Name: Ein intestinales Darmorgankultursystem zur Analyse von Wirt-Mikrobiota-Interaktionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Erfahren Sie ein intestinales Darmorgankultursystem zur Analyse von Wirt-Mikrobiota-Interaktionen. Diese Methode vereint experimentelle Kontrolle mit Erhalt der Darmphysiologie für ex vivo Studien.

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Wir danken ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Yissachar-Labors für ihre wertvollen Beiträge zur Optimierung des Protokolls des Darmorgankultursystems. Wir danken Yael Laure für die kritische Bearbeitung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der Israel Science Foundation (Förderkennzeichen 3114831), der Israel Science Foundation - Broad Institute Joint Program (Zuschuss Nr. 8165162) und dem Gassner Fund for Medical Research, Israel, unterstützt.

Dieses Protokoll folgt den von der Ethikkommission für Tierschutz genehmigten Tierpflegerichtlinien.
1. Versuchsvorbereitung
<ol><li>Herstellung des Darmorgankulturgeräts (3 Tage)<ol>
<li>Drucken Sie mit einem 3D-Drucker die wiederverwendbaren Kunststoffformen für das Organkulturgerät (das Gerät hat 6 Vertiefungen mit 24 kleinen und großen Löchern und für den Deckel des Geräts) (3D-Dateien beigefügt). HINWEIS: Diese Kunststoffformen können für die Herstellung zahlreicher Geräte verwendet werden.</li>
		<li>Setzen Sie die stumpfen Nadeln (22 G & 18 G) an die entsprechende Position innerhalb der Geräteform ein und gießen Sie etwa 20 g Polydimethylsiloxan (PDMS) -Mischung (1:10 Gewichtsverhältnis, Basis zu Katalysator) für einen Satz des Geräts und des Deckels.</li>
		<li>Legen Sie die Formen für 30 Minuten in eine Vakuumkammer, um Luftblasen aus dem PDMS-Mix zu entfernen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Formen über Nacht bei 55 °C, um die PDMS-Polymerisation abzuschließen.</li>
		<li>Wenn das PDMS eingestellt ist, ziehen Sie die Nadeln aus der Form heraus und lösen Sie vorsichtig das Kulturgerät und den Deckel aus den Kunststoffformen.</li>
		<li>Entfernen Sie PDMS-Rückstände aus dem Brunnenumriss mit einer chirurgischen Klinge. Befestigen Sie das PDMS-Gerät und die Geräteabdeckung mit ungiftigem Silikonkleber auf einem Deckglas (75 mm x 50 mm Mikroobjektträger) und lassen Sie die Teile über Nacht einwirken (tragen Sie den Kleber auf die glatte Seite des Geräts auf).</li>
		<li>Setzen Sie zwölf 22 G-Nadeln für das Lumen und zwölf 18-G-Nadeln für den Brunnen ein. Fixieren Sie alle Nadeln mit Silikon und lassen Sie es über Nacht einwirken. Führen Sie zwei 18 G-Nadeln in den Deckel ein, um den luftigen Luftstrom in und aus dem Darmorgankulturgerät zu gewährleisten.</li>
		<li>Überprüfen Sie alle Nadeln mit einer mit Wasser gefüllten Spritze auf Lecks. Überprüfen Sie, ob keine Lecks aus den Brunnen austreten, indem Sie die Brunnen mit Wasser füllen.</li>
		<li>Legen Sie zwei chirurgische Knoten auf jede 22 G-Nadel, die mit dem Dickdarm verbunden wird. Legen Sie das Gerät und den Deckel in eine Autoklavenpapiertüte und sterilisieren Sie sie in einem Autoklaven.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kulturmedium (0,5 h)<ol>
<li>Mischen Sie in einer biologischen Haube Folgendes (in 50 ml Röhrchen): 37 ml Isco's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), 10 ml KSR Serumersatz, 1 ml B27-Ergänzung, 0,5 ml N2-Ergänzung, 0,5 ml 1 M HEPES-Puffer und 0,5 ml nicht essentielle Aminosäuren.</li>
		<li>Filtern und lagern Sie das gesamte Medium bei 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schlauch- und OP-Werkzeugvorbereitung<ol>
