Name: Qualitätskontrollierte Sputumanalyse mittels Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Erfahren Sie eine optimierte Sputumaufbereitung für die Durchflusszytometrie zur Charakterisierung zellulärer Subpopulationen. Diese Methode ermöglicht präzise Zellzählungen und unterstützt die Lungenforschung bei COPD, Asthma und Lungenkrebs.

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Wir danken David Rodriguez für seine Unterstützung bei der Figurenvorbereitung. Sputum-Proben wurden auf dem BD LSR II in der UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility durchgeführt, unterstützt von UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC bei UT Health) und UL1 TR001120 (CTSA-Zuschuss).

Alle Schritte der Sputumaufbereitung werden in einer biologischen Sicherheitswerkbank mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt.
1. Reagenzienvorbereitung vor Beginn der Sputumdissoziation
<ol><li>1% Paraformaldehyd (PFA), 25 ml pro Probe auf Eis auftauen und bis zum Gebrauch kalt aufbewahren. VORSICHT: PFA ist giftig durch Einatmen und Hautkontakt. Bereiten Sie das Fixiermittel gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und frieren Sie es bei -20 °C in 25 ml Aliquots bis zum Gebrauch ein.</li>
	<li>Ungefähr das Gewicht der Probe und 0,1% Dithiothreitol (DTT) für Schritt 2.2 auftauen und auf 37 °C bringen. (Aliquots von DVB-T sollten vor Gebrauch bei -20 °C gelagert werden.)</li>
	<li>Bringen Sie genügend 0,5% N-Acetyl-L-Cystein (NAC) bis zu 37 °C für Schritt 2.2 mit. (NAC sollte wöchentlich frisch zubereitet und vor Gebrauch bei 4 °C gelagert werden.)</li>
</ol>2. Dissoziation des Sputums
<ol><li>Wiegen Sie die Sputumprobe, um das Volumen der Dissoziationsreagenzien zu bestimmen. ANMERKUNG: Eine Probe gilt als klein, wenn das Anfangsgewicht ≤3 g beträgt, als mittel, wenn >3 g, aber ≤8 g, groß, wenn >8, aber ≤16 g, und als besonders groß, wenn eine Probe >16 g wiegt. Die Indikationen small, medium, large und extra large werden während des gesamten Protokolls verwendet. Die Menge der für die Dissoziation und Markierung erforderlichen Reagenzien unterscheidet sich je nach Größe der Sputumprobe.</li>
	<li>Übertragen Sie eine kleine Probe in ein sauberes konisches 50-ml-Röhrchen, eine mittlere Probe in eine saubere 250-ml-Einwegflasche aus Kunststoff oder eine große und extra große Probe in eine saubere 500-ml-Einwegflasche aus Kunststoff. Fügen Sie 1 ml/g Probengewicht von 0,5 % NAC und 4 ml/g Probengewicht von 0,1 % DTT hinzu.</li>
	<li>Wirbel bei maximaler Geschwindigkeit (für 15 s) und dann Gestein bei Raumtemperatur (bei maximaler Geschwindigkeit) für 15 min.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Probe mit vier Volumina von Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (basierend auf dem Gesamtvolumen der Probe + Reagenzien), um NAC und DTT zu neutralisieren; Wirbel schnell bei maximaler Geschwindigkeit und Gestein bei Raumtemperatur für 5 min bei maximaler Geschwindigkeit.</li>
	<li>Filtrieren Sie die Zellsuspension durch 100 μm Nylongewebe-Zellsieb in ein oder mehrere konische Zentrifugenröhrchen mit einer Länge von 50 ml, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 x g für 10 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand, kombinieren Sie alle Pellets in einem konischen 15-ml-Rohr und waschen Sie die Pellets dann mit HBSS unter den gleichen Bedingungen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Puffervolumen, das durch das Anfangsgewicht der Sputumprobe bestimmt wird. ANMERKUNG: Eine kleine Probe wird in 250 μL HBSS resuspendiert. Eine mittlere Probe wird in 760 μL HBSS resuspendiert. Große und extragroße Proben werden in 1460 μL HBSS resuspendiert.</li>
	<li>Nehmen Sie ein Aliquot der Zellsuspension für eine lebende/ tote Zellzahl mit Trypan Blue. HINWEIS: Verwenden Sie für eine kleine Probe 5 μL. Für eine mittlere, große oder extragroße Probe verwenden Sie 10 μL. Verdünnen Sie 1:10 mit HBSS.<ol>
