Name: Mesoskopische optische Bildgebung des ganzen Mausherzens (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Erfahren Sie die mesoskopische optische Bildgebung ganzer Mausherzen mit Tissue-Clearing und Light-Sheet-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht hochaufgelöste 3D-Rekonstruktionen bei Erhalt der Gewebestruktur.

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Dieses Projekt erhielt Mittel aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 952166 (REPAIR), MUR im Rahmen des FISR-Programms, Projekt FISR2019_00320 und Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE-Projekt.

Alle Tierbehandlungen und -verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere durchgeführt und entsprachen den Grundsätzen und Vorschriften des italienischen Gesundheitsministeriums. Das Versuchsprotokoll wurde vom italienischen Gesundheitsministerium genehmigt (Protokollnummer 647/2015-PR). Alle Tiere wurden von ENVIGO, Italien, zur Verfügung gestellt. Für diese Experimente wurden 5 männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 6 Monaten verwendet.
1. Lösungsvorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,6) in einer chemischen Haube vor. Lagern Sie die 4%igen PFA-Aliquots mehrere Monate bei -20 °C.</li>
	<li>Hydrogel-Lösung vorbereiten: Mischen Sie 4% Acrylamid, 0,05% Bis-Acrylamid, 0,25% Initiatior AV-044 in 0,01 M PBS in einer chemischen Haube. Bewahren Sie die Reagenzien und die Lösung während der gesamten Zubereitung auf Eis auf. Lagern Sie die Hydrogel-Aliquots mehrere Monate bei -20 °C.</li>
	<li>Clearing-Lösung vorbereiten: 200 mM Borsäure, 4% Natriumdodecylsulfat (SDS) in entionisiertem Wasser mischen; pH 8,6 in einer chemischen Haube. Lagern Sie die Lösung zwischen 21-37 °C, um SDS-Niederschläge zu vermeiden.</li>
	<li>Bereiten Sie am Tag des Experiments eine frische Tyrode-Lösung vor: Fügen Sie 10 mM Glucose, 10 mM HEPES, 113 mM NaCl, 1,2 mM MgCl2 und 4,7 mM KCl hinzu; titrieren auf pH 7,4 mit 1 M NaOH.</li>
</ol>2. Herzisolation
<ol><li>Injizieren Sie 0,1 ml 500 I.E. Heparin subkutan 30 min vor der Herzisolierung.</li>
	<li>Füllen Sie eine 30-ml-Spritze und drei 6-cm-Petrischalen mit frischer Tyrode-Lösung. Machen Sie einen kleinen Riss (3-4 mm tief) am Rand einer der Petrischalen und legen Sie ihn unter ein stereoskopisches Mikroskop.</li>
	<li>Befestigen Sie eine Kanüle mit einem Durchmesser von 1 mm an der Spritze und führen Sie sie in den Riss der Petrischale ein. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Spritze befinden.</li>
	<li>Füllen Sie eine 20-ml-Spritze mit 4% PFA und bewahren Sie sie in der chemischen Haube auf. Bereiten Sie eine leere Petrischale unter der Haube vor.</li>
	<li>Betäuben Sie die Maus mit 3% Isofluran/Sauerstoff bei einer Flussrate von 1,0 l/min und opfern Sie sie durch zervikale Dislokation gemäß den geltenden Tierschutzbestimmungen.</li>
	<li>Entfernen Sie nach dem Opfer das Fell über der Brust und öffnen Sie die Brust, um vollen Zugang zum Herzen zu haben.</li>
	<li>Isolieren Sie das Herz, tauchen Sie es in die Petrischale, die zuvor mit 50 ml Tyrode Solution gefüllt war. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Aorta unmittelbar in der Nähe des Aortenbogens zu schneiden, um das Herz freizulegen.</li>
