Qualitätskontrollierte Sputumanalyse mittels Durchflusszytometrie
August 9th, 2021
Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Dissoziation von Sputum in eine einzelne Zellsuspension und die anschließende Charakterisierung zellulärer Untergruppen auf Standard-Durchflusszytometrieplattformen.
Dieses Protokoll löst häufige Herausforderungen bei der Sputumverarbeitung, die es in der Vergangenheit schwierig gemacht haben, mit der Durchflusszytometrie für klinische Hochdurchsatz-Diagnosezwecke verwendet zu werden. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Zeit zu sparen, indem das Sputumgewicht zur Bestimmung des Antikörper- und Farbstofffärbungsvolumens verwendet wird. Während der Färbeinkubation kann die Zellzählung für die nachgeschalteten Schritte durchgeführt werden.
Es ist wichtig, eine genaue Zellzahl zu erreichen, um das richtige Resuspensionsvolumen zu bestimmen, um Probleme beim Betrieb auf dem Durchflusszytometer zu vermeiden. Dieses Protokoll kann Einblicke in Forschungsbereiche geben, die die Lungengesundheit untersuchen. So könnten beispielsweise Krankheiten wie COPD, Asthma, Lungenkrebs oder die Auswirkungen von COVID untersucht werden.
Das Verfahren wird dr. Michael Lai, ein Forschungs- und Entwicklungswissenschaftler aus meinem Labor, demonstrieren. Wiegen Sie zunächst die Sputumprobe, um das Volumen der Dissoziationsreagenzien zu bestimmen. Die Probe wird in das entsprechend große Gefäß auf der Grundlage des Auswurfgewichts überführt und dann ein Milliliter pro Gramm 0,5 % NAC und vier Milliliter pro Gramm 0,1 % DVB-T zugegeben.
Wirbeln Sie die Proben mit maximaler Geschwindigkeit für 15 Sekunden und rocken Sie mit maximaler Geschwindigkeit für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie diese Probe mit 4X Hanks Balanced Salt Solution oder HBSS, um NAC und DTT zu neutralisieren. Und nach schnellem Wirbeln die Probe fünf Minuten lang bei Raumtemperatur schaukeln.
Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 100 Mikrometer langes Nylon-Mesh-Zellsieb in ein oder mehrere konische Zentrifugenröhrchen mit 50 Millilitern, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Pelletieren Sie die Zellen. Nach dem Absaugen des Überstandes die Pellets in einem konischen 15-Milliliter-Rohr kombinieren und unter den gleichen Bedingungen mit HBSS waschen.
Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Puffervolumen, das durch das Anfangsgewicht der Sputumprobe bestimmt wird. Nehmen Sie ein Aliquot aus der Zellsuspension und mischen Sie 10 Mikroliter der Sputumverdünnung mit 30 Mikrolitern 0,4% Trypanblau und laden Sie dann in die Zählkammern eines Hämozytometers für eine lebende / tote Zellzahl. Sputum in Kompensationsröhrchen beschriften.
Fügen Sie HBSS-Antikörper und Farbstoff zu jedem Sputumzellröhrchen und Kompensationsröhrchen hinzu, wie im Text angegeben. Fügen Sie die Sputumzellen zu den Assay-Röhrchen hinzu und fügen Sie den Kompensationsröhrchen Kompensationskügelchen hinzu, wie im Text erwähnt. Inkubieren Sie alle Röhren 35 Minuten lang auf lichtgeschütztem Eis.
Dann, nachdem Sie die Röhrchen mit eiskaltem HBSS gefüllt haben, zentrifugieren Sie bei vier Grad Celsius für 10 Minuten bei 800 mal G.Für Kompensationsröhrchen den Überstand so nah wie möglich an den Pellets absaugen und die Pellets zum Lösen bewegen. Als nächstes fügen Sie 0,5 Milliliter kaltes HBSS zu den Kompensationsröhrchen hinzu und lagern Sie die Röhrchen auf dem Eis in einem lichtgeschützten Bereich, bis sie für die Durchflusszytometrie-Analyse benötigt werden. Dann aspirieren Sie den Überstand aus dem Sputum ungefärbt, Isotyp, Blut und Epithelröhren.
Lösen Sie die Pellets, indem Sie die Röhrchen streichen. Fügen Sie zwei Milliliter von 1% PFA zu den ungefärbten und Isotyp-Röhrchen und 10 Milliliter zu den Blut- und Epithelröhren hinzu. Inkubieren Sie die Röhren auf Eis lichtgeschützt für 30 Minuten, dann schnell mit maximaler Geschwindigkeit wirbeln und erneut für weitere 30 Minuten inkubieren.
