Name: Abbildung replikativer Domänen in ultrastrukturell konserviertem Chromatin mittels Elektronentomographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Lernen Sie die hochauflösende Abbildung replikativer Domänen in Chromatin mittels Elektronentomographie mit EdU- und Nanogold-Markierung. Diese Methode ermöglicht präzise Einblicke in DNA-Replikationsprozesse.

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Diese Arbeit wurde zum Teil von RSF (Grant #17-15-01290) und RFBR (Grant #19-015-00273) unterstützt. Die Autoren danken dem Lomonosov Moscow State University Development Program (PNR 5.13) und dem Nikon Center of Excellence in korrelativer Bildgebung am Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology für den Zugang zu bildgebenden Instrumenten.

Das Protokoll ist für adhärente Zellen optimiert und wurde an HeLa-, HT1080- und CHO-Zelllinien getestet.
1. Zellmarkierung und -fixierung
<ol><li>Plattenzellen auf säuregereinigten Deckgläsern in einer 3 cm Petrischale. Züchten Sie die Zellen in den Medien, die für die verwendete Zelllinie empfohlen werden, zu 70% Konfluenz.</li>
	<li>Fügen Sie EdU (5-Ethynyl-2'-desoxyuridin) aus 10 mM Stamm bis 10 μM Endkonzentration hinzu und legen Sie die Zellen für 10 min oder länger in den Inkubator (abhängig vom Experimentziel). Für kürzere Hülsenfrüchte (bis zu 2 min) bereiten Sie eine Petrischale mit vorgewärmten frischen Nährmedien vor, die mit 10 μM EdU ergänzt werden, und übertragen Sie Deckgläser darin, anstatt den Zellen direkt EdU hinzuzufügen. HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.</li>
	<li>Fixieren Sie die markierten Zellen mit 2,5% Glutaraldehyd, frisch hergestellt, indem Sie 25% des Vorrats in 100 mM Cacodylatpuffer verdünnen, für 1 h. HINWEIS: Die nachfolgenden EdU-Erkennungsschritte reagieren empfindlich auf das Fixierungstiming. Längere Fixationszeiten können sich negativ auf die EdU-Kennzeichnung auswirken und zu einem geringeren Signal-Rausch-Verhältnis führen.</li>
	<li>Entfernen Sie Glutaraldehyd, indem Sie die Proben mit PBS waschen, ergänzt mit 5 mMMgCl 2 (PBS* danach). Dreimal waschen mit einer 10-minütigen Inkubation für jede Wäsche.</li>
	<li>Permeabilisieren Sie Plasmamembranen mit 1% Triton X-100 in PBS* (danach PBS*T). Waschen Sie zweimal mit einer 5-minütigen Inkubation für jede Wäsche.</li>
	<li>Waschen Sie die Probe ausgiebig mit PBS*. Führen Sie fünf Änderungen durch und inkubieren Sie bei jeder Änderung 5 Minuten lang.</li>
	<li>Löschen Sie die restfreien Aldehydgruppen mit 20 mM Glycin in PBS*, zweimal für jeweils 10 min.</li>
	<li>Blockieren Sie die Proben in 1% BSA in PBS* für 30 min.</li>
</ol>2. Klick-Reaktion
HINWEIS: Dieses Verfahren wurde gegenüber einem zuvor veröffentlichten Protokoll19 geändert.
<ol><li>Bereiten Sie unmittelbar vor der Anwendung eine Click-Reaktionsmischung für den EdU-Nachweis vor: Mischen Sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen 430 μL 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 20 μL 100 mM CuSO 4, 1,2 μLBiotin-Azid (10 mM in DMSO) und 50 μL 0,5 M Ascorbinsäure. Zur Qualitätskontrolle der replizierenden Markierung und des Click-Verfahrens auf der Ebene der Fluoreszenzmikroskopie kann Biotin-Azid durch AlexaFluor 488-Azid ersetzt werden. HINWEIS: Die Reihenfolge der Addition von Komponenten in der obigen Reaktion ist wichtig.</li>
	<li>Führen Sie eine Klickreaktion in einer feuchten Kammer durch, um die Verdunstung und Konzentrationsverschiebungen im Reaktionscocktail zu minimieren. Bereiten Sie die feuchte Kammer vor, indem Sie ein nasses Blatt Filterpapier auf den Boden der Petrischale legen und mit einer Paraffinfolie bedecken. Legen Sie die Deckgläser mit den Zellen nach oben auf die Oberfläche der Folie und schichten Sie 50-100 μL des Reaktionscocktails auf das Deckglas. Die Reaktion dauert bei Raumtemperatur 30 Minuten.</li>
	<li>Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Probe in 0,1% Triton X-100 in PBS* (PBS*T) fünfmal für jeweils 5 Minuten waschen.</li>
	<li>Blockieren Sie 1% BSA in PBS * T für 30 Minuten bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Bereiten Sie Streptavidin-Nanogold-Lösung mit PBS*T vor, das 1% BSA enthält. Inkubieren Sie die Probe mit Streptavidin, konjugiert mit 1,4 nm Nanogoldpartikeln (Nanosonden) in 1% BSA + PBS*T über Nacht bei +4 °C in der neu vorbereiteten Feuchtkammer.</li>
	<li>Stoppen Sie die Reaktion und waschen Sie die Probe in PBS * T, fünfmal für jeweils 10 Minuten.</li>
	<li>Stabilisieren Sie den Biotin-Streptavidin-Komplex durch Nachfixierung in 1% Glutaraldehyd in PBS* für 30 min.</li>
	<li>Entfernen Sie Glutaraldehyd durch intensives Waschen mit entionisiertem Wasser und waschen Sie die Probe in PBS *, fünfmal für jeweils 20 Minuten.</li>
	<li>Quenchfreie Aldehydgruppen mit frisch zubereiteten 1 mg/ml NaBH4 in Wasser, zweimal für jeweils 10 min. Während der Inkubation bilden sich Blasen von H2, die die Deckgläser anheben können. Drücken Sie sie vorsichtig mit der Pinzette nach unten.</li>
	<li>Mit entionisiertem Wasser fünfmal für jeweils 5 min waschen. HINWEIS: Für die Qualitätskontrolle im Etikettierschritt ist es ratsam, eine Kontrollmarkierung mit fluoreszierend markiertem Streptavidin durchzuführen (Abbildung 2). Dies würde eine Schätzung der Beschriftungsintensität und des Hintergrundniveaus liefern, bevor zu mühsamen und artefaktanfälligen nachfolgenden Schritten übergegangen wird.</li>
</ol>3. Ag-Verstärkung
ANMERKUNG: Dieses Verfahren wurde von Gilerovitch et al., 1995 geändert (siehe 20,21).