	<li>Übertragen Sie das Herz unter ein stereoskopisches Mikroskop und führen Sie die Kanülierung sorgfältig durch. Führen Sie die Kanüle nicht zu tief in die Aorta ein (nicht mehr als 2 mm), um Gewebeschäden zu vermeiden.</li>
	<li>Verwenden Sie eine kleine Klemme und eine Naht (Größe 5/0), um das Herz an der Kanüle zu befestigen.</li>
	<li>Durchbluten Sie das Herz mit 30 ml der Tyrode-Lösung mit einem konstanten Druck von 10 ml / min, um Blut aus den Gefäßen zu entfernen.</li>
	<li>Lösen Sie die Kanüle von der Spritze und legen Sie das Herz in die mit Tyrodenlösung gefüllte Petrischale. Achten Sie darauf, keine Luftblasen in der Kanüle zu haben; Andernfalls entfernen Sie die Luftblasen ordnungsgemäß.</li>
	<li>Befestigen Sie die 20-ml-Spritze, die mit kaltem 4% PFA gefüllt ist, an der Kanüle und perfundiert Sie das Herz mit dem gleichen konstanten Druck.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Herz in 10 ml 4% PFA bei 4 °C über Nacht (O/N). Um einen Gewebeabbau zu vermeiden, führen Sie die Schritte 2.6-2.13 in kürzester Zeit durch.</li>
</ol>3. Herzreinigung
<ol><li>Am nächsten Tag das Herz in 0,01 M PBS 3 mal bei 4 °C für 15 min waschen. HINWEIS: Nach diesem Schritt kann das Herz in PBS + 0,01% Natriumazid (NaN3) bei 4 °C für mehrere Monate gelagert werden.</li>
	<li>Das Herz in 30 ml Hydrogel-Lösung unter Schütteln (15 U/min) bei 4 °C für 3 Tage inkubieren.</li>
	<li>Entgasen Sie die Probe bei Raumtemperatur mit einem Trockner, einer Vakuumpumpe und einem Rohrsystem, das den Trockner sowohl mit der Pumpe als auch mit einer Stickstoffleitung verbindet.<ol><li>Legen Sie die Probe in den Trockner und öffnen Sie die Durchstechflasche, wobei Sie die Kappe darauf halten.</li>
		<li>Schließen Sie den Trockner und entfernen Sie den Sauerstoff aus dem Rohr, indem Sie die Stickstoffleitung öffnen.</li>
		<li>Schalten Sie die Vakuumpumpe ein, um den Sauerstoff für 10 Minuten aus dem Trockner zu entfernen.</li>
		<li>Schalten Sie die Pumpe aus und verwenden Sie den Knopf des Trockners, um die Stickstoffleitung zu öffnen. Sobald der Druck dem atmosphärischen Druck entspricht, öffnen Sie vorsichtig den Trockner und schließen Sie die Durchstechflasche schnell.</li>
	</ol></li>
	<li>Halten Sie das Herz in der entgasten Hydrogel-Lösung bei 37 °C für 3 h in Ruhe.</li>
	<li>Wenn das Hydrogel richtig polymerisiert ist und vollständig gallertartig erscheint, entfernen Sie vorsichtig das Herz davon und legen Sie es in den Probenhalter.</li>
	<li>Führen Sie den Probenhalter mit dem Herzen in eine der Clearingkammern ein und schließen Sie ihn ordnungsgemäß, um ein Auslaufen der Clearing-Lösung zu vermeiden.</li>
	<li>Schalten Sie das Wasserbad ein, in dem sich der Klärlösungsbehälter befindet, und die Schlauchpumpe, um die Rezirkulation der Klärlösung zu starten.</li>
	<li>Wechseln Sie die Clearinglösung im Behälter einmal pro Woche, um den Klärungsprozess zu beschleunigen.</li>
</ol>4. Zellmembranfärbung
<ol><li>Sobald das Herz vollständig geklärt erscheint, nehmen Sie es aus dem Probenhalter und waschen Sie es in 50 ml aufgewärmtem PBS für 24 Stunden. Erneut in 50 ml PBS + 1% Triton-X (PBS-T 1x) für 24 h waschen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in 0,01 mg/ml Weizenkeimagglutinin (WGA) - Alexa Fluor 633 in 3 ml PBS-T 1x im Schütteln (50 U/min) bei Raumtemperatur für 7 Tage.</li>