<li>Schneiden Sie die entsprechende Länge der Röhren für das Eingangslumen, den Eingangsbrunnen, das Ausgangslumen und das Ausgangsrohr (12 kurze Röhren und 12 lange Röhren). Schließen Sie an jeder Seite des Rohrs einen geeigneten Adapter an.</li>
		<li>Bereiten Sie die chirurgischen Werkzeuge vor: gerade Schere, 4x dünne Zette und 2x scharfe Zette.</li>
		<li>Legen Sie die Röhrchen und die chirurgischen Werkzeuge in eine Autoklavenpapiertüte und sterilisieren Sie sie mit einem Autoklaven.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie den Luminal-Input vor (gewünschte Stimulation - Bakterien, Stuhl, Medikamente usw.).<ol>
<li>Vor dem Experiment die Bakterienlast der Bakterienkultur durch serielle Verdünnungen12und Kultur unter aeroben und/oder anaeroben Bedingungen bestimmen.</li>
		<li>Nach der Berechnung der Bakterienlast verdünnen Sie die Bakterienkulturen in sterilem Gewebekulturmedium, um die erforderliche Bakterienkonzentration zu erhalten. Für Kotproben mit einem 100 μm Sieb filtern. HINWEIS: Zur nichtbakteriellen Stimulation (Medikamente, Metaboliten usw.) verdünnen Sie die Substanz mit dem Darmkulturmedium auf die erforderliche Konzentration.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung des Versuchsaufbaus
<ol><li>Schalten Sie im Organkultur-Inkubator die Heizeinheit ein und stellen Sie sie auf 37 °C ein.</li>
	<li>Richten Sie die Pumpen sowie die Ein- und Ausgangsspritzen ein.</li>
	<li>Input des Gewebekulturmediums<ol>
<li>Füllen Sie in einer biologischen oder laminaren Strömungshaube die Eingangsspritzen mit vollständigem Kulturmedium. Das endgültige Volumen hängt von der Dauer des Experiments und der Durchflussrate ab; in der Regel 1 ml/h plus zusätzliches Medium zur Spülung.</li>
		<li>Verbinden Sie die Schläuche mit dem Luer-Lock-Adapter mit den Spritzen. Legen Sie die gefüllten Spritzen in die Spritzenpumpen.</li>
		<li>Reinigen Sie die Eingangsspritzen. Achten Sie darauf, dass das Brunnenmedium aus allen Rohren in ein Altglas fließt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Luminaler Eingang<ol>
<li>Füllen Sie die luminalen Eingangsspritzen mit stimulationsbehandlung (Bakterien, Medikamente usw.). Das Volumen hängt von der Dauer des Experiments und der Durchflussrate ab (in der Regel 30 μL/h plus zusätzliches Medium für die Spülung).</li>
		<li>Verbinden Sie die Schläuche mit dem Luer-Lock-Adapter mit den Spritzen. Legen Sie die gefüllten Spritzen in die Spritzenpumpen.</li>
		<li>Reinigen Sie die Eingangsspritzen. Stellen Sie sicher, dass die Stimulation aus allen Rohren in ein Altglas fließt. Achten Sie darauf, die verschiedenen Stimulationen nicht zu kontaminieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ausgaben<ol>
<li>Legen Sie die leeren Spritzen in die Ausgangsspritzenpumpen (Pumpenmodus auf "Entnahme" einstellen).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Geräteeinrichtung<ol>
<li>Stellen Sie den Regler ein, der den Gasgemisch (95% O2 + 5% CO2)Durchfluss steuert, für einen sanften, minimalen Durchfluss.</li>
		<li>Untersuchen Sie das Gerät in einer laminaren Motorhaube.</li>
		<li>Spülen Sie die Nadeln des Geräts mit sterilem IMDM, um die Nadeln zu waschen.</li>
		<li>Fügen Sie 500 μL steriles Kulturmedium in jede Vertiefung des Geräts hinzu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung für die Gewebedissektion<ol>
<li>Legen Sie die sterilen chirurgischen Werkzeuge in die laminare Motorhaube.</li>
		<li>Füllen Sie eine 10-ml-Spritze mit sterilem IMDM und verbinden Sie eine sterile (autoklavierte) 22 G stumpfe Nadel zum Spülen des Dickdarms.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Orgelkulturen
<ol><li>Mäuseopfer und Gewebedissektion<ol>