<ol><li>Resuspendiert 50 g Akazienpulver in 100 ml entionisiertem Wasser. 3 Tage auflösen, entgasen und durch vier Schichten Käsetuch filtrieren. Gefroren in 5 ml-Aliquots in 50-ml-Röhrchen lagern. Unmittelbar vor Gebrauch auftauen.</li>
	<li>2 ml 1 M MES (pH = 6,1) zu 5 ml aufgetautem Aliquot Akazienpulverlösung hinzufügen, um 7 ml 0,28 M MES (pH = 6,1) in Akazienpulverlösung herzustellen. Mischen Sie, indem Sie die Tube 30 Minuten lang langsam schaukeln. Wickeln Sie das Rohr mit Folie um, um es vor Licht zu schützen.</li>
	<li>Gleichzeitig mit Schritt 3.2. Waschen Sie Deckgläser mit Waschpuffer (50 mM MES, pH = 5,8, 200 mM Saccharose), dreimal für jeweils 10 min.</li>
	<li>Bereiten Sie die frische Lösung von N-Propylgallat (NPG) vor. In einer 15-ml-Tube 10 mg NPG in 250 μL 96% Ethanol auflösen und mit deionisiertem Wasser auf 5 ml einstellen.</li>
	<li>Geben Sie 36 mg Silberlactat in ein mit Folie umwickeltes 15-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Nach Schritt 3.2. ist abgeschlossen, fügen Sie 1,5 ml NPG-Lösung zu Akazienpulvermischung hinzu und rocken Sie für weitere 3 min. HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte werden in einer Dunkelkammer durchgeführt. Verwenden Sie nicht-aktinisches Safelight (gelb oder rot).</li>
	<li>Quilibrieren Sie die Probe mit dem Waschpuffer und begeben Sie sich in den dunklen Raum. Gleichzeitig 5 ml entionisiertes Wasser in Silberlactat geben und durch kräftiges Schütteln für 1-2 min auflösen.</li>
	<li>1,5 ml Silberlactatlösung in die Akazienpulvermischung geben, 1 min langsam eintopfen. Vermeiden Sie Blasenbildung, da Sauerstoff in der Mischung die Reaktion verlangsamt.</li>
	<li>Lassen Sie die Lösung aus der Schale mit Deckgläsern ab und gießen Sie 3 ml Silberlactat-Akazienpulver-Mischung auf die Zellen. Das Gericht mehrmals schaukeln und 2-5 min inkubieren. Die Inkubationszeit hängt von der Akazienpulvercharge und der Temperatur ab. Dies sollte experimentell definiert werden. HINWEIS: Eine längere Inkubationszeit kann zu einer unspezifischen Silberbindung führen.</li>
	<li>Um die Reaktion zu stoppen, lassen Sie die Reaktionsmischung abtropfen und waschen Sie das Gericht ausgiebig mit drei bis fünf Wechseln von deionisiertem Wasser, gefolgt von drei weiteren Änderungen für jeweils 5 Minuten.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Färbung unter dem Hellfeldmikroskop. Eine gute Färbung sollte hell- bis dunkelbraun mit einem sehr schwachen gelblichen Hintergrund sein. HINWEIS: Wenn sich die Färbung nicht entwickelt, ist es möglich, sofort mit der bereits gemachten Mischung zu wiederholen (die Mischung ist für ca. 15 Minuten aktiv, wenn sie im Dunkeln gehalten wird). Allerdings kann sich die Färbung in diesem Fall zu schnell entwickeln.</li>
</ol>4. Goldtönung
HINWEIS: Um Silbernanopartikel in den nachfolgenden Verfahren vor der Auflösung durchOsO4-Oxidation zu schützen, wird bei diesem Schritt eine Imprägnierung mit Gold verwendet (Sawada, Esaki, 1994)22.
<ol><li>Deckgläser mit entionisiertem Wasser abspülen.</li>
	<li>Um Silbernanopartikel vor der Auflösung durchOsO4-Oxidation zu schützen, inkubieren Sie die Proben in 0,05% Tetrachloraurinsäure für 2 min im Dunkeln.</li>
	<li>10 min gründlich mit entionisiertem Wasser waschen. HINWEIS: In diesem Stadium wird dem DNA-haltigen Material zusätzlicher Kontrast hinzugefügt. Die Farbe der Probe sollte sich von braun zu schwarz ändern.</li>
</ol>5. ChromEM
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von Ou et al., 201716, geändert.