	<li>Nach der 7-tägigen Inkubation waschen Sie die Probe in 50 ml PBS-T 1x bei Raumtemperatur in Schütteln für 24 h.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in 4% PFA für 15 min und waschen Sie sie dann 3 mal in PBS für jeweils 5 min. HINWEIS: Nach diesem Schritt kann das Herz in PBS + 0,01% NaN3 bei 4 °C für mehrere Monate gelagert werden.</li>
	<li>Das Herz wird in steigenden Konzentrationen von 2,2′-Thiodiethanol (TDE) in 0,01 M PBS (20% und 47% TDE/PBS) für jeweils 8 h bis zur Endkonzentration von 68% TDE in 0,01 M PBS inkubiert, um den erforderlichen Brechungsindex (RI = 1,46) zu erhalten. Dies ist das RI-Matching-Medium (RI-Medium) zur Aufnahme von Bildern16.</li>
</ol>5. Herzmontage und -erfassung
HINWEIS: Alle Komponenten des optischen Systems sind in der Materialtabelle detailliert aufgeführt.
<ol><li>Füllen Sie ca. 80% der äußeren Küvette (Quarz, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) vorsichtig mit dem RI-Medium. HINWEIS: Hier ist es möglich, verschiedene nichtflüchtige Lösungen zu verwenden, die eine RI von 1,46 garantieren.</li>
	<li>Füllen Sie die interne Küvette (Quarz, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) vorsichtig mit dem gleichen RI-Medium.</li>
	<li>Tauchen Sie die Probe in die interne Küvette. Die oben beschriebenen Probeninkubationen ermöglichen es, dass die Probe im RI-Medium stabil bleibt, ohne gehalten zu werden.</li>
	<li>Bewegen Sie die Probe vorsichtig mit einer dünnen Pinzette auf den Boden der Küvette und ordnen Sie das Herz mit seiner Längsachse parallel zur Hauptachse der Küvette an, um den Anregungslichtweg über das Gewebe während des Scannens zu minimieren.</li>
	<li>Befestigen Sie den maßgeschneiderten Stecker vorsichtig mit zwei Schrauben über der Innenküvette.</li>
	<li>Montieren Sie die Probe mit den Magneten auf dem Mikroskoptisch.</li>
	<li>Übersetzen Sie den vertikalen Probentisch manuell, um die interne Küvette in die externe einzutauchen.</li>
	<li>Schalten Sie die Anregungslichtquelle (Wellenlänge von 638 nm) ein und stellen Sie eine niedrige Leistung ein (in der Größenordnung von 3 mW).</li>
	<li>Bewegen Sie die Probe mit dem motorisierten Übersetzer, um eine innere Ebene des Gewebes zu beleuchten.</li>
	<li>Schalten Sie die Imaging-Software (HCImageLive) ein und stellen Sie den Kamera-Trigger auf External (Light-Sheet) - Modus ein, um den Erfassungstrigger der Kamera durch die benutzerdefinierte Software zu steuern, die das gesamte Setup steuert.</li>
	<li>Aktivieren Sie die automatische Speicherung im Bedienfeld " Scaneinstellungen " und legen Sie den Ausgabeordner fest, in dem die Bilder gespeichert werden sollen.</li>
	<li>Stellen Sie die Probenposition in der XY-Ebene manuell mit den linearen Übersetzern ein, um die Probe in die Mitte des FoV des Kamerasensors zu bewegen.</li>
	<li>Bewegen Sie die Probe mit dem linearen motorisierten Übersetzer entlang der Z-Achse, um Herzgrenzen für die tomographische Rekonstruktion zu identifizieren.</li>
	<li>Erhöhen Sie die Laserleistung auf ~20 mW, bereit für die Bildgebungssitzung.</li>
	<li>Starten Sie die tomographische Erfassung, klicken Sie auf die Schaltfläche Start im Sequence Panel der Imaging-Software und bewegen Sie gleichzeitig die Probe mit der konstanten Geschwindigkeit von 6 μm/s mit dem motorisierten Übersetzer entlang der Z-Achse.</li>
</ol>