<li>In einer laminaren Kapuze 12-14 Tage alte Mäuse durch Enthauptung opfern. Besprühen Sie die Mäuse mit 70% Ethanol und legen Sie die Mäuse auf eine Plastikplatte.</li>
		<li>Sezieren Sie mit einer scharfen Schere und Einer zette die Maus und nehmen Sie den Verdauungstrakt vom Magen bis zum Anus heraus, indem Sie das gesamte Fett und Bindegewebe schneiden. Schneiden Sie den Doppelpunkt ab und legen Sie ihn auf eine neue Platte. HINWEIS: Minimieren Sie den Kontakt mit dem Dickdarmgewebe. Berühren Sie nicht den mittleren Teil des Dickdarmgewebes. Halten Sie das Gewebe vorsichtig und nur an den Rändern des Gewebes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dickdarm spülen und waschen<ol>
<li>Unter einem Seziermikroskop den Dickdarminhalt vorsichtig mit sterilem IMDM (in die proximale Seite) mit der vorbereiteten 10-ml-Spritze (Schritt 2.7.2) spülen. Nachdem Sie den Kot aus dem Darmgewebe entfernt haben, legen Sie den Dickdarm in eine neue 6-Well-Platte, die mit 0,5 ml sterilem IMDM gefüllt ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verbinden des Doppelpunkts mit dem Gerät<ol>
<li>Nehmen Sie das Taschentuch und verbinden Sie es vorsichtig mit der 22 G-Nadel und machen Sie eine enge Verbindung mit den beiden Fäden. An dieser Stelle ist es unerlässlich, die korrekte Ausrichtung des Dickdarms zum Lumenfluss beizubehalten (proximal = Eingang, distal = Ausgang). Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.3 für alle 6 Gewebe.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass die Luer-Sperren der Eingangsnadel leer vom Medium sind. Wenn nicht, leeren Sie sie. Fügen Sie Stimulationen zur Eingangsnadel Luer Lock hinzu (um das Eindringen von Luftblasen in das Lumen zu vermeiden). Wiederholen Sie diesen Schritt für jeden Dickdarm mit der entsprechenden Stimulation.</li>
		<li>Überprüfen Sie, ob alle Taschentücher verbunden sind, und legen Sie den Deckel auf das Gerät.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anschließen der Organkulturvorrichtung an die Pumpen<ol>
<li>Legen Sie das Gerät in die vorgeheizte temperaturgeführte Kammer (37 °C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gasstrom anschließen<ol>
<li>Schließen Sie den Gasadapter mit der entsprechenden Eingangsnadel an den Deckel an.</li>
		<li>Schließen Sie die Ein- und Ausgangsröhren an das Gerät an. HINWEIS: Schließen Sie die proximale Dickdarmseite an die Eingangswannen an.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reinigen Sie das Lumen mit den Stimulationseingängen.<ol>
<li>Fließende Luminalstimulation sanft durch den Darm und überprüfen Sie den Mediumfluss in den Ausgangsrohren.</li>
		<li>Externes Medium waschen.</li>
		<li>Waschen Sie das externe Medium 3 Mal (stellen Sie die Pumpen auf eine Rate von 600 μL / min für Deneingang und den Ausgang ein). Jede Wäsche dauert 1 minute (beginnend mit dem Entleeren des Brunnens).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Starten Sie das Experiment.<ol>
<li>Starten Sie die Pumpen mit den folgenden Geschwindigkeiten: Durchfluss: Lumen: Eingang- 30 μL/h, Ausgang- 35 μL/h Externes Medium: Eingang - 1000 μL/h, Ausgang - 950 μL/h HINWEIS: Die Experimentierzeit kann zwischen 30 Minuten und 24 Stunden variieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ende des Experiments (bis zu 24 h für Dickdarmorgankulturen)<ol>
<li>Trennen Sie alle Röhren vom Gerät.</li>
		<li>Trennen Sie das Gewebe von den Nadeln und fahren Sie mit den gewünschten Auslesungen fort.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li>
<li>Pearce, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+in+vitro+and+ex+vivo+Models+to+Study+Host-Microbiome+Interactions+and+Acute+Stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Interactions and Acute Stressors.</a> Frontiers in Physiology. 9 (1584), (2018).</li>