<ol><li>Inkubieren Sie die Deckgläser und sättigen Sie die Proben in 10 μM DRAQ5 in PBS für 10 min im Dunkeln.</li>
	<li>0,2%ige Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB)-Lösung in 50 mM Tris oder PBS herstellen: DAB in 90% des Endvolumens durch kräftiges Rühren im Dunkeln auflösen und dann den pH-Wert mit NaOH auf 7,0-7,4 einstellen. Stellen Sie die Lautstärke auf 100% ein und filtern Sie durch einen 0,22 μM-Filter, der in Folie eingewickelt ist.</li>
	<li>DAB-Lösung in die Zellen geben (2 ml pro 3 cm Petrischale) und 1 min inkubieren.</li>
	<li>Bewegen Sie das Deckglas in die Petrischale mit Glasboden und stellen Sie es auf die Bühne eines umgekehrten Mikroskops. Bestrahlung der Probe (mehrere Sichtfelder) auf einem inversen Mikroskop mit Metallhalogenid-Lichtquelle und Cy5-Filterset (640 nm, 1 W/cm2 in Brennebene) durch Plan Apo λ 40х (NA = 0,95) Objektiv für 10 min. HINWEIS: Ein Hinweis auf eine erfolgreiche DAB-Photokonversion ist die vollständige DRAQ5-Photobleiche und die Bildung dunkler DAB-Niederschläge in bestrahlten Kernen. Letzteres ist jedoch nicht immer über ein intensives EdU-Silber-Gold-Signal ersichtlich (insbesondere wenn ausgedehnte EdU-Impulse verwendet werden).</li>
	<li>Mit entionisiertem Wasser dreimal für jeweils 5 min waschen.</li>
</ol>6. Dehydratisierung und Einbettung von Epoxidharzen
<ol><li>Stellen Sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen eine teilweise reduzierte Osmiumtetraoxidlösung her, indem Sie 2% wässrige Lösung von K4Fe (CN) 6 mit einer gleichen Menge von 2% wässriger Lösung von OsO4 mischen, um eine Endkonzentration von 1% beider Komponenten zu erhalten. Bezüge in reduziertem OsO 4 für 1 h inkubieren und in entionisiertem Wasser dreimal für jeweils 5 min waschen. HINWEIS: In diesem Stadium reagiert die reduzierte Osmiumverbindung mit DAB-Ablagerungen und erhöht den Kontrast der DNA. ACHTUNG: Osmium ist giftig, arbeitet unter einem Abzug und behandelt Abfälle gemäß den örtlichen Sicherheitsvorschriften.</li>
	<li>Dehydrieren Sie die Proben in einer Reihe von abgestuften Ethanollösungen in steigenden Prozentsätzen: 50% EtOH - 3 x 10 min; 70% EtOH - 3 x 10 min, 80% EtOH - 3 x 10 min, 96% EtOH - 3 x 10 min, 100% EtOH - 3 x 10 min.</li>
	<li>Für die Infiltration und Einbettung verwenden Sie die Harzformel mit dem Komponentenvolumenverhältnis wie folgt: Epoxidharzmonomer:DDSA:MNA:DMP-30 = 9:6:4:0.23 (w/w). Diese Formel ist mit Ethanol mischbar.<ol>
<li>Inkubieren Sie das Deckglas in der Ethanol-Harz-Mischung (3 Teile 100% EtOH: 1 Teil Epoxidharz) für 30 min.</li>
		<li>Inkubieren Sie das Deckglas in der Ethanol-Harz-Mischung (1 Teil 100% EtOH: 1 Teil Epoxidharz) für 2 h.</li>
		<li>Inkubieren Sie das Deckglas in der Ethanol-Harz-Mischung (1 Teil 100% EtOH: 3 Teile Epoxidharz) über Nacht.</li>
		<li>Ersetzen Sie die Ethanol-Harz-Mischung durch frisch zubereitetes reines Harz. 8 h in reiner Harzmischung inkubieren. Öffnen Sie die Schale, um Ethanolreste verdampfen zu lassen.</li>
		<li>Deckgläser mit reinem Harz in eine neue Schale geben und 2 h bei 37-42 °C inkubieren.</li>
		<li>Füllen Sie eine Silikonform mit frisch zubereitetem Harz. Legen Sie die Deckgläser mit den Zellen nach unten auf eine geeignete Silikonform, die mit Epoxidharz gefüllt ist. Aushärten Sie das Harz für 24 h bei 37 °C, dann bei 60 °C für mindestens 2 Tage. ACHTUNG: Bestandteile der Epoxidharzmischung sind potenzielle Karzinogene. Tragen Sie Handschuhe und arbeiten Sie unter dem Abzug.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie die Harzplatte aus der Form, reinigen Sie die Oberfläche des Deckglases mit dem Skalpell oder der Rasierklinge. Um den Deckglas zu entfernen, lassen Sie den Deckglas in flüssigen Stickstoff fallen und geben Sie die Platte dann in das kochende Wasser. Wiederholen Sie dies bei Bedarf.</li>
	<li>Suchen Sie den bestrahlten Bereich unter einem Stereomikroskop und schneiden Sie ihn mit einer Bügelsäge oder einem anderen geeigneten Instrument von der Platte aus. Wärmen Sie die Platte bei Bedarf bei 70 °C auf einer Kochplatte vor.</li>
	<li>Befestigen Sie den Ausschnitt in einem Ultramikrotom-Probenhalter für den endgültigen Blockbeschnitt. Bereiten Sie mit dem Rasiermesser die pyramidenförmige Probe vor. Montieren Sie den Halter mit Pyramide auf das Ultramikrotom und installieren Sie das Messer.<ol>