Füllen Sie dann die Röhrchen mit eiskaltem HBSS. Als nächstes zentrifugieren Sie die Röhrchen bei vier Grad Celsius für 10 Minuten bei 1.600 mal G.Aspiratieren Sie so viel Überstand wie möglich, ohne das Zellpellet zu stören, und streichen Sie das Röhrchen mit den Fingern, um die Zellen zu lösen, und fügen Sie dann 200 Mikroliter kaltes HBSS zu den ungefärbten und Isotyp-Röhren hinzu. Berechnen und addieren Sie das erforderliche HbSS-Volumen für die Resuspension des Blutes und des Epithelschlauchs entsprechend der Gesamtzellzahl.
Lagern Sie alle Proben in Kompensationsröhrchen, die bei vier Grad Celsius vor Licht auf dem Eis geschützt sind, bis eine durchflusszytometrische Analyse durchgeführt wird. Wenden Sie geeignete Startverfahren für das verwendete Durchflusszytometer an. Verwenden Sie die Mischung aus National Institute of Standards and Technology oder NIST-Perlen, um sicherzustellen, dass Vorwärtsstreu- und Seitenstreuspannungen so eingestellt sind, dass die NIST-Perlen so platziert werden, dass sie das Diagramm überspannen, ohne die Perlen zu nahe an den Achsen zu platzieren.
Stellen Sie die Durchflussrate für LSRII auf mittel oder für Navios EX auf hoch ein. Passen Sie die Spannungen für jeden Parameter an, der für die Streu- und Fluoreszenzparameter verwendet wird, um die Zellpopulationen in großem Maßstab zu platzieren. Verwenden Sie die Zahlen mit der Gating-Strategie als Orientierung, um die Spannungen entsprechend anzupassen. Erfassen Sie zuerst Daten für die ungefärbte Sputumprobe, gefolgt von der isotypgefärbten Probe und dann für das Blutröhrchen und das Epithelrohr.
Das Sputumgewicht wurde verwendet, um das Antikörper- oder Farbstoffvolumen für die Färbung zu bestimmen. Die Korrelation zwischen Sputumgewicht und Zellausbeute war nicht stark. Sputumproben wurden in vier Gewichtsklassen eingeteilt, die sich in der Verteilung der Zellausbeute gruppierten.
Jeder verwendete Antikörper wurde in einer Konzentration auf der Plateauphase titriert, wobei der höchste Färbeindex als Arbeitskonzentration gewählt wurde. In allen Gewichtsklassen betrug die durchschnittliche SEC-Kontamination weniger als 20%, wobei der Prozentsatz der lebensfähigen Zellen gezeigt wurde. Vorgestellt wird die für die Analyse verwendete Gating-Strategie.
NIST-Perlen wurden verwendet, um ein Tor zu setzen, das auf die Sputumprobe aufgebracht wurde, um Ablagerungen zu beseitigen. Kleine Trümmer wurden durch das breite Tor weiter beseitigt. Lebensfähigkeitsfarbstoff wurde verwendet, um tote Zellen zu eliminieren, während das Singulett-Tor Dubletten entfernte.
Die Anti-CD45-Antikörpermarkierung ermöglichte die Trennung von lebenden einzelnen Sputumzellen in eine Blutzelle und ein Nicht-Blutzellkompartiment. Die von Navios EX, LSRII und Lyric erhaltenen Profile wurden verglichen. Die Gating-Strategie zur Beseitigung von Trümmern, toten Zellen, Dubletten und zum Vergleich von Blut- und Nicht-Blutprofilen wird gezeigt.
Diese Technik ermöglichte es uns, diese Methoden anzuwenden, um das Lungenkrebsrisiko für die Verwendung als nicht-invasiver klinischer Test zu erkennen.
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Übersicht
Dieses Protokoll löst häufige Herausforderungen bei der Sputumverarbeitung und erleichtert dessen Verwendung in der Durchflusszytometrie für die klinische Diagnostik mit hohem Durchsatz. Es betont die Bedeutung einer genauen Zellzählung und des Resuspendierungsvolumens für eine erfolgreiche Durchflusszytometrie-Analyse.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Durchflusszytometrie
- Zellbiologie
- Forschung zur Lungengesundheit
Hintergrund
- Die Sputumverarbeitung stellte historisch gesehen Herausforderungen für die Durchflusszytometrie dar.