<li>Hooper, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+commensal+host-microbial+relationships+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine.</a> Science. 291 (5505), 881-884 (2001).</li>
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<li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease%3A+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. 61 (7), 1007-1015 (2012).</li>
<li>Gazzaniga, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+Colon+Chip+Technology+to+Identify+Commensal+Bacteria+That+Promote+Host+Tolerance+to+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Harnessing Colon Chip Technology to Identify Commensal Bacteria That Promote Host Tolerance to Infection.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 638014(2021).</li>
<li>Yissachar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Intestinal+Organ+Culture+System+Uncovers+a+Role+for+the+Nervous+System+in+Microbe-Immune+Crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Intestinal Organ Culture System Uncovers a Role for the Nervous System in Microbe-Immune Crosstalk.</a> Cell. 168 (6), 1135-1148 (2017).</li>
<li>Duscha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propionic+Acid+Shapes+the+Multiple+Sclerosis+Disease+Course+by+an+Immunomodulatory+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Propionic Acid Shapes the Multiple Sclerosis Disease Course by an Immunomodulatory Mechanism.</a> Cell. 180 (6), 1067-1080 (2020).</li>
<li>Grosheva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screen+Identifies+Host+and+Microbiota+Regulators+of+Intestinal+Barrier+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screen Identifies Host and Microbiota Regulators of Intestinal Barrier Function.</a> Gastroenterology. 159 (5), 1807-1823 (2020).</li>
<li>Blaize, J. F., Corbo, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Dilutions+and+Plating%3A+Microbial+Enumeration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2021).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+intestinal+Th17+cells+by+segmented+filamentous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria.</a> Cell. 139 (3), 485-498 (2009).</li>
<li>Schnupf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+host+interaction+of+mouse+segmented+filamentous+bacteria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Growth and host interaction of mouse segmented filamentous bacteria in vitro.</a> Nature. 520 (7545), 99-103 (2015).</li>
<li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+immune+maturation+depends+on+colonization+with+a+host-specific+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota.</a> Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).</li>
<li>Atarashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+Cell+Induction+by+Adhesion+of+Microbes+to+Intestinal+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Th17 Cell Induction by Adhesion of Microbes to Intestinal Epithelial Cells.</a> Cell. 163 (2), 367-380 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Dieser Artikel beschreibt ein optimiertes Protokoll für Ex-vivo-Darmorgankulturen, das Yissachar et al. kürzlich entwickelt haben (veröffentlichte9 und unveröffentlichte Daten). Das Darmorgankultursystem unterstützt die multiplexierte Kultur intakter Darmfragmente bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung des Luminalflusses. Es bietet die volle Kontrolle über die intra- und extralumnale Umgebung (einschließlich Stimulationsdosis, Expositionszeit und Durchflussrate) und bewahrt die naive Darmge...