<ol><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications%3A+A+consensus+paper+from+an+International+Forum+on+Cardiac+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).</li>
<li>Finocchiaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrhythmogenic+potential+of+myocardial+disarray+in+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+genetic+basis%2C+functional+consequences+and+relation+to+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22EP+Europace%22%5BJournal%5D)">Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death.</a> EP Europace. 2, 1-11 (2021).</li>
<li>Bishop, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+anatomically+detailed+MRI-derived+rabbit+ventricular+model+and+assessment+of+its+impact+on+simulations+of+electrophysiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).</li>
<li>Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+the+role+of+the+coronary+vasculature+during+external+field+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transaction+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation.</a> IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106, 369-387 (2020).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+of+fixed+tissue%3A+a+review+from+a+microscopist%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205(2016).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+tissue+physicochemical+properties+using+polyfunctional+crosslinkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers.</a> Nature Biotechnology. 37, 73(2019).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+the+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769(2018).</li>
<li>Olianti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+imaging+and+morphometry+of+the+heart+capillary+system+in+spontaneously+hypertensive+rats+and+normotensive+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls.</a> Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).</li>
<li>Pianca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathetic+innervation+network+shapes+the+myocardium+by+locally+controlling+cardiomyocyte+size+through+the+cellular+proteolytic+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery.</a> The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).</li>
<li>Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+clearer+view+of+sympathetic+innervation+of+cardiac+and+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).</li>
<li>Voigt, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mesoSPIM+initiative+-+open-source+light-sheet+microscopes+for+imaging+cleared+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue.</a> Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).</li>
<li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9808(2015).</li>
<li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+transduction+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012(2016).</li>
<li>Yi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvessel+prediction+in+H%26E+stained+pathology+images+using+fully+convolutional+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 64(2018).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1982(2020).</li>
</ol>