- Genaue Zellzählungen sind für eine effektive Analyse entscheidend.
- Forschungsbereiche umfassen COPD, Asthma, Lungenkrebs und COVID-19.
- Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Sputumanalyse für die klinische Diagnostik zu optimieren.
Zweck der Studie
- Ein effizientes Verfahren zur Dissoziierung von Sputum in eine Einzelzellsuspension bereitzustellen.
- Zelluläre Subsets mittels standardmäßiger durchflusszytometrischer Plattformen zu charakterisieren.
- Die Forschung zu Lungengesundheit und verwandten Krankheiten zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Bestimmung der Antikörper- und Farbstoff-Färbevolumina basierend auf dem Sputumgewicht.
- Durchführung von Zellzählungen während der Färbeinkubation.
- Nutzung der Durchflusszytometrie für die nachgeschaltete Analyse.
- Charakterisierung zellulärer Subsets für Forschungserkenntnisse.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll dissoziiert Sputum erfolgreich in Einzelzellsuspensionen.
- Genaue Zellzählungen werden erreicht, was eine effektive Durchflusszytometrie erleichtert.
- Erkenntnisse zu Lungengesundheit und Krankheitsmechanismen werden bereitgestellt.
- Der optimierte Prozess verbessert die klinischen diagnostischen Fähigkeiten.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige Methode für die Sputumanalyse.
- Es adressiert frühere Herausforderungen bei der Sputumverarbeitung für die Durchflusszytometrie.
- Die Ergebnisse unterstützen weitere Forschung zu lungenbezogenen Krankheiten.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key bottleneck in lung disease research by enabling high-throughput, quantitative analysis of sputum via flow cytometry. It transforms a traditionally low-yield, labor-intensive cytology method into a scalable, reproducible platform suitable for biomarker discovery and target validation in respiratory therapeutics. The approach supports mechanistic de-risking by providing immunophenotypic resolution of hematopoietic and epithelial lineages while excluding confounding debris and squamous epithelial cells.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cellular heterogeneity in lung microenvironment to validate therapeutic targets in inflammatory and oncologic pathways.
- Operational Value: Reduces reliance on specialized cytopathology personnel through automated, standardized phenotyping.
- Predictive Value: Supports target confidence by quantifying immune cell infiltration and epithelial activation states relevant to COPD, asthma, lung cancer, and post-COVID lung pathology.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, multiparametric readouts of CD45+ and CD45− populations for assay standardization across drug screening campaigns.
- Operational Value: Enables high-throughput sample processing using weight-based reagent normalization, improving reproducibility across sites and operators.
- Platform Reuse: Demonstrated compatibility across Navios EX, LSR II, and Lyric cytometers, supporting cross-platform assay transfer and centralized core lab utilization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Uses lung-specific macrophage identification as a quality control to confirm sample origin, enhancing confidence in preclinical-to-clinical continuity.
- Mechanistic De-risking: Enables longitudinal monitoring of immune and epithelial shifts in disease models, supporting go/no-go decisions in lead optimization.
- Predictive Confidence: Provides a biomarker-ready framework for evaluating target engagement in pulmonary inflammation or tumor microenvironment modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling standardized immune profiling of lung-derived samples, supporting hypothesis testing in early discovery and mechanistic validation in preclinical stages.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven exploration of lung immune landscapes and stromal interactions in disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cellular readouts suitable for compound library screening and target engagement assays.
- Analytics: Generates multiparametric flow cytometry data enabling statistical comparison of treatment effects across experimental groups.
- Translational Research: Supports biomarker alignment through lineage-specific gating and viability-based exclusion of nonviable or contaminating cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, weight-normalized workflow that can be deployed across multiple sites and instrument platforms for consistent data generation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing noise from debris and squamous epithelial contamination.
- Operational Value: Improves throughput and reproducibility via sputum weight-based reagent dosing and standardized gating strategies.
- Strategic Value: Enables faster, data-driven go/no-go decisions in respiratory drug programs by providing quantifiable immune and epithelial phenotypes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by generating translatable biomarker data from non-invasive lung samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry compensation, gating, and immunophenotyping of primary human cells.
- Dependent on access to flow cytometers with adequate fluorescence detection and scatter resolution.
- Necessitates standardization of staining protocols and QC metrics (e.g., NIST bead normalization) across sites.
- Requires adaptation of antibody panels based on target biology while maintaining viability and singlet gating.
- Limited by sample quality and sputum viscosity, which may affect dissociation efficiency and cell yield.