Der Darm ist ein hochkomplexes Organ, das eine breite Palette von Zelltypen (Epithelzellen, Zellen des Immunsystems, Neuronen und mehr) enthält, die in einer bestimmten Struktur organisiert sind, die es den Zellen ermöglicht, miteinander und mit dem Luminalgehalt (Mikrobiota, Nahrung usw.) zu interagieren und zu kommunizieren. 1.Derzeit umfasst die Forschungs-Toolbox, die für die Analyse von Wirt-Mikrobiota-Interaktionen zur Verfügung steht, In-vitro-Zellkulturen und In-vivo-Tiermodelle 2. In-vivo-Tiermodelle bieten eine physiologische Gewebekonstruktion3, jedoch mit schlechter experimenteller Kontrolle und begrenzter Fähigkeit, die Versuchsbedingungen zu manipulieren. In-vitro-Kultursysteme hingegen verwenden Primärzellen oder Zelllinien, die mit Mikroben4ergänzt werden können und eine strenge Kontrolle über die Experimentparameter bieten, aber die zelluläre Komplexität und die Gewebearchitektur fehlen. Moderne In-vitro-Assays ermöglichen die fortgeschrittene Verwendung gesunder und pathologischer menschlicher Gewebeproben, wie Epithelorganoide aus Maus- oder menschlichen Quellen5,6und Proben, die die Schleimhautmikroumgebung nachahmen7. Ein weiteres Beispiel ist der "Gut on a Chip"-Assay, der die menschliche Kolonepithelzelllinie (Caco2), die extrazelluläre Matrix und mikrofluidische Kanäle umfasst, um den physiologischen Zustand der Darminvariante nachzuahmen8. So fortschrittlich und innovativ In-vitro-Proben auch sein mögen, sie behalten jedoch keine normale Gewebearchitektur oder naive Zellzusammensetzung bei.
Um dies zu beheben, haben Yissachar et al. kürzlich ein ex vivo Organkultursystem9 (Abbildung 1) entwickelt, das intakte Darmfragmente ex vivoaufrechterhält und von den Vorteilen sowohl in vivo als auch in vitro Modellen profitiert. Dieses Ex-vivo-Darmorgankultursystem basiert auf einem maßgeschneiderten Kulturgerät, das eine multiplexierte Kultur von sechs Dickdarmgeweben unterstützt, so dass experimentelle Inputs unter vergleichbaren Bedingungen untersucht und gleichzeitig die Ein- und Ausgänge des Systems gesteuert werden können. Jüngste Arbeiten haben gezeigt, dass dieses System für die Analyse von Darmreaktionen auf einzelne Darmbakterien9, ganze menschliche Mikrobiotaproben10 und mikrobielle Metaboliten11wertvoll ist. Dieses System ermöglicht zum ersten Mal die Untersuchung dieser frühen Wirt-Mikrobiota-Interaktionen mit einem hohen Maß an Kontrolle über die Wirts-, Mikrobien- und Umweltkomponenten. Darüber hinaus ermöglicht es die Überwachung und Manipulation des Systems während des gesamten Experiments in Echtzeit.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62779/62779fig01.jpg"> Abbildung 1: Schemata der Darmkulturvorrichtung. Ein ganzes Darmgewebefragment ist an den Ausgangs- und Eingangsanschlüssen der Kammer (oben) befestigt, wobei Pumpen den Medienfluss innerhalb des Lumens und in der externen Mediumkammer regulieren. Das gesamte Gerät (unten) enthält 6 solcher Kammern. Diese Zahl wurde von Yissachar et al. 2017 modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62779/62779fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>Device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 Gauge stumpfe Nadel</td><td>Mcmaster</td><td>75165a754</td><td></td></tr><tr><td>22 Gauge stumpfe Nadel</td><td>Mcmaster</td><td>75165a758</td><td></td></tr><tr><td>Allzweck-Klebstoff Selant 100% Silikon</td><td>DAP</td><td>688</td><td></td></tr><tr><td>Kubischer Vakuum-Exsikkator VDC-21+ 2 Einlegeböden</td><td></td><td>AAAD4021</td><td></td></tr><tr><td>Glasschieber 1 mm dick</td><td>Corning</td><td>2947-75X50</td><td></td></tr><tr><td>Mini Inkubator im-10</td><td></td><td>AAH24315K</td><td></td></tr><tr><td>MPC 301E Vakuumpumpe</td><td></td><td>VI-412711</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff Quick Turn Rohr Kupplungsstecker</td><td>Mcmaster</td><td>51525k121</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff Quick Turn Rohr Kupplungsbuchsen</td><td>Mcmaster</td><td>52525k211</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikon Elastomer</td><td>Dow</td><td></td><td>Polydimethylsiloxan, PDMS</td></tr><tr><td>Schlauch</td><td>Mcmaster</td><td>6516t11</td><td></td></tr><tr><td>Zortrax M200</td><td>Zortrax</td><td></td><td>Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360</td></tr><tr><td>Zortrax M200 Materialien: z-ultrat</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement (50x), Serum Free</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>HEPES-Puffer (1M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's modifiziertes Dulbecco-Medium mit Phenolrot (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>Knock-Out Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1370701</td><td></td></tr><tr><td>nicht Essentielle Aminosäure (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Instrumente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Große Schere</td><td>Aseltech</td><td>11-00-10</td><td></td></tr><tr><td>Scharfe Pinzette</td><td>F.S.T</td><td>11297-10</td><td></td></tr><tr><td>Geflochtener chirurgischer Faden</td><td>SMI</td><td>8010G</td><td></td></tr><tr><td>Gerade Schere</td><td>F.S.T</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>Dünne Pinzette</td><td>F.S.T</td><td>11051-10<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Organ System0.1</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&micro; m</td><td>Filterlebensdauer Gen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 &Mikro; m</td><td>Filterlebensdauer Gen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL Luer-Lock-Spritze</td><td>B-D</td><td>309649</td><td></td></tr><tr><td>Greenough Stereomikroskop</td><td>ZEISS</td><td>Stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>Umlufterhitzer "CUBE"</td><td>CUBE-2-LIS</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Spritzenpumpe</td><td>New Era Pump Systems Inc</td><td>Nep-NE-1600-EM</td><td></td></tr></tbody></table>