Nichts zu offenbaren.

In dieser Arbeit wurde ein erfolgreicher Ansatz vorgestellt, um ein ganzes Mausherz in hoher Auflösung zu klären, zu färben und abzubilden. Zunächst wurde ein Gewebetransformationsprotokoll (CLARITY) optimiert und durchgeführt, leicht modifiziert für seine Anwendung auf das Herzgewebe. Um eine effiziente Rekonstruktion eines ganzen Herzens in 3D zu erhalten, ist es wichtig, das Phänomen der Lichtstreuung zu verhindern. Die CLARITY-Methodik ermöglicht es uns, ein hochtransparentes intaktes Herz zu erhalten, erfordert jedo...

Strukturumbau im Zusammenhang mit Herzerkrankungen kann die elektrische Leitung beeinträchtigen und elektromechanische Funktionsstörungen des Organs 1,2 verursachen. Aktuelle Ansätze zur Vorhersage funktioneller Veränderungen verwenden häufig MRT und DT-MRT, um eine Gesamtrekonstruktion der Fibroseablagerung, des Gefäßbaums und der Faserverteilung des Herzens zu erhalten, und sie werden verwendet, um APP-Pfade (Preferential Action Potential Propagation) über das Organ 3,4 zu modellieren. Diese Strategien können einen schönen Überblick über die Herzorganisation geben. Ihre räumliche Auflösung reicht jedoch nicht aus, um die Auswirkungen des strukturellen Umbaus auf die Herzfunktion auf zellulärer Ebene zu untersuchen.
Es ist eine Herausforderung, dieses Framework in einer anderen Größenordnung zu platzieren, in der einzelne Zellen individuelle Rollen bei der Ausbreitung des Aktionspotentials spielen können. Die Haupteinschränkung ist die Ineffizienz von Standard-Bildgebungsmethoden zur Durchführung hochauflösender Bildgebung (mikrometrische Auflösung) in massiven (zentimetergroßen) Geweben. Tatsächlich ist die Abbildung biologischer Gewebe in 3D mit hoher Auflösung aufgrund der Undurchsichtigkeit des Gewebes sehr kompliziert. Der gebräuchlichste Ansatz zur Durchführung von 3D-Rekonstruktionen in ganzen Organen ist die Vorbereitung von Dünnschnitten. Präzises Schneiden, Zusammensetzen und Abbilden erfordern jedoch erheblichen Aufwand und Zeit. Ein alternativer Ansatz, bei dem die Probe nicht geschnitten werden muss, besteht darin, ein transparentes Gewebe zu erzeugen. In den letzten Jahren wurden mehrere Methoden zur Klärung von Geweben vorgeschlagen 5,6,7,8. Die Herausforderung, massive, transparente und fluoreszenzmarkierte Gewebe herzustellen, wurde kürzlich durch die Entwicklung echter Gewebetransformationsansätze (CLARITY9, SHIELD10) erreicht. Insbesondere basiert die CLARITY-Methode auf der Umwandlung eines intakten Gewebes in eine nanoporöse, hydrogel-hybridisierte, lipidfreie Form, die es ermöglicht, durch die selektive Entfernung von Membranlipiddoppelschichten eine hohe Transparenz zu verleihen. Bemerkenswerterweise hat sich diese Methode auch in der Herzvorbereitung als erfolgreich erwiesen 11,12,13,14. Da das Herz jedoch zu zerbrechlich ist, um für eine aktive Klärung geeignet zu sein, muss es mit dem passiven Ansatz gereinigt werden, der lange Zeit benötigt, um vollständige Transparenz zu verleihen.
In Kombination mit fortschrittlichen bildgebenden Verfahren wie der Lichtblattmikroskopie hat CLARITY das Potenzial, massives 3D-Herzgewebe mit mikrometrischer Auflösung abzubilden. In der Lichtblattmikroskopie wird die Beleuchtung der Probe mit einer dünnen Lichtschicht durchgeführt, die in der Brennebene des Detektionsobjektivs eingeschlossen ist. Die Fluoreszenzemission wird entlang einer Achse senkrecht zur Beleuchtungsebene15 gesammelt. Die Detektionsarchitektur ähnelt der Weitfeldmikroskopie, wodurch die Erfassung viel schneller ist als bei Laserscanning-Mikroskopen. Das Bewegen der Probe durch die Lichtschicht ermöglicht eine vollständige Tomographie von großen Proben, bis zu zentimetergroßen Proben. Aufgrund der intrinsischen Eigenschaften des Gaußstrahls ist es jedoch möglich, ein sehr dünnes (in der Größenordnung von wenigen Mikrometern) Lichtblatt nur für eine begrenzte räumliche Ausdehnung zu erhalten, wodurch das Sichtfeld (FoV) drastisch eingeschränkt wird. Vor kurzem wurde ein neuartiges Anregungsschema eingeführt, um diese Einschränkung zu überwinden, und für die Bildgebung des Gehirns angewendet, was 3D-Rekonstruktionen mit isotroper Auflösung ermöglicht16.
In diesem Beitrag wird ein passiver Clearingansatz vorgestellt, der eine signifikante Reduzierung des vom CLARITY-Protokoll benötigten Clearing-Timings ermöglicht. Der hier beschriebene methodische Rahmen erlaubt es, ein ganzes Mausherz mit mikrometrischer Auflösung in einem einzigen tomographischen Scan mit einer Erfassungszeit in der Größenordnung von Minuten zu rekonstruieren.

<table><tbody><tr><td>2-2' Thiodiethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>166782</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>Bio-Rad</td><td>61-0140</td><td></td></tr><tr><td>AV-044 Initiator</td><td>Wako Chemicals</td><td>AVP5874</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Acrylamid</td><td>Bio-Rad</td><td>161-042</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca Blitz 4.0 v3</td><td></td></tr><tr><td>Kamerasoftware</td><td>Hamamatsu</td><td>HC Image</td><td></td></tr><tr><td>Kollimationslinse</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-050-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Detektionsarm</td><td>Integrierte Optik</td><td>0638L-15A-NI-PT-NF</td><td></td></tr><tr><td>Anregungslinse</td><td>Nikon</td><td>91863</td><td></td></tr><tr><td>Extera&igrave; nale Quarzküvette</td><td>Portmann</td><td>Instruments UQ-753</td><td></td></tr><tr><td>Fold Spiegel</td><td>Thorlabs</td><td>BBE1-E02</td><td></td></tr><tr><td>Galvanometrischer Spiegel</td><td>Thorlabs</td><td>GVS211/M</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HCImage Live</td><td>Hamamatsu</td><td>4.6.1.19</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Interne Quarzküvette</td><td>Portmann Instruments</td><td>UQ-204</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Laserquelle</td><td>Integrierte Optik</td><td>0638L-15A-NI-PT-NF</td><td></td></tr><tr><td>Langpassfilter</td><td>Thorlabs</td><td>FELH0650</td><td></td></tr><tr><td>Magnetfuß</td><td>Thorlabs</td><td>KB25/M</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Chem-Lab</td><td>CI-1316-0250</td><td></td></tr><tr><td>Motorisierter Traslator</td><td>Physisk Instrument</td><td>M-122.2DD</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59888</td><td></td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>Thorlabs</td><td>TL2X-SAP</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd-Agar</td><td>Scientific</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpufferlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Polycap AS</td><td>Whatman</td><td>2606T</td><td></td></tr><tr><td>Relaislinse</td><td>Qioptiq</td><td>G063200000</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Rohrlinse</td><td>Thorlabs</td><td>ACT508-200-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Abstimmbare Linse</td><td>Optotune</td><td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumpumpe</td><td>KNF Neuberger Inc</td><td>N86KT.18</td><td></td></tr><tr><td>Wasser Bad</td><td>Memmert</td><td>WTB</td><td></td></tr></tbody></table>