<li>Mischen Sie 10 μL der Sputumverdünnung mit 30 μL 0,4% Trypan Blue, um eine endgültige Probenverdünnung von 1:40 zu erhalten. Laden Sie in die Zählkammern eines Hämozytometers für eine Zellzahl. HINWEIS: Es kann notwendig sein, die endgültige Verdünnung anzupassen, wenn die Zellzahlen zu niedrig oder zu hoch sind, um eine genaue Zählung zu erreichen. Die Konsultation von Guiot et al.20 zur korrekten Unterscheidung von Sputumzellen von SECs und Ablagerungen wird hier dringend empfohlen. Dies ist für eine genaue Zellzahl unerlässlich.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie aus der extra großen Probe 50 x 106 Zellen aus der Gesamtmenge und fügen Sie sie zu einem neuen Röhrchen mit genügend zugesetztem HBSS hinzu, um ein Gesamtvolumen von 1700 μL zu erzeugen. HINWEIS: Betrachten Sie dies als eine große Stichprobe für den Rest des Protokolls. Übrig gebliebene Proben können verworfen oder für andere Zwecke verwendet werden.</li>
</ol>3. Färbung von Antikörpern und Lebensfähigkeitsfarbstoffen
<ol><li>Auswahl an Antikörpern und Färbefarbstoffen HINWEIS: Tabelle 1 zeigt die Antikörper und Lebensfähigkeitsfarbstoffe, die in diesem Protokoll verwendet werden, und die Zellpopulationen, die sie identifizieren.<ol>
<li>Beschriften Sie die Röhrchen, die die Sputumzellen enthalten (siehe Tabelle 2 für Etiketten).</li>
		<li>Verwenden Sie 5 ml Durchflusszytometrieröhrchen (kompatibel mit dem verwendeten Durchflusszytometer) für das Probenröhrchen mit den nicht gefärbten Zellen und das Röhrchen mit der Isotypkontrolle. Verwenden Sie 15 ml konische Röhrchen für die Blut- und Epithelröhrchenproben. HINWEIS: Diese Proben werden nach der Färbung und Fixierung des Antikörpers in Durchflusszytometrieröhrchen übertragen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beschriften Sie die Kompensationsröhrchen (Tabelle 3). HINWEIS: Verwenden Sie 5 ml Durchflusszytometrieröhrchen, die mit dem verwendeten Durchflusszytometer kompatibel sind.</li>
	<li>Fügen Sie die Menge an HBSS, Antikörper und/oder Farbstoff zu jedem der Sputumzellröhrchen und Kompensationsröhrchen hinzu, wie in Tabelle 2 bzw. Tabelle 3 angegeben. HINWEIS: Fügen Sie Puffer (HBBS), Antikörper und Farbstoff zu allen Röhrchen hinzu, bevor Sie Zellen oder Kompensationsperlen hinzufügen, um sicherzustellen, dass die Färbezeit aller Röhrchen konsistent ist.</li>
	<li>Fügen Sie die in Tabelle 2 aufgeführten Mengen an Sputumzellvolumen zu den Assay-Röhrchen hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie den in Tabelle 3 aufgeführten Kompensationsröhrchen Kompensationsperlen hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie alle Röhrchen (Assay- und Kompensationsröhrchen) 35 min lang auf Eis, geschützt vor Licht. Anschließend die Röhrchen mit eiskaltem HBSS füllen und bei 4 °C für 10 min bei 800 x g zentrifugieren.</li>
	<li>Für die Kompensationsrohre den Überstand so nah wie möglich an den Pellets absaugen und die Pellets zur Lockerung streichen.</li>
	<li>Geben Sie 0,5 ml kaltes HBSS in die Kompensationsröhrchen, lagern Sie sie bei 4 °C auf dem Eis und schützen Sie sie vor Licht, bis sie für die Durchflusszytometrie-Analyse benötigt werden.</li>
	<li>Den Überstand nach der Zentrifugation (Schritt 3.6 aus dem Antikörper-Färbeabschnitt) aus dem ungefärbten Isotyp, dem Blut und den Epithelröhren absaugen und die Pellets durch Flicken der Röhrchen lösen.</li>
</ol>4. Fixierung mit 1% Paraformaldehyd (PFA)
<ol><li>Fügen Sie kalte 1% PFA (die inzwischen aufgetaut sein sollte) zu den ungefärbten, Isotyp-, Blut- und Epithelröhren hinzu; 2 ml zu den ungefärbten und Isotypröhren und 10 ml zu den Blut- und Epithelröhren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Röhren auf Eis, geschützt vor Licht für 1 h. Wirbeln Sie schnell bei maximaler Geschwindigkeit nach 30 min.</li>
	<li>Füllen Sie die Röhrchen mit eiskaltem HBSS. Dann Zentrifugenröhrchen bei 4 °C für 10 min bei 1600 x g.</li>