ein intestinales darmorgankultursystem zur analyse von wirt-mikrobiota-interaktionen

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

Die Struktur des Darmgewebes ermöglicht enge und mutualistische Interaktionen zwischen dem Wirt und der Darmmikrobiota. Diese Gespräche sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der lokalen und systemischen Homöostase; Veränderungen der Zusammensetzung der Darmmikrobiota (Dysbiose) sind mit einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten verbunden. Methoden zur Sezierung von Wirt-Mikrobiota-Interaktionen umfassen einen inhärenten Kompromiss zwischen der Erhaltung der physiologischen Gewebestruktur (bei Verwendung von In-vivo-Tiermodellen) und dem Grad der Kontrolle über die Versuchsfaktoren (wie in einfachen In-vitro-Zellkultursystemen). Um diesen Kompromiss anzugehen, haben Yissachar et al. kürzlich ein Darmorgankultursystem entwickelt. Das System bewahrt eine naive Dickdarmgewebekonstruktion und zelluläre Mechanismen und ermöglicht auch eine strenge experimentelle Kontrolle, was Experimente erleichtert, die in vivonicht ohne weiteres durchgeführt werden können. Es ist optimal für die Sezierung kurzfristiger Reaktionen verschiedener Darmkomponenten (wie epitheliale, immunologische und neuronale Elemente) auf luminale Störungen (einschließlich anaerober oder aerober Mikroben, ganzer Mikrobiotaproben von Mäusen oder Menschen, Medikamenten und Metaboliten). Hier präsentieren wir eine detaillierte Beschreibung eines optimierten Protokolls für die Organkultur mehrerer Darmfragmente mit einem maßgeschneiderten Darmkulturgerät. Wirtsreaktionen auf luminale Störungen können durch Immunfluoreszenzfärbung von Gewebeabschnitten oder Gewebefragmenten ganzer Montierung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) oder Zeitrafferbildgebung sichtbar gemacht werden. Dieses System unterstützt eine Vielzahl von Auslesungen, einschließlich Next-Generation-Sequenzierung, Durchflusszytometrie und verschiedene zelluläre und biochemische Assays. Insgesamt unterstützt dieses dreidimensionale Organkultursystem die Kultur von großem, intaktem Darmgewebe und hat breite Anwendungen für die hochauflösende Analyse und Visualisierung von Wirt-Mikrobiota-Interaktionen in der lokalen Darmumgebung.

Das Darmorgankultursystem erhält die Lebensfähigkeit des Gewebes ex vivo. Die Bewertung der Gewebelebensfähigkeit erfolgte während des gesamten Kulturzeitraums. Dickdarmgewebefragmente wurden im Darmorgankultursystem inkubiert und nach 2/12/24 h-Kultur fixiert. Die Integrität der intestinalen Epithelzelle (IEC) wurde durch Immunfluoreszenzfärbung mit E-Cadherin und Cytokeratin-18-Antikörpern validiert. Ebenso wurden schleimgefüllte Speisebleszellen im Dickdarmepithel und Schleimsekretion innerhalb des Lumens so...

Dieser Artikel stellt eine einzigartige Methode zur Analyse von Wirt-Mikrobiom-Interaktionen unter Verwendung eines neuartigen Darmorgankultursystems für Ex-vivo-Experimente vor.