mesoskopische optische bildgebung des ganzen mausherzens

Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

Sowohl genetische als auch nicht-genetische Herzerkrankungen können schwere Umbauprozesse im Herzen verursachen. Strukturelle Umbauten, wie Kollagenablagerung (Fibrose) und zelluläre Fehlausrichtung, können die elektrische Leitung beeinträchtigen, elektromechanische Funktionsstörungen verursachen und schließlich zu Arrhythmien führen. Aktuelle Vorhersagemodelle dieser funktionellen Veränderungen basieren auf nicht integrierten und niedrig aufgelösten Strukturinformationen. Diesen Rahmen auf eine andere Größenordnung zu legen, ist aufgrund der Unwirksamkeit von Standard-Bildgebungsmethoden bei der Durchführung hochauflösender Bildgebung in massivem Gewebe eine Herausforderung. In dieser Arbeit beschreiben wir einen methodischen Rahmen, der die Abbildung ganzer Mausherzen mit mikrometrischer Auflösung ermöglicht. Die Erreichung dieses Ziels erforderte eine technologische Anstrengung, bei der Fortschritte bei der Gewebetransformation und bildgebenden Verfahren kombiniert wurden. Zunächst beschreiben wir ein optimiertes CLARITY-Protokoll, das in der Lage ist, ein intaktes Herz in eine nanoporöse, hydrogelhybridisierte, lipidfreie Form umzuwandeln, die eine hohe Transparenz und tiefe Färbung ermöglicht. Dann wird ein Fluoreszenz-Lichtblattmikroskop beschrieben, das in der Lage ist, schnell Bilder eines mesoskopischen Sichtfeldes (mm-Skala) mit der Auflösung im Mikrometerbereich aufzunehmen. Im Anschluss an das mesoSPIM-Projekt ermöglicht das konzipierte Mikroskop die Rekonstruktion des gesamten Mausherzens mit mikrometrischer Auflösung in einem einzigen tomographischen Scan. Wir glauben, dass dieser methodische Rahmen es ermöglichen wird, die Beteiligung der Zytoarchitektur an den elektrischen Dysfunktionen zu klären und den Weg für ein umfassendes Modell zu ebnen, das sowohl die funktionellen als auch die strukturellen Daten berücksichtigt und so eine einheitliche Untersuchung der strukturellen Ursachen ermöglicht, die zu elektrischen und mechanischen Veränderungen nach dem Gewebeumbau führen.

Das entwickelte passive Clearing-Setup ermöglicht es, in etwa 3 Monaten ein freies erwachsenes Mausherz (mit einer Dimension der Größenordnung von 10 mm x 6 mm x 6 mm) zu erhalten. Alle Komponenten des Setups sind wie in Abbildung 1 dargestellt montiert. Der vernachlässigbare Temperaturgradient zwischen den einzelnen Räumkammern (in der Größenordnung von 3 °C) ermöglicht es, die Temperatur in einem angemessenen Bereich über alle Kammern hinweg zu halten.
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Wir berichten über eine Methode zur mesoskopischen Rekonstruktion des gesamten Mausherzens durch die Kombination neuer Fortschritte in der Gewebetransformation und Färbung mit der Entwicklung eines axial gescannten Lichtblattmikroskops.