	<li>Aspirieren Sie so viel Überstand wie möglich, ohne das Zellpellet zu stören, und streichen Sie mit den Fingern über die Röhre, um die Zellen zu lockern.</li>
	<li>Fügen Sie 200 μL kaltes HBSS zu den ungefärbten und isotypischen Röhrchen hinzu.</li>
	<li>Berechnen Sie das Volumen von HBSS für die Resuspension des Blutes und des Epithelschlauchs entsprechend der Gesamtzellzahl. ANMERKUNG: Resuspensionsvolumen = 0,15 x [Gesamtzellzahl (Schritt 8 der Sputumdissoziation) / 106]. Verwenden Sie 50 x 106 als Zellzahl für eine extra große Stichprobe.</li>
	<li>Lagern Sie alle Proben- und Kompensationsröhrchen, geschützt vor Licht auf dem Eis bei 4 °C, bis eine durchflusszytometrische Analyse durchgeführt wird. HINWEIS: Dieses Protokoll wurde nicht länger als 24 h für die Lagerung getestet.</li>
</ol>5. Datenerfassung am Durchflusszytometer
<ol><li>Wenden Sie geeignete Startverfahren für das verwendete Durchflusszytometer an. HINWEIS: Dieser Abschnitt des Protokolls geht davon aus, dass die Person, die das Durchflusszytometer bedient, in der Verwendung des ihr zur Verfügung stehenden Instruments geschult ist, insbesondere in Bezug auf tägliche Verfahren, einschließlich der Überprüfung der Stabilität der optischen und fluidischen Systeme, Techniken zur Standardisierung der Lichtstreuung und Fluoreszenzintensität sowie der Berechnung und Anwendung der korrekten Kompensationsmatrix.</li>
	<li>Verwenden Sie die Mischung aus NIST-Perlen (National Institute of Standards and Technology), um sicherzustellen, dass Vorwärtsstreu- und Seitenstreuspannungen so eingestellt sind, dass die NIST-Perlen so platziert sind, dass sie das gesamte Diagramm umfassen, ohne die Perlen zu nahe an den Achsen zu platzieren. HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, um sicherzustellen, dass Ablagerungen, die kleiner als 5 μm sind, durch eine Gating-Analyse nach der Erfassung eliminiert werden können. Beachten Sie je nach verwendetem Durchflusszytometer, dass die kleinsten Kügelchen nicht mit der Schwelle (bei Verwendung des LSR II oder des Lyric) oder mit dem hohen Diskriminator (mit dem Navios EX Durchflusszytometer) ausgeschlossen werden. Für den Navios EX wurde eine Verstärkung von 2 für die Vorwärts- und Seitenstreuung, eine Spannung von 236 für die Vorwärtsstreuung und 250 für die Seitenstreuung verwendet. Für den LSR II wurde eine Durchlassstreuspannung von 165 und eine Seitenstreuspannung von 190 verwendet.</li>
	<li>Stellen Sie die Durchflussrate auf mittel (LSR II) oder hoch (Navios EX) ein. HINWEIS: Die mittlere oder hohe Durchflussrate für die meisten Instrumente kann verwendet werden, um die Sputumrohre zu erfassen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Verwendung einer zu langsamen Durchflussrate oder einer zu verdünnten Probe dazu führen kann, dass sich die Zellen absetzen, was zu einer erhöhten Wirbelung führt, die nicht erwünscht ist. Daher sollte die Einhaltung des berechneten Resuspensionsvolumens in Schritt 4.6 zu einer Zelldichte führen, die schnell erworben werden kann, aber die Maschine nicht verstopft.</li>
	<li>Passen Sie die Spannungen für jeden Parameter an, der für die Streu- und Fluoreszenzparameter verwendet wird, um die Zellpopulationen auf der Skala zu platzieren. Verwenden Sie die Zahlen mit der Gating-Strategie als Anleitung, wie Sie die Spannungen entsprechend anpassen können. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle benötigten Parameter vor der Erfassung im Parameterauswahlfenster ausgewählt sind oder dass keine Daten erfasst werden.</li>
	<li>Erfassen Sie zuerst Daten für die nicht gefärbte Sputumprobe, gefolgt von der isotypgefärbten Probe und dann für das Blutröhrchen und das Epithelrohr. HINWEIS: Wenn die Zellsuspension zu konzentriert ist, damit das Durchflusszytometer die Proben ohne Verstopfung betreiben kann, können die Proben weiter mit HBSS verdünnt werden.</li>
</ol>