<li>Schneiden Sie den Block so zu, dass die bestrahlten Zellen mit EdU-Label enthalten sind. Bereiten Sie einen halbdünnen Schnitt (250 nm Dicke) vor, der für die Elektronentomographie geeignet ist. HINWEIS: Die Profildicke kann an die experimentellen Anforderungen angepasst werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lösen Sie den Abschnitt von der Messerkante und legen Sie ihn auf die Einzelschlitzgitter. Für die Elektronentomographie werden 250-nm-Abschnitte auf 1-mm-Single-Slot-Gitter gepflückt und nach dem Trocknen können diese Abschnitte von beiden Seiten mit Kohlenstoff beschichtet werden. Es ist keine zusätzliche Kontrastierung notwendig. HINWEIS: Da die Abschnitte bereits kontrastreiche Au-Ag-Partikel enthalten, ist es nicht erforderlich, der Oberfläche des Abschnitts treuhänderische Goldpartikel hinzuzufügen.</li>
	<li>Untersuchen Sie die Gitter in einem Transmissionselektronenmikroskop bei geringer Vergrößerung (ca. 600x), um die Zellen mit geeigneten Replikationsmustern zu lokalisieren. HINWEIS: Dieses Protokoll erzeugt eine Beschriftungsdichte, die hoch genug ist, um Replikationsherde auch bei geringer Vergrößerung leicht zu erkennen. Es ist ratsam, zunächst eine Karte des Abschnitts für die anschließende Navigation und Winkelprojektionssammlung für die Tomographie zu erstellen. Wechseln Sie zu höherer Vergrößerung und nehmen Sie hochauflösende Bilder auf.</li>
</ol>7. Elektronentomographie
<ol><li>Setzen Sie das Gitter mit einem hochgeneigten Halter in das Transmissionselektronenmikroskop ein. Laden Sie die Probe in das Elektronenmikroskop und lokalisieren Sie den interessierenden Bereich.</li>
	<li>Richten Sie das Mikroskop im EFTEM-Modus im nahezu parallelen Beleuchtungsmodus aus. Stimmen Sie den Energiefilter mit einem 20-eV-Energieauswahlspalt ab, der auf Null-Verlust-Spitze platziert ist.</li>
	<li>Die Tomographie-Aufnahmefläche wird mit einer Dosisleistung von 40 e/Å 2/s für mindestens 1,5-2 min vorbestrahlt, was der Gesamtdosis von mindestens 3000 e/Å2 entspricht.</li>
	<li>Passen Sie die euzentrische Höhe mit automatischer Aufgabe in SerialEM an. Überprüfen Sie die Autofokus-Aufgabe, um sicherzustellen, dass sie bei Null-Neigungswinkel und -0,8 mkm Ziel-Defokus-Wert korrekt funktioniert.</li>
	<li>Kippen Sie den Probenhalter mit der Walk-Up-Aufgabe auf -60°.</li>
	<li>Richten Sie die Tomographieerfassung von -60 bis +60° mit Schritt 2.0° ein. Die Belichtung sollte abhängig vom Neigungswinkel eingestellt werden, um die durchschnittliche Intensität der Kamera beizubehalten. Begrenzen Sie die Bildverschiebung für den Fall, dass sie eine Energieverschiebung und damit eine Spaltfehlausrichtung verursacht. Die Tomographiedaten sollten als .mrc-Datei gespeichert werden.</li>
	<li>Importieren Sie die .mrc-Datei in die IMOD-Software für die Tomographie-Rekonstruktion. Entfernen Sie die Ausreißer-Pixelwerte aufgrund von Röntgenstrahlen.</li>
	<li>Richten Sie die Neigungsreihe aus. Führen Sie eine anfängliche Kreuzkorrelation durch und markieren Sie dann manuell 10-12 Goldpartikel als Fiducials. Verfolgen Sie das Fiducial-Modell und überprüfen Sie, ob jedes Fiducial durch die Tilt-Serie korrekt verfolgt wird. Erstellen Sie Probentomogramme (Scheiben) und markieren Sie manuell die dünnen Schnittränder, um eine mögliche Neigung der rekonstruierten Dichte innerhalb des Volumens zu verhindern. Der mittlere Restfehler bei der Feinausrichtung betrug weniger als 1,2 pix.</li>
	<li>Rekonstruieren Sie das Tomogramm mit einem gefilterten Rückprojektionsalgorithmus und schneiden Sie dann die Ausgabe zu, um den interessierenden Bereich in das endgültige Volume einzufügen.</li>
</ol>

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<li>Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten

Die hier beschriebene Methode hat mehrere Vorteile gegenüber zuvor veröffentlichten Protokollen. Erstens eliminiert die Verwendung der Click-Chemie zur Markierung replizierter DNA die Notwendigkeit der DNA-Denaturierung, die für den BrdU-Nachweis mit Antikörpern erforderlich ist, wodurch die Chromatin-Ultrastruktur besser erhalten wird. 
Zweitens minimiert die Verwendung von Biotin als sekundärer Ligand, der nach der Glutaraldehydfixierung und dem ordnungsgemäßen Abschrecken von ungebundenen A...