Ein intestinales Darmorgankultursystem zur Analyse von Wirt-Mikrobiota-Interaktionen

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

Das Darmorgankultursystem vereint die Vorteile von in vitro und in vivo Assays und dient somit als experimenteller Zwischenschritt zwischen einfachen in vitro Assays und komplexen in vivo Experimenten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Kombination einer strengen experimentellen Kontrolle mit der Erhaltung der Darmphysiologie. Diese Methode liefert Einblicke in die Analyse der Darmreaktionen auf spezifische Reize mit einem hohen Maß an Kontrolle über den Wirt, die Mikroben und die Umweltkomponenten.Demonstriert wird das Verfahren von Alon Shemesh, einem Masterstudenten aus meinem Labor, und Dr. Sivan Amidror, unserem Labormanager. Führen Sie zunächst die stumpfen Nadeln an die entsprechende Position innerhalb der Geräteform ein und gießen Sie etwa 20 Gramm Polydimethylsiloxan oder PDMS-Mischung für einen Satz des Geräts und des Deckels. Legen Sie die Formen für 30 Minuten in eine Vakuumkammer, um Luftblasen aus der PDMS-Mischung zu entfernen, und inkubieren Sie die Formen dann über Nacht bei 55 Grad Celsius, um die PDMS-Polymerisation abzuschließen.Wenn das PDMS eingestellt ist, ziehen Sie die Nadeln aus der Form heraus und lösen Sie vorsichtig das Kulturgerät und den Deckel aus den Kunststoffformen. Entfernen Sie PDMS-Rückstände aus dem Brunnenumriss mit einer chirurgischen Klinge. Befestigen Sie das PDMS-Gerät und die Geräteabdeckung mit ungiftigem Silikonkleber auf einem Deckglas aus 75 x 50 Millimetern Mikrorutschen und lassen Sie die Teile über Nacht einwirken.Tragen Sie das Geklebte auf die glatte Seite des Geräts auf. Setzen Sie 12, 22 Messnadeln für das Lumen und 12, 18 Messnadeln für den Brunnen ein. Fixieren Sie alle Nadeln mit Silikon und lassen Sie es über Nacht einwirken.Reinigen Sie die Eingangsspritzen und stellen Sie sicher, dass das Brunnenmedium aus allen Rohren in ein Altglas fließt, reinigen Sie dann die Eingangsspritzen und stellen Sie sicher, dass die Stimulationen aus allen Rohren in ein Altglas fließen, wobei Sie darauf achten, die verschiedenen Stimulationen nicht zu kontaminieren. Nachdem Sie die Maus geopfert haben, verwenden Sie eine scharfe Schere und eine Zette, um sie zu sezieren und den Verdauungstrakt vom Magen bis zum Anus herauszunehmen, indem Sie das gesamte Fett und Bindegewebe schneiden. Schneiden Sie den Doppelpunkt ab und legen Sie ihn auf eine neue Platte.Minimieren Sie den Kontakt, während Sie das Gewebe sanft und nur an den Rändern halten. Führen Sie die Dickdarmspülung unter einem Dissektionsmikroskop durch. Spülen Sie den Dickdarminhalt vorsichtig mit sterilem IMDM mit der vorbereiteten 10-Milliliter-Spritze, wie im Text beschrieben.Nachdem Sie den Kot aus dem Darmgewebe entfernt haben, legen Sie den Dickdarm in eine neue Sechs-Well-Platte, die mit 0,5 Milliliter sterilem IMDM gefüllt ist. Als nächstes nehmen Sie das Dickdarmgewebe und verbinden Es vorsichtig mit der 22-Gauge-Nadel, wobei Sie eine enge Verbindung mit den beiden Fäden herstellen. Behalten Sie die korrekte Ausrichtung des Dickdarms zum Lumenfluss bei, so dass der proximale und der distale Ausgang gleich Eingang und Ausgang sind.Wiederholen Sie die Darmspülung und das Nadelknünden für alle Gewebe. Schließen Sie die Ein- und Ausgangsrohre an das Gerät an und beginnen Sie dann das Experiment, indem Sie die Pumpen mit den gewünschten Raten starten. Schleimgefüllte Speisebleszellen im Dickdarmepithel und Schleimsekretion im Lumen wurden ebenso nachgewiesen wie proliferierende IEC in den Kolonkrypten, wie durch KI67-Färbung angezeigt.Diese Ergebnisse zeigten, dass das Darmkultursystem die Darmfunktion und -struktur ex vivo aufrechterhält. Nach zwei Stunden segmentierten filamentösen Bakterien oder SFB-Einführung wurden typische SFB-Filamente in enger Verbindung mit Dünndarmzotten mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung nachgewiesen. Zusätzlich präsentierte eine Transmissionselektronenmikroskopie SFB innerhalb weniger Mikrometer der Dünndarmepithelbürstengrenze.Genexpressionsprofile ganzer Gewebeproben wurden in dreifacher Ausfertigung zwei Stunden nach der Infusion mit SFB erstellt. Kontrollkulturen wurden mit fäkalen Suspensionen von keimfreien oder Bacteroides fragilis monokolonisierten Mäusen infundiert. Diese vom SFB überzeugten Veränderungen waren im Vergleich zur keimfreien Kontrolle überwiegend von geringer Amplitude.Die Orientierung des Dickdarms ist sehr wichtig. Achten Sie besonders darauf, wenn Sie den Dickdarm an der Nadel binden. Die richtige Bindung verhindert die Kontamination des Brunnens mit dem Lumengehalt.Diesem Protokoll kann eine breite Palette von Auslesetechniken folgen, z. B. Sequenzierung der nächsten Generation, Bildgebung, Zellsortierung und vieles mehr. Diese Auslesungen bieten neue Einblicke in die Wechselwirkungen des Wirtsmikrobioms bei Gesundheit und Krankheit.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Colon Organ Culture und seine Verwendung in Antimicrobial-Host Defense Studies