Alle Autoren sind ehemalige oder aktuelle Mitarbeiter von bioAffinity Technologies.

Der zelluläre Gehalt des Sputums umfasst eine Vielzahl von weit reichenden Zellen, oft begleitet von vielen Trümmern37. Darüber hinaus erfordert die Sputumanalyse eine Qualitätskontrolle, die bestätigt, dass die Probe aus der Lunge und nicht aus der Mundhöhle entnommen wird38. Daher ist es nicht so einfach, Sputum mittels Durchflusszytometrie zu analysieren, wie es beispielsweise bei Blut der Fall ist, das eine viel sauberere und homogenere Zellsuspension freisetzt. Dieses ...

Technische Fortschritte in der Hard- und Software von Durchflusszytometern haben es ermöglicht, viele verschiedene Zellpopulationen gleichzeitig zu identifizieren1,2,3,4. Der Einsatz des Durchflusszytometers in der hämatopoetischen Zellforschung hat beispielsweise zu einem viel besseren Verständnis des Immunsystems2 und der zellulären Hierarchie des hämatopoetischen Systems5 sowie zur diagnostischen Unterscheidung einer Vielzahl verschiedener Blutkrebsarten geführt6,7,8. Obwohl die meisten Sputumzellen hämatopoetischen Ursprungs sind9,10,11, wurde die Durchflusszytometrie nicht weit verbreitet für die Sputumanalyse zu diagnostischen Zwecken eingesetzt. Mehrere Studien deuten jedoch darauf hin, dass die Bewertung von Immunzellpopulationen im Sputum (der bedeutendsten Untergruppe von Zellen) eine große Hilfe bei der Diagnose und / oder Überwachung von Krankheiten wie Asthma und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) sein kann 12,13,14,15. Darüber hinaus ermöglicht die Existenz von epithelspezifischen Markern, die in der Durchflusszytometrie verwendet werden können, die Abfrage der folgenden signifikantesten Untergruppe von Zellen im Sputum, Lungenepithelzellen.
Neben der Fähigkeit, viele verschiedene Zellpopulationen unterschiedlicher Gewebeherkunft zu analysieren, kann ein Durchflusszytometer eine große Anzahl von Zellen in relativ kurzer Zeit auswerten. Im Vergleich dazu erfordern folienbasierte, zytologische Analysen oft hochspezialisiertes Personal und/oder Equipment. Diese Analysen können arbeitsintensiv sein, was dazu führt, dass nur ein Teil der Sputumprobe analysiert wird16.
Drei kritische Punkte begrenzen die weit verbreitete Verwendung von Sputum in der Durchflusszytometrie. Die erste Frage bezieht sich auf die Sammlung von Sputum. Sputum wird durch einen Huff-Husten gesammelt, der Schleim aus der Lunge in die Mundhöhle ausstößt und anschließend in einen Sammelbecher spuckt. Da der Schleim durch die Mundhöhle wandert, besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit einer SEC-Kontamination. Diese Kontamination erschwert die Probenanalyse, aber das Problem kann leicht auf einer durchflusszytometrischen Plattform behoben werden, wie in dieser Studie gezeigt.
Nicht jeder kann spontan Sputum produzieren; Daher wurden mehrere Geräte entwickelt, um die Sputumsammlung auf nicht-invasive Weise zu unterstützen17. Der Vernebler ist ein solches Gerät und produziert nachweislich zuverlässige Auswurfproben18,19,20. Obwohl der Vernebler eine sehr effektive Möglichkeit ist, Sputum nicht-invasiv zu sammeln, erfordert seine Verwendung immer noch eine Einstellung in einer medizinischen Einrichtung mit spezialisiertem Personal21. Im Gegensatz dazu können Handheld-Geräte wie die Lungenflöte22,23,24 und die acapella16,25 zu Hause verwendet werden, da sie sehr benutzerfreundlich sind. Diese Assistenzgeräte sind sowohl sicher als auch kostengünstig.
Für uns lieferte die Acapella durchweg bessere Ergebnisse als die Lungenflöte16, und daher wurde das Acapella-Gerät für Sputumsammlungen ausgewählt. Eine 3-tägige Entnahmeprobe wurde beschlossen, da der Hauptzweck für die Verwendung von Sputum darin besteht, einen Lungenkrebserkennungstest zu entwickeln16. Es hat sich gezeigt, dass eine 3-Tage-Probe die Wahrscheinlichkeit der Lungenkrebserkennung im Vergleich zu einer 1- oder 2-Tage-Probe erhöht26,27,28. Andere Methoden der Sputumsammlung können jedoch für verschiedene Zwecke vorzuziehen sein. Wenn eine andere Sputumsammelmethode als die hier beschriebene verwendet wird, wird empfohlen, jeden Antikörper oder Farbstoff, der für die durchflusszytometrische Analyse verwendet wird, sorgfältig zu titrieren. Es liegen nur sehr wenige Daten darüber vor, wie sich verschiedene Sputumsammelmethoden auf die Zielproteine für die Durchflusszytometrie auswirken.
Das zweite Thema, das die Begeisterung für die Verwendung von Sputum für die Diagnostik dämpft, vor allem im Zusammenhang mit der Durchflusszytometrie, ist die Zellzahl. Das Problem ist die Sammlung von ausreichend lebensfähigen Zellen für eine zuverlässige Analyse. Zwei Studien zeigten, dass Sputumproben, die mit hilfe eines Hilfsgeräts mit nicht-invasiven Methoden entnommen wurden, genügend lebensfähige Zellen enthalten, die in klinischen Diagnose- oder Forschungsstudien verwendet werden können16,24. Keine dieser Studien befasste sich jedoch mit der Frage der Zellzahlen in Bezug auf die Durchflusszytometrie.
Für die Studien, die die Grundlage für dieses Protokoll bilden, wurden Sputumproben von Teilnehmern mit hohem Risiko für die Entwicklung von Lungenkrebs nach genehmigten institutionellen Richtlinien für jeden Studienstandort gesammelt. Hochrisikoteilnehmer wurden als zwischen 55 und 75 Jahren definiert, nachdem sie 30 Packungsjahre geraucht und in den letzten 15 Jahren nicht mit dem Rauchen aufgehört hatten. Den Patienten wurde gezeigt, wie sie das Acapella-Gerät gemäß den Anweisungen des Herstellers29 verwenden und Sputum an drei aufeinanderfolgenden Tagen zu Hause sammelten. Die Probe wurde bis zur letzten Entnahme im Kühlschrank aufbewahrt. Am letzten Abholtag wurde die Probe über Nacht mit einer gefrorenen Kühlpackung ins Labor geschickt. Die Proben wurden am Tag ihres Eingangs zu einer einzelnen Zellsuspension verarbeitet. Mit dieser Methode der Sputumgewinnung werden mehr als genug lebensfähige Zellen für eine zuverlässige durchflusszytometrische Analyse gewonnen.
Schließlich, und im Zusammenhang mit dem vorherigen Problem der Zellzahl, stellt sich die Frage, wie die Sputumzellen aus ihrer muzinösen Umgebung freigesetzt werden können. Wie können die Zellen lebensfähig gehalten werden und eine einzelne Zellsuspension erzeugen, die das Durchflusszytometer nicht verstopft? Basierend auf ersten Arbeiten von Pizzichini et al.30 und Miller et al.31 beschreibt dieses Protokoll eine einfache und zuverlässige Methode zur Sputumverarbeitung zu einer Einzelzellsuspension, die für die durchflusszytometrische Analyse geeignet ist. Diese Methode hat etablierte Richtlinien in der Durchflusszytometrie32,33,34 verwendet, um eine effiziente Antikörpermarkierungsstrategie zu entwickeln, um hämatopoetische und epitheliale Zellen im Sputum zu identifizieren und Instrumenteneinstellungen, Qualitätskontrollmaßnahmen und Analyserichtlinien bereitzustellen, die die Sputumanalyse auf einer durchflusszytometrischen Plattform standardisieren.