Die DNA-Replikation ist ein grundlegender biologischer Prozess, der für das originalgetreue Kopieren und Übertragen der genetischen Information während der Zellteilung erforderlich ist. Bei höheren Eukaryoten unterliegt die DNA-Replikation einer engen räumlich-zeitlichen Regulation, die sich in einer sequentiellen Aktivierung der Replikationsursprüngemanifestiert 1. Benachbarte Replikationsursprünge, die synchron ausgelöst werden, bilden Cluster von replicons2. Auf der Ebene der optischen Mikroskopie werden Stellen der laufenden DNA-Replikation als Replikationsherde unterschiedlicher Anzahl und Größe nachgewiesen. Replikationsherde zeigen spezifische Muster der räumlichen Verteilung innerhalb des Zellkerns, abhängig vom Replikationszeitpunkt der markierten DNA3,4, die wiederum eng mit ihrer Genaktivität korreliert ist. Dank der klar definierten Sequenz der DNA-Replikation, die streng in Raum und Zeit geordnet ist, ist die replizierende Markierung eine leistungsstarke Methode der präzisen DNA-Markierung nicht nur für die Untersuchung des Replikationsprozesses an sich, sondern auch zur Unterscheidung einer spezifischen DNA-Unterfraktion mit definierter Transkriptionsaktivität und Verdichtungsebene. Die Visualisierung von replizierendem Chromatin erfolgt in der Regel durch den Nachweis von Hauptproteinkomponenten der DNA-Replikationsmaschinerie (entweder durch Immunfärbung oder durch Expression fluoreszierender Protein-Tags5,6) oder durch die Einbeziehung modifizierter DNA-Synthesevorläufer 7,8,9,10 . Von diesen ermöglichen nur Methoden, die auf der Einarbeitung modifizierter Nukleotide in neu replizierte DNA basieren, die Erfassung von Konformationsänderungen im Chromatin während der Replikation und verfolgen das Verhalten replizierender Domänen nach Abschluss ihrer Replikation.
In höheren Eukaryoten fügt die DNA-Verpackung in Chromatin der Regulation grundlegender genetischer Funktionen (Transkription, Replikation, Reparation usw.) eine weitere Ebene der Komplexität hinzu. Die Chromatinfaltung beeinflusst die Zugänglichkeit der DNA zu regulatorischen Transfaktoren und DNA-Konformationsänderungen (Doppelhelix-Abwicklung), die für die Template-Synthese erforderlich sind. Daher ist es allgemein anerkannt, dass DNA-abhängige synthetische Prozesse im Zellkern einen strukturellen Übergang von Chromatin von seinem kondensierten, repressiven Zustand zu einer zugänglicheren, offenen Konformation erfordern. Zytologisch sind diese beiden Chromatinzustände als Heterochromatin und Euchromatin definiert. Es gibt jedoch immer noch keinen Konsens über die Art und Weise der DNA-Faltung im Zellkern. Die Hypothesen reichen von einem "Polymerschmelze" -Modell11, bei dem sich die nukleosomale Faser wie ein zufälliges Polymer verhält, bei dem die Packungsdichte durch Phasentrennungsmechanismen gesteuert wird, bis hin zu hierarchischen Faltungsmodellen, die die sequentielle Bildung von chromatinfaserähnlichen Strukturen mit zunehmender Dicke postulieren12,13. Hierarchische Faltungsmodelle haben kürzlich Unterstützung durch molekulare Ansätze erhalten, die auf der Analyse von In-situ-DNA-DNA-Kontakten (Chromosomenkonformationsabscheidung, 3C) basieren und die Existenz der Hierarchie der strukturellen Chromatindomänendemonstrieren 14. Es ist wichtig zu beachten, dass Replikationseinheiten sehr gut mit diesen Chromatindomänen korrelieren15. Die Hauptkritik an diesen Modellen basiert auf der potenziellen künstlichen Chromatinaggregation, die durch Probenvorbereitungsverfahren wie die Permeabilisierung von Zellmembranen und die Entfernung von Nicht-Chromatin-Komponenten verursacht wird, um den Chromatinkontrast für ultrastrukturelle Studien zu verbessern und gleichzeitig die Chromatin-Zugänglichkeit für verschiedene Sonden (z. B. Antikörper) zu verbessern. Jüngste technische Fortschritte bei der selektiven DNA-Färbung für die Elektronenmikroskopie durch DNA-bindende fluorophorvermittelte Photooxidation von Diaminobenzidin (ChromEMT6) haben die Beseitigung dieses Hindernisses ermöglicht. Die gleichen Überlegungen gelten jedoch für die elektronenmikroskopische Visualisierung der sich replizierenden DNA17,18. Hier beschreiben wir eine Technik, die die gleichzeitige hochauflösende ultrastrukturelle Kartierung von neu synthetisierter DNA und Gesamtchromatin in intakten aldehydvernetzten Zellen ermöglicht. Die Technik kombiniert den Nachweis von EdU-markierter DNA durch Click-Chemie mit biotinylierten Sonden und Streptavidin-Nanogold und ChromEMT.