Mesoskopische optische Bildgebung des ganzen Mausherzens

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

Diese Methodik kombiniert die Verbesserung des Clearing-Protokolls mit der Augenfähigkeit des optischen Schnitts der Mesos PIM-Technologie, so dass wir mesoskopische Rekonstruktionen mit mikrometrischer Auflösung durchführen können. Es bietet die Möglichkeit, massives Herzgewebe oder ganze Mausherzen in einem einzigen Scan abzubilden, ohne die ursprüngliche dreidimensionale Gewebeorganisation zu verlieren. Nachdem das Herz durch proximale Aorta in Tyrolösung gewaschen und in 4% Paraformaldehyd in 0,01 molar PBS fixiert wurde, ist es bereit, das Clearing-Protokoll zu starten.Waschen Sie das Herz dreimal in 0,01 molaren PBS bei vier Grad Celsius für 15 Minuten. Nach diesem Schritt kann das Herz in PBS und 0,01% Natriumazid bei vier Grad Celsius für mehrere Monate gelagert werden. Inkubieren Sie das Herz in 20 Milliliter Hydrogellösung in Schüttelzustand bei 15 U/min für drei Tage bei vier Grad Celsius.Entgasen Sie die Probe bei Raumtemperatur mit einem Trockner, einer Vakuumpumpe und einem Schlauchsystem, das den Trockner sowohl mit dem Pumpband als auch mit der Stickstoffleitung verbindet. Legen Sie die Probe in den Trockner und öffnen Sie die Durchstechflasche, wobei Sie die Kappe darauf halten. Schließen Sie den Trockner und entfernen Sie den Sauerstoff aus dem Rohr, indem Sie die Stickstoffleitung öffnen.Schalten Sie die Vakuumpumpe ein, um den Sauerstoff für 10 Minuten aus dem Trockner zu entfernen. Schalten Sie die Pumpe aus und öffnen Sie den Knopf des Trockners zur Stickstoffleitung. Öffnen Sie dann den Stickstoffhahn.Sobald der Druck dem atmosphärischen Druck entspricht, öffnen Sie den Trockner vorsichtig und schließen Sie die Durchstechflasche schnell. Halten Sie das Herz in der entgasten Hydrogellösung bei 37 Grad Celsius für etwa drei Stunden in Ruhe. Wenn das Hydrogel richtig polymerisiert ist und vollständig gallertartig erscheint, entfernen Sie vorsichtig das Herz davon und legen Sie es in eine klärende Lösung in die Durchstechflasche mit Reinigungslösung.Wechseln Sie die Clearing-Lösung in der Durchstechflasche alle drei Tage, um den Klärungsprozess zu beschleunigen. Sobald das Herz vollständig geklärt erscheint, nehmen Sie es aus der Durchstechflasche und waschen Sie es in 50 Milliliter aufgewärmtem PBS für 24 Stunden im Schüttelzustand. Erneut in 50 Milliliter eines X PBS T für 24 Stunden im Schüttelzustand waschen.Inkubieren Sie die Probe in 0,01 Milligramm pro Milliliter Weizenkeim-Aglutinin Alexa Boden 633 in drei Milliliter eines X PBS T in schüttelndem Zustand bei 50 U/min bei Raumtemperatur für sieben Tage. Nach der siebentägigen Inkubation waschen Sie die Probe in 50 Milliliter eines X PBS T bei Raumtemperatur unter Schütteln für 24 Stunden. Inkubieren Sie die Probe in 4% PFA für 15 Minuten und waschen Sie sie dann dreimal in 0,01 molaren PBS für jeweils fünf Minuten.Inkubieren Sie das Herz nacheinander in 20 und 47% TDE in 0,01 molaren PBS für jeweils acht Stunden. Und schließlich bei 68% TDE in 0,01 molaren PBS, um den erforderlichen Brechungsindex von 1,46 zu liefern. Füllen Sie vorsichtig etwa 80% des äußeren Quarzquvets mit dem Brechungsindexmedium.Füllen Sie den inneren Quarzquavet mit dem gleichen Brechungsindexmedium. Tauchen Sie die Probe in den inneren Quvet. Bewegen Sie die Probe vorsichtig mit einer dünnen Pinzette auf den