<table><tbody><tr><td>1% Paraformaldehyd Flow-Fix</td><td>Polysciences</td><td>25037</td><td></td></tr><tr><td>100 &Mikro; M Nylon Zellsiebe, Falcon #352360</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>3 M NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0593-1</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konisches Falcon Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 Anti-Human-CD19</td><td>BioLegend</td><td>302219</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 Anti-Human-CD3</td><td>BioLegend</td><td>300415</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 Anti-Human-Cytokeratin</td><td>BioLegend</td><td>628608</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 PanCK-, CD3- und CD19-Isotyp</td><td>BioLegend</td><td>400129</td><td></td></tr><tr><td>BV510 Anti-Human-CD45</td><td>BioLegend</td><td>304036</td><td></td></tr><tr><td>CD66b FITC-Isotyp</td><td>BD Biosciences</td><td>555748</td><td></td></tr><tr><td>CompBead Plus Kompensationsperlen</td><td>BD Biosciences</td><td>560497</td><td></td></tr><tr><td>Corning Polystyrol sterile Einwegflasche 250 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-4</td><td></td></tr><tr><td>Corning Polystyrol sterile Einwegflasche 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-10</td><td></td></tr><tr><td>CS& T-Kügelchen</td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td></td></tr><tr><td>DTT Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anti-Human-CD66b</td><td>GeneTex</td><td>GTX75907</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Stain</td><td>BD Biosciences</td><td>564406</td><td></td></tr><tr><td>FlowCheck</td><td>Beckman Coulter</td><td>A69183</td><td></td></tr><tr><td>FlowSet</td><td>Beckman Coulter</td><td>A69184</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-175-095</td><td></td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NIST Beads, 05 &mu; M</td><td>Polysciences</td><td>64080</td><td></td></tr><tr><td>NIST Perlen, 20 &mu; M</td><td>Polysciences</td><td>64160</td><td></td></tr><tr><td>NIST Perlen, 30 &mu; M</td><td>Polysciences</td><td>64170</td><td></td></tr><tr><td>PE Anti-Human-CD45</td><td>BioLegend</td><td>304039</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 Anti-Human-EpCAM</td><td>BD Biosciences</td><td>565399</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 CD206/EpCAM Isotyp</td><td>BD Biosciences</td><td>562292</td><td></td></tr><tr><td>PE-CR594 Anti-Human-CD206</td><td>BD Biosciences</td><td>564063</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat-Dihydrat</td><td>EMD</td><td>SX0445-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung, 0,4 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