<table><tbody><tr><td>Reagenz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A10044</td><td></td></tr><tr><td>2-(4-Morpholino)ethansulfonsäure (MES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 555-azid</td><td>Termo Fisher</td><td>A20012</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-azid</td><td>Lumiprobe</td><td>C3730</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Boval</td><td>LY-0080</td><td></td></tr><tr><td>DDSA</td><td>SPI-CHEM</td><td>26544-38-7</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>SPI-CHEM</td><td>90-72-2</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Thermo Scientific</td><td>62251</td><td></td></tr><tr><td>Epoxidharzmonomer</td><td>SPI-CHEM</td><td>90529-77-4</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd (25%, EM-Qualität)</td><td>TED PELLA, INC</td><td>18426</td><td></td></tr><tr><td>Gummi arabicum</td><td>ACROS Organics</td><td>258850010</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Panreac</td><td>141396.1209</td><td></td></tr><tr><td>NaBH4</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>213462</td><td></td></tr><tr><td>NMA</td><td>SPI-CHEM</td><td>25134-21-8</td><td></td></tr><tr><td>N-Propylgallat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>MP Biomedicals</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>Silberlactat</td><td>ALDRICH</td><td>359750-5G</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-AlexaFluor 488 Konjugat</td><td>Termo Fisher</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Nanogold Konjugat</td><td>Nanosonden</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>Tetrachloraurinsäure</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>HT1004</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris)</td><td>CHEM-IMPEX INT'L</td><td>298</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka Chemica</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbon Coater</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kupfer Single Slot Gitter</td><td>Ted Pella</td><td>1GC10H</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 Fluoreszenzfilter Set (Ex620/60 DM660 Em700/75)</td><td>Nikon</td><td>Cy5 HQ</td><td>Alternativen: Zeiss, Leica, Olympus</td></tr><tr><td>Diamond Messer Ultra Wet 45o</td><td>Diatome</td><td>DU</td><td>Alternativen: Ted Pella</td></tr><tr><td>Leuchtstoffmikroskop</td><td>Nikon</td><td>Ti-E</td><td>Alternativen: Zeiss, Leica, Olympus</td></tr><tr><td>High-tilt Probenhalter</td><td>Jeol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Biosan</td><td>Multi Bio RS-24</td><td></td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop mit 200 kV im EFTEM-Modus, mit High-Tilt-Goniometer</td><td>Jeol</td><td>JEM-2100</td><td>Alternativen: FEI, Hitachi</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Ted Pella</td><td>523</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica</td><td>UltraCut-E</td><td>Alternativen: RMC</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bildaufnahme</td><td>Open Source</td><td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)</td><td></td></tr><tr><td>Bildverarbeitung</td><td>Open Source</td><td>IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)</td><td></td></tr></tbody></table>

abbildung replikativer domänen in ultrastrukturell konserviertem chromatin mittels elektronentomographie

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Die Prinzipien der DNA-Faltung im Zellkern und ihre dynamischen Transformationen, die während der Erfüllung grundlegender genetischer Funktionen (Transkription, Replikation, Segregation usw.) auftreten, sind nach wie vor wenig verstanden, was zum Teil auf das Fehlen experimenteller Ansätze zur hochauflösenden Visualisierung spezifischer Chromatinorte in strukturell konservierten Kernen zurückzuführen ist. Hier stellen wir ein Protokoll zur Visualisierung replitiver Domänen in Monolayer-Zellkultur in situ vor, indem wir die EdU-Markierung neu synthetisierter DNA mit anschließender Markierungsdetektion mit Ag-Amplifikation von Nanogoldpartikeln und ChromEM-Färbung von Chromatin kombinieren. Dieses Protokoll ermöglicht die kontrastreiche, hocheffiziente Voreinbettungsmarkierung, die mit der traditionellen Glutaraldehydfixierung kompatibel ist und die beste strukturelle Konservierung von Chromatin für die Probenverarbeitung bei Raumtemperatur bietet. Ein weiterer Vorteil der Prä-Embedding-Kennzeichnung ist die Möglichkeit, Zellen von Interesse für die Schnittaufnahme vorzuselektieren. Dies ist besonders wichtig für die Analyse heterogener Zellpopulationen sowie für die Kompatibilität mit elektronentomographischen Ansätzen zur hochauflösenden 3D-Analyse der Chromatinorganisation an Replikationsstellen und zur Analyse der postreplizierenden Chromatin-Neuanordnung und Schwesterchromatid-Segregation in der Interphase.

Replikationsherde in Säugetierzellkernen zeigen je nach S-Phasen-Progression unterschiedliche Verteilungsmuster innerhalb des Kerns. Diese Muster korrelieren mit der transkriptionellen Aktivität der replizierten Loci. Da die hier vorgestellte Methode ein ziemlich starkes Fixationsverfahren verwendet, ist es ziemlich einfach, die repliktive Pulsmarkierung für den spezifischen Nachweis von Chromatin-Loci in verschiedenen Transkriptionszuständen zu verwenden, selbst unter Bedingungen, die eine beste strukturelle Konservieru...

Dieses Protokoll stellt eine Technik zur hochauflösenden Kartierung von Replikationsstellen in strukturell konserviertem Chromatin in situ vor, die eine Kombination aus voreingebetteter EdU-Streptatvid-Nanogold-Markierung und ChromEMT verwendet.