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Dieses Protokoll beschreibt ein In-vitro-Batchkultur-Fermentationssystem menschlicher Fäkalienmikrobiota unter Verwendung von Inulin (einem bekannten Präbiotikum und einem der am häufigsten untersuchten Mikrobiotamodulatoren), um die Verwendung dieses Systems bei der Abschätzung der Interventionen auf fäkale Mikrobiota Zusammensetzung und metabolische Aktivitäten.

Ein In-Vitro-Batch-Kulturmodell zur Abschätzung der Auswirkungen interventionaler Regimen auf humane fäkale Mikrobiota

Beschrieben ist hier ein Protokoll, um die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlichen Darmmikrobiota mit In-vitro-Batch-Fermentationssysteme zu untersuchen.

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Dieses optimierte Protokoll beschreibt einen Workflow zur Erkennung und Abbildung von Bakterien in komplexen Gewebeproben, von der Fixierung des Gewebes bis zur Färbung von Mikroben mit fluoreszierender In-situ-Hybridisierung .

Visualisierung von Darmmikrobiota-Wirt-Interaktionen durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung , Lektinfärbung und Bildgebung

Unser detailliertes Protokoll beschreibt die Erstellung und Verwendung des fortschrittlichen Darm-on-Chip-Modells, das die menschliche Darmschleimhaut mit 3D-Strukturen und verschiedenen Zelltypen simuliert und eine eingehende Analyse von Immunantworten und zellulären Funktionen als Reaktion auf mikrobielle Besiedlung ermöglicht.

Immunkompetentes Darm-on-Chip-Modell zur Analyse der Immunantworten der Darmschleimhaut

Die Studie präsentiert eine Methode zur in-vitro-Untersuchung bakterieller Infektionen unter Verwendung von Gewebestammzell-abgeleiteten Intestinalorganoiden. Das Protokoll beschreibt, wie man Organoide in zwei Dimensionen kultiviert und differenziert, sie mit adhärent-invasiven Escherichia coli infiziert und wichtige Werte bewertet, darunter das Durchbrechen der Epithelbarriere, die Bildgebung der Infektion und die Antwort der epithelialen RNA.

Eine zweidimensionale Organoidkultur auf Invasin- oder Basementmembranextrakt zur Untersuchung von Wirts-Bakterien-Interaktionen

Erfahren Sie ein intestinales Darmorgankultursystem zur Analyse von Wirt-Mikrobiota-Interaktionen. Diese Methode vereint experimentelle Kontrolle mit Erhalt der Darmphysiologie für ex vivo Studien.

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