qualitätskontrollierte sputumanalyse mittels durchflusszytometrie

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Sputum, weit verbreitet, um den zellulären Inhalt und andere mikroumweltliche Merkmale zu untersuchen, um die Gesundheit der Lunge zu verstehen, wird traditionell mit zytologischen Methoden analysiert. Sein Nutzen ist begrenzt, da das Lesen der Folien zeitaufwendig ist und hochspezialisiertes Personal erfordert. Darüber hinaus machen ausgedehnte Trümmer und das Vorhandensein von zu vielen Plattenepithelzellen (SECs) oder Wangenzellen eine Probe oft für die Diagnose ungeeignet. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Durchflusszytometrie eine Hochdurchsatz-Phänotypisierung zellulärer Populationen bei gleichzeitigem Ausschluss von Trümmern und SECs.
Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine effiziente Methode, um Sputum in eine einzelne Zellsuspension zu dissoziieren, Antikörper zu färben und zelluläre Populationen zu fixieren und Proben auf einer durchflusszytometrischen Plattform zu entnehmen. Eine Gating-Strategie, die den Ausschluss von Trümmern, toten Zellen (einschließlich SECs) und Zelldouletten beschreibt, wird hier vorgestellt. Darüber hinaus erklärt diese Arbeit auch, wie lebensfähige, einzelne Sputumzellen basierend auf einem Cluster von Differenzierungspopulationen (CD) 45 positiven und negativen Populationen analysiert werden können, um hämatopoetische und epitheliale Abstammungsuntergruppen zu charakterisieren. Eine Qualitätskontrollmaßnahme wird auch durch die Identifizierung lungenspezifischer Makrophagen als Beweis dafür bereitgestellt, dass eine Probe aus der Lunge stammt und kein Speichel ist. Schließlich wurde gezeigt, dass diese Methode auf verschiedene zytometrische Plattformen angewendet werden kann, indem Sputumprofile desselben Patienten bereitgestellt werden, die auf drei Durchflusszytometern analysiert wurden. Navios EX, LSR II und Lyric. Darüber hinaus kann dieses Protokoll modifiziert werden, um zusätzliche zelluläre Marker von Interesse aufzunehmen. Hier wird eine Methode zur Analyse einer gesamten Sputumprobe auf einer durchflusszytometrischen Plattform vorgestellt, die Sputum für die Entwicklung einer Hochdurchsatzdiagnostik von Lungenerkrankungen geeignet macht.

Dieses Protokoll wurde mit Blick auf ein klinisches Labor entwickelt. Der Fokus bei der Entwicklung des Protokolls lag auf Einfachheit, Effizienz und Reproduzierbarkeit. Es wurde festgestellt, dass der zeitaufwendigste Schritt bei der Verarbeitung von Sputum das Zählen der Zellen war. Daher ist das Protokoll so aufgebaut, dass die Sputumverarbeitung und Zellmarkierung unabhängig von der Zellzählung ohne Zeitverlust durchgeführt werden kann. Eine genaue Zellzahl, die immer noch notwendig ist, um die Probe für einen ungehi...

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Dissoziation von Sputum in eine einzelne Zellsuspension und die anschließende Charakterisierung zellulärer Untergruppen auf Standard-Durchflusszytometrieplattformen.

Qualitätskontrollierte Sputumanalyse mittels Durchflusszytometrie

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

Dieses Protokoll löst häufige Herausforderungen bei der Sputumverarbeitung, die es in der Vergangenheit schwierig gemacht haben, mit der Durchflusszytometrie für klinische Hochdurchsatz-Diagnosezwecke verwendet zu werden. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Zeit zu sparen, indem das Sputumgewicht zur Bestimmung des Antikörper- und Farbstofffärbungsvolumens verwendet wird. Während der Färbeinkubation kann die Zellzählung für die nachgeschalteten Schritte durchgeführt werden.Es ist wichtig, eine genaue Zellzahl zu erreichen, um das richtige Resuspensionsvolumen zu bestimmen, um Probleme beim Betrieb auf dem Durchflusszytometer zu vermeiden. Dieses Protokoll kann Einblicke in Forschungsbereiche geben, die die Lungengesundheit untersuchen. So könnten beispielsweise Krankheiten wie COPD, Asthma, Lungenkrebs oder die Auswirkungen von COVID untersucht werden.Das Verfahren wird dr. Michael Lai, ein Forschungs- und Entwicklungswissenschaftler aus meinem Labor, demonstrieren. Wiegen Sie zunächst die Sputumprobe, um das Volumen der Dissoziationsreagenzien zu bestimmen. Die Probe wird in das entsprechend große Gefäß auf der Grundlage des Auswurfgewichts überführt und dann ein Milliliter pro Gramm 0,5 % NAC und vier Milliliter pro Gramm 0,1 % DVB-T zugegeben.Wirbeln Sie die Proben mit maximaler Geschwindigkeit für 15 Sekunden und rocken Sie mit maximaler Geschwindigkeit für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie diese Probe mit 4X Hanks Balanced Salt Solution oder HBSS, um NAC und DTT zu neutralisieren. Und nach schnellem Wirbeln die Probe fünf Minuten lang bei Raumtemperatur schaukeln.Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 100 Mikrometer langes Nylon-Mesh-Zellsieb in ein oder mehrere konische Zentrifugenröhrchen mit 50 Millilitern, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Pelletieren Sie die Zellen. Nach dem Absaugen des Überstandes die Pellets in einem konischen 15-Milliliter-Rohr kombinieren und unter den gleichen Bedingungen mit HBSS waschen.Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Puffervolumen, das durch das Anfangsgewicht der Sputumprobe bestimmt wird. Nehmen Sie ein Aliquot aus der Zellsuspension und mischen Sie 10 Mikroliter der Sputumverdünnung mit 30 Mikrolitern 0,4% Trypanblau und laden Sie dann in die Zählkammern eines Hämozytometers für eine lebende / tote Zellzahl. Sputum in Kompensationsröhrchen beschriften.Fügen Sie HBSS-Antikörper und Farbstoff zu jedem Sputumzellröhrchen und Kompensationsröhrchen hinzu, wie im Text angegeben. Fügen Sie die Sputumzellen zu den Assay-Röhrchen hinzu und fügen Sie den Kompensationsröhrchen Kompensationskügelchen hinzu, wie im Text erwähnt. Inkubieren Sie alle Röhren 35 Minuten lang auf lichtgeschütztem Eis.Dann, nachdem Sie die Röhrchen mit eiskaltem HBSS gefüllt haben, zentrifugieren Sie bei vier Grad Celsius für 10 Minuten bei 800 mal G.Für Kompensationsröhrchen den Überstand so nah wie möglich an den Pellets absaugen und die Pellets zum Lösen bewegen. Als nächstes fügen Sie 0,5 Milliliter kaltes HBSS zu den Kompensationsröhrchen hinzu und lagern Sie die Röhrchen auf dem Eis in einem lichtgeschützten Bereich, bis sie für die Durchflusszytometrie-Analyse benötigt werden. Dann aspirieren Sie den Überstand aus dem Sputum ungefärbt, Isotyp, Blut und Epithelröhren.Lösen Sie die Pellets, indem Sie die Röhrchen streichen. Fügen Sie zwei Milliliter von 1% PFA zu den ungefärbten und Isotyp-Röhrchen und 10 Milliliter zu den Blut- und Epithelröhren hinzu. Inkubieren Sie die Röhren auf Eis lichtgeschützt für 30 Minuten, dann schnell mit maximaler Geschwindigkeit wirbeln und erneut für weitere 30 Minuten inkubieren.Füllen Sie dann die Röhrchen mit eiskaltem HBSS. Als nächstes zentrifugieren Sie die Röhrchen bei vier Grad Celsius für 10 Minuten bei 1.600 mal G.Aspiratieren Sie so viel Überstand wie möglich, ohne das Zellpellet zu stören, und streichen Sie das Röhrchen mit den Fingern, um die Zellen zu lösen, und fügen Sie dann 200 Mikroliter kaltes HBSS zu den ungefärbten und Isotyp-Röhren hinzu. Berechnen und addieren Sie das erforderliche HbSS-Volumen für die Resuspension des Blutes und des Epithelschlauchs entsprechend der Gesamtzellzahl.Lagern Sie alle Proben in Kompensationsröhrchen, die bei vier Grad Celsius vor Licht auf dem Eis geschützt sind, bis eine durchflusszytometrische Analyse durchgeführt wird. Wenden Sie geeignete Startverfahren für das verwendete Durchflusszytometer an. Verwenden Sie die Mischung aus National Institute of Standards and Technology oder NIST-Perlen, um sicherzustellen, dass Vorwärtsstreu- und Seitenstreuspannungen so eingestellt sind, dass die NIST-Perlen so platziert werden, dass sie das Diagramm überspannen, ohne die Perlen zu nahe an den Achsen zu platzieren.Stellen Sie die Durchflussrate für LSRII auf mittel oder für Navios EX auf hoch ein. Passen Sie die Spannungen für jeden Parameter an, der für die Streu- und Fluoreszenzparameter verwendet wird, um die Zellpopulationen in großem Maßstab zu platzieren. Verwenden Sie die Zahlen mit der Gating-Strategie als Orientierung, um die Spannungen entsprechend anzupassen. Erfassen Sie zuerst Daten für die ungefärbte Sputumprobe, gefolgt von der isotypgefärbten Probe und dann für das Blutröhrchen und das Epithelrohr.Das Sputumgewicht wurde verwendet, um das Antikörper- oder Farbstoffvolumen für die Färbung zu bestimmen. Die Korrelation zwischen Sputumgewicht und Zellausbeute war nicht stark. Sputumproben wurden in vier Gewichtsklassen eingeteilt, die sich in der Verteilung der Zellausbeute gruppierten.Jeder verwendete Antikörper wurde in einer Konzentration auf der Plateauphase titriert, wobei der höchste Färbeindex als Arbeitskonzentration gewählt wurde. In allen Gewichtsklassen betrug die durchschnittliche SEC-Kontamination weniger als 20%, wobei der Prozentsatz der lebensfähigen Zellen gezeigt wurde. Vorgestellt wird die für die Analyse verwendete Gating-Strategie.NIST-Perlen wurden verwendet, um ein Tor zu setzen, das auf die Sputumprobe aufgebracht wurde, um Ablagerungen zu beseitigen. Kleine Trümmer wurden durch das breite Tor weiter beseitigt. Lebensfähigkeitsfarbstoff wurde verwendet, um tote Zellen zu eliminieren, während das Singulett-Tor Dubletten entfernte.Die Anti-CD45-Antikörpermarkierung ermöglichte die Trennung von lebenden einzelnen Sputumzellen in eine Blutzelle und ein Nicht-Blutzellkompartiment. Die von Navios EX, LSRII und Lyric erhaltenen Profile wurden verglichen. Die Gating-Strategie zur Beseitigung von Trümmern, toten Zellen, Dubletten und zum Vergleich von Blut- und Nicht-Blutprofilen wird gezeigt.Diese Technik ermöglichte es uns, diese Methoden anzuwenden, um das Lungenkrebsrisiko für die Verwendung als nicht-invasiver klinischer Test zu erkennen.

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Forschung

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Medicine

Medizin

Dieses Video zeigt die Verwendung der Durchflusszytometrie zur Identifizierung und Zählung verschiedener Immunzellen in bronchoalveolärer Lavage-Flüssigkeit. Zunächst werden einzelne Immunzellen mit einem Viabilitätsfarbstoff identifiziert, gefolgt von einer differentiellen Färbung von Oberflächenmarkerproteinen, die eine genaue Zählung der einzelnen Zelltypen ermöglicht.

Identifizierung und Zählung von Immunzellen in bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit mittels Durchflusszytometrie

Die Verwendung von Zytobürstenproben zur Entnahme von Lymphozyten und Monozyten aus dem Endozervix ist eine minimalinvasive Technik, die Proben für die Analyse der Immunität des weiblichen Genitaltrakts liefert. In diesem Protokoll beschreiben wir die Entnahme von Zytobürstenproben und die Isolierung von Immunzellen für Durchflusszytometrie-Assays.

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Diese Methode demonstriert eine Technik zur Beurteilung der Granulozytenfunktion durch gleichzeitige Messung der Phagozytose von Bakterien und des oxidativen Ausbruchs. Die bildbasierte Durchflusszytometrie ermöglichte die Identifizierung von drei verschiedenen Untergruppen aktivierter Granulozyten, die sich alle in ihrer relativen Funktionsfähigkeit unterschieden.

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Hier stellen wir ein Protokoll allergen-beladenen Partikel durch Durchflusszytometrie quantifiziert. Feinstaub in der Luft Partikel können als Träger von adsorbiertem Allergene wirken. Wir zeigen hier, dass der Durchflusszytometrie ist ein Verfahren allgemein zur Charakterisierung von Schwebstoffen verwendet&gt; 0,5 um im Durchmesser, können diese allergen-beladenen Partikel zu messen, verwendet werden.

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Der Gesundheitszustand der Lunge spiegelt sich in der Art und Anzahl der Immunzellen, die in den Bronchiolen der Lunge vorhanden sind. Wir beschreiben eine bronchoalveoläre Lavagetechnik, die die Isolierung und Untersuchung von nichtadhärenten Zellen und löslichen Faktoren aus dem unteren Atemtrakt der Mäuse ermöglicht.

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Dieser Artikel beschreibt, spektrale Zytometrie, einen neuen Ansatz in der Durchflusszytometrie, die die Formen von Emissionsspektren verwendet Fluorochromen zu unterscheiden. Ein Algorithmus ersetzt Kompensationen und kann Auto-Fluoreszenz als unabhängigen Parameter behandeln. Dieser neue Ansatz ermöglicht die korrekte Analyse von soliden Organen isolierten Zellen.

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Methodik für Sputum Induktion und Labor-Verarbeitung

Die Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie kann wesentlich zum Verständnis des Musters der Immunantwort gegen Implantate beitragen. In dieser Arbeit wird eine präzise Methode zur Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Färbung für die durchflusszytometrische Analyse beschrieben.

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Die hier beschriebenen Protokolle bieten einen Leitfaden zur Visualisierung und Quantifizierung der Aktivität von Neutrophilenproteasen im menschlichen Sputum. Die Anwendungen einer solchen Analyse reichen von der Bewertung entzündungshemmender Behandlungen über die Validierung von Biomarkern, das Screening von Medikamenten bis hin zu klinischen Studien mit großen Kohorten.

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In den letzten Jahren wurden mit lebenden Zellen basierende Tests erfolgreich verwendet worden, um Antikörper gegen Oberflächenantigene erkennen und Konformationsänderungen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie ermöglicht die Analyse von großen Kohorten von Patienten. Detektion von neuen Antikörper Diagnose und Behandlung von Autoimmunerkrankungen zu verbessern.

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Erfahren Sie eine optimierte Sputumaufbereitung für die Durchflusszytometrie zur Charakterisierung zellulärer Subpopulationen. Diese Methode ermöglicht präzise Zellzählungen und unterstützt die Lungenforschung bei COPD, Asthma und Lungenkrebs.

Qualitätskontrollierte Sputumanalyse mittels Durchflusszytometrie

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