Boden des Quvets und ordnen Sie das Herz mit seiner Längsachse parallel zur Hauptachse des Quvets an, um den Anregungslichtweg über das Gewebe während des Scannens zu minimieren.Befestigen Sie den maßgeschneiderten Stecker vorsichtig mit zwei Schrauben über dem internen Quvet. Montieren Sie die Probe mit Magneten auf dem Mikroskoptisch. Übersetzen Sie den vertikalen Probentisch manuell, um den internen Quvet in den externen einzutauchen.Schalten Sie die Anregungslichtquelle mit einer Wellenlänge von 638 Nanometern ein und stellen Sie sie auf niedrige Leistung in der Größenordnung von drei Milliwatt ein. Bewegen Sie die Probe mit dem motorisierten Übersetzer, um eine innere Platte des Gewebes zu beleuchten. Schalten Sie die HC Image Live-Kamerasoftware ein und stellen Sie den Kameraauslöser auf den externen Randauslöser-Lichtblattmodus ein, um den Erfassungsauslöser der Kamera durch die benutzerdefinierte Software zu steuern, die das gesamte Setup steuert.Aktivieren Sie die automatische Speicherung in der Kamerasoftware und legen Sie den Ausgabeordner fest, in dem die Bilder gespeichert werden sollen. Passen Sie die Probenposition in der X-Y-Ebene manuell mit den linearen Übersetzern an, um die Probe in die Mitte des Sichtfelds des Kamerasensors zu bewegen. Bewegen Sie die Probe mit dem linearen motorisierten Übersetzer entlang der Z-Achse, um Herzgrenzen für die tomographische Rekonstruktion zu identifizieren.Erhöhen Sie die Laserleistung auf ca. 20 Milliwatt, bevor Sie mit der Bildgebungssitzung beginnen. Starten Sie die tomographische Erfassung, indem Sie auf die Schaltfläche Start im Erfassungsbereich der Bildgebungssoftware klicken, und beginnen Sie gleichzeitig, die Probe mit der konstanten Geschwindigkeit von sechs Mikrometern pro Sekunde mit dem motorisierten Übersetzer entlang der Z-Achse zu bewegen. Die Kombination der Klarheitsmethodik mit TDE als Brechungsindexmedium verändert weder signifikant das Endvolumen der Probe noch führt sie zu einer isotropen Verformung der Probe.Die Anregungsoptik erzeugte eine Lichtschicht mit einem minimalen Abfall von etwa sechs Mikrometern, die am Rand des Sichtfeldes bis zu 175 Mikrometer divergierte. Die Synchronisation des Kamera-Rolling-Shutters mit dem axialen Scan des Lichtblattabfalls stellte sicher, dass das Emissionssignal nur in dem Probenteil erfasst wurde, der mit dem Abfall des Lichtblattes angeregt wurde, was zu einem durchschnittlichen F W H M von etwa 6,7 Mikrometern über das gesamte Sichtfeld führte. Die Z-Punkt-Spreizungsfunktion des Mikroskops wurde ebenfalls durch eine tomographische Rekonstruktion der fluoreszierenden Nanokugel geschätzt und ein F W H M von 6,4 Mikrometern durch die Anpassung geschätzt.Die Möglichkeit des Systems, einzellige Membranen dreidimensional mit einem ausreichenden Signal-Rausch-Verhältnis im gesamten Organ aufzulösen, wurde ebenfalls bestätigt. Das Entgasungsverfahren ist der kritischste Schritt des Protokolls. Wenn es nicht richtig durchgeführt wird, kann das Gewebe während der Inkubation in einer Reinigungslösung auf Schäden hinweisen.Das vorgestellte Protokoll kann mit einem Multi-Färbeprotokoll kombiniert werden, um eine vollständige Organrekonstruktion zu erreichen, die verschiedene biologische Strukturen integriert, und kann zur Untersuchung pathologischer Modelle angewendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

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