche erfordern.
- Genau gesteuerte Zeitabläufe und schnelle Durchführung sind entscheidend, um Eiskunststoffe zu minimieren und die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Preparation of the Vitrification Apparatus
1:23
Warming Up the Sample and the Tools
1:49
Blotting Experiment
2:47
Quality Check for the Grids and Data Collection
3:40
Results: High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM
4:25
Conclusion