Abbildung replikativer Domänen in ultrastrukturell konserviertem Chromatin mittels Elektronentomographie

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

Wir präsentieren ein Protokoll zur elektronenmikroskopischen Visualisierung der replizierenden Domänen in der Zelle durch die EdU-Markierung der neu synthetisierten DNA und Markierungsdetektion mit Silberverstärkung von Nanogoldpartikeln und ChromEM-Färbung des Chromatins. Dieses Protokoll gibt die kontrastreiche Voreinbettungsmarkierung mit herkömmlicher Glutaraldehydfixierung, die die beste strukturelle Konservierung des Chromatins für die Probenverarbeitung bei Raumtemperatur bietet. Dieses Protokoll ist für die Haftzelle optimiert, die auf den Deckgläsern in der Petrischale wächst.Fügen Sie EdU zu 10 Mikromol Endkonzentration hinzu und legen Sie die Zellen für die gewünschte Markierungszeit in den Inkubator. Fixieren Sie die markierten Zellen mit 2,5% Gluaradehydrat in einer 100-Millimol-Natriumcacodylatlösung für eine Stunde. Eine längere Fixationszeit kann sich nachteilig auf die EdU-Kennzeichnung auswirken.Entfernen Sie Glutaraldehyd, indem Sie die Proben mit PBS spülen, das mit fünf Millimol Magnesiumchlorid ergänzt wird, das weiterhin als PBS-Stern angesehen wird. Dreimal für 10 Minuten waschen. Permeabilisieren Sie Plasmamembranen mit 1% Lösung von Trione X-100 in PBS Star, nehmen Sie zwei Änderungen für jeweils fünf Minuten vor.Diese Lösung wird weiter als PBS star T.Ausführlich die Probe mit PBS star waschen. Fünf Änderungen für jeweils fünf Minuten. Löschen Sie die verbleibenden Aldehydgruppen mit 20 Millimol Glycin in PBS Star, zweimal für 10 Minuten.Legen Sie die Probe eine halbe Stunde lang mit 1% BSA in PBS star. Bereiten Sie während der Blockierung in BSA den Reaktionscocktail für die EdU-Erkennung vor. Die Reihenfolge der Komponentenaddition ist wichtig.Die EdU-Biotin-Azid-Konjugation wird in der feuchten Kammer durchgeführt, um die Verdunstung und Konzentrationsverschiebungen im Reaktionscocktail zu minimieren. Bereiten Sie die feuchte Kammer vor. Legen Sie das Deckglas mit einer Zelle nach oben auf den Parafilm und schichten Sie 50 bis 100 Mikroliter des Reaktionscocktails auf das Deckglas.Die Reaktion dauert bei Raumtemperatur 30 Minuten. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Probe in PBS-Stern T waschen, fünfmal für jeweils fünf Minuten. Blockieren Sie erneut mit 1% BSA in PBS-Stern T für eine weitere halbe Stunde.Streptavidin-Nanogold-Lösung in PBS star T mit 1%BSA vorbereiten. Inkubieren Sie die Probe mit Streptavidin über Nacht bei plus vier Grad in einer neu vorbereiteten Feuchtkammer. Das Verfahren ist das gleiche wie bei der EdU-Biotin-Azid-Konjugation.Stoppen Sie die Reaktion und waschen Sie die Probe, fünfmal für jeweils 10 Minuten mit PBS-Stern T.Stabilisieren Sie den Biotin-Streptavidin-Komplex durch zusätzliche Fixierung von 1% Glutaraldehyd PBS-Stern für eine halbe Stunde. Entfernen Sie Glutaraldehyd durch intensives Waschen mit entionisiertem Wasser. Restaldehydgruppen mit einem Milligramm pro Milliliter Natriumborhydrid abschrecken.Noch einmal gründlich waschen. Der nächste Schritt besteht darin, die Größe von Nanogold-Partikeln durch Silberabscheidung auf dem goldenen Kurs zu erhöhen. Bereiten Sie Premixe vor, um die Aktivität in der Dunkelkammer zu minimieren.Gleichen Sie die Proben mit dem Waschpuffer aus und begeben Sie sich in eine Dunkelkammer. Mischen Sie in der Dunkelkammer die Komponenten, um die Waschlösung vorzubereiten, und tragen Sie sie auf die Proben auf. Akazienpulverlösung ist hochvisisch.Während des Mischens der Komponenten schaukeln Sie das Rohr langsam, um Blasen- und Schaumbildung zu vermeiden. Die Reaktion dauert zwei bis fünf Minuten. Wir empfehlen, einen Testlauf durchzuführen, um die optimale Reaktionszeit zu bestimmen.Eine längere Inkubationszeit kann zu einer unspezifischen Silberabscheidung führen. Um die Reaktion zu stoppen, spülen Sie die Probe schnell mit drei bis fünf Änderungen des deionisierten Wassers ab. Gefolgt von drei weiteren Änderungen für jeweils fünf Minuten.Um die Silbernanopartikel vor der Auflösung durch das Osmiumtetroxid zu schützen, inkubieren Sie die Proben in 0,05% Tetrachloraurinsäure für zwei Minuten im Dunkeln. Gründlich mit deionisiertem Wasser waschen. In diesem Stadium wird dem DNA-haltigen Material zusätzlicher Kontrast hinzugefügt.Sättigen Sie die Probe mit DRAQ5-DNA-Färbung. Diamionobenzidinlösung in die Probe geben und eine Minute lang inkubieren. Bewegen Sie das Deckglas in die Petrischale mit Glasboden und legen Sie es auf den Tisch des umgekehrten Mikroskops.Bestrahlen Sie mehrere Sichtfelder mit 640 Nanometer rotem Licht. Das linke Feld zeigt die komplette Fotobleiche von DRAQ5. Auf der rechten Seite ist das gleiche Sichtfeld im Durchlichtlicht abgebildet, das DAB-Niederschlag zeigt.Waschen Sie Proben mit deionisiertem Wasser. Die nächste Stufe sollte unter dem Abzug durchgeführt werden. Hergestellt eine teilweise reduzierte Osmiumtetroxidlösung.Sei vorsichtig. Diese Substanz ist sehr flüchtig und giftig. Tragen Sie die vorbereitete Lösung auf die Probe auf.In diesem Stadium reagieren die reduzierten Osmiumverbindungen mit Diamionobenzidinablagerungen und erhöhen den Kontrast der DNA. Entsorgen Sie die osmiumhaltige Lösung gemäß Ihren lokalen Vorschriften und waschen Sie die Proben dreimal für jeweils fünf Minuten. Die Probe wird in einer Reihe von steigenden Ethanolkonzentrationen weiter dehydriert, gefolgt von der Infiltration der Zellen mit Ethanolharzmischungen.Ersetzen Sie die Alkoholharzmischung durch frisch zubereitetes reines Harz. Füllen Sie die richtig dimensionierte Einbettform mit einem frisch zubereiteten Harz. Legen Sie das Deckglas mit einer Zelle nach unten über den mit Harz gefüllten Hohlraum.Aushärten Sie das Harz für 24 Stunden bei 37 Grad. Dann bei 60 Grad für mindestens zwei Tage. Entfernen Sie Harz von einer Unterseite einer Abdeckung.Lassen Sie die Platte in einen flüssigen Stickstoff fallen und geben Sie sie dann in kochendes Wasser um. Das Glas sollte sich lösen. Wiederholen Sie dies bei Bedarf.Bestrahlte Sichtfelder sollten aufgrund der Diamionobenzidinabscheidung und der DAB-Färbung deutlich sichtbar sein. Schneiden Sie den Interessenbereich mit der Bügelsäge oder einem anderen geeigneten Instrument aus der Platte aus. Legen Sie den Ausschnitt in den einfachen Ultramikrotom-Halter.Richten Sie das Ultramikrotom für das endgültige Blocktrimmen ein. Bereiten Sie mit der Rasierklinge den pyramidenförmigen Pfeiler vor. Die Größe einer flachen Fläche auf der Spitze der Pyramide sollte etwa 400 x 200 Mikrometer betragen.Montieren Sie die vorbereitete Pyramide in den Ultramikrotomarm und installieren Sie das Messer. Bereiten Sie die Abschnitte vor. Die Profildicke kann an die experimentellen Anforderungen angepasst werden.Wir streben die EM-Tomographie an. Also haben wir Abschnitte mit einer Dicke von 250 Nanometern vorbereitet, die auch als Halbdünnschnitte bezeichnet werden. Lösen Sie die Abschnitte von der Messerkante und montieren Sie sie auf einem Schlitzgitter.Wir benutzten ein Schlitzgitter, sie waren rund ein Millimeter, um um herum zu sein, ein Millimeter seitliche Öffnung. Die geringe Öffnungsgröße sorgt für eine bessere Stabilität der Abschnitte. Lassen Sie die Proben auf dem Gitter trocknen.In diesem Moment sind die Abschnitte bereit für die Beobachtung. Legen Sie das Gitter in den elektronenmikroskopischen Probenhalter. Laden Sie die Probe in das Elektronenmikroskop.Erwerben Sie die Tilt-Serie. Replikationsherde in Zellkernen von Säugetieren zeigen je nach S-Phasen-Progression unterschiedliche Verteilungsmuster. Erfolgreiche EdU-Markierung, die durch die Klickreaktion mit fluoreszierend markiertem Azid bestätigt wurde, zeigt ein typisches Replikationsmuster in der heterogenen Zellpopulation nach Glutaraldehydfixierung an der Spitze.Die Streptavidin-Markierung kann durch Glutaraldehyd beeinflusst werden. Überprüfen Sie also zuerst die Fluoreszenz-Streptavidin-Färbung unter den gleichen Bedingungen wie Streptavidin-Nanogold auf dem Boden. Ein gutes Ergebnis des Silberverbesserungsverfahrens ist eine dunkelbraune Färbung einiger Kerne und eine sehr schwache gelbe Cytoplast-Färbung, die auf der Unterseite zu sehen ist.Vorteil einer Voreinbettungsbeschriftung ist die Möglichkeit, Zellen für den Schnitt auszuwählen. Dies ist in diesem Stadium möglich, da die Markierungsmuster unter einem Hellfeldmikroskop sichtbar werden. Die entsprechende Beschriftung führt zu den gut abgegrenzten Replikationsstandorten.Pfeilspitzen zeigen die DAB-gefärbten Chromatinfasern. Die Hintergrundbeschriftung auf der rechten Seite ist auf wenige Nanopartikel pro Quadratmikrometer beschränkt. Halbdünne Schnitte sind bereit für die Tomographie und erfordern keine Zugabe von Goldnanopartikeln.Der beschriebene Ansatz, der für die Studien der Chromatinorganisation an Standorten mit aktivierter Replikation verwendet wird. Zur Analyse der postreplizierten Neuanordnung von Chromatin einschließlich hochauflösender Bildgebung der Chromatinsegregation. Es wurde auch für die replizierte Markierung großer Chromosomendomänen und Studien zur Chromatinfaltung und Heterochromatin höherer Ordnung verwendet.Diese bildgebende Technik ist auch als Referenzpunkt für die Daten wichtig, die durch andere nicht-mikroskopische Ansätze erzeugt werden. Die Methode kann auch in korrelierte mikroskopische Studien einschließlich Superauflösungstechniken integriert werden. Dies eröffnet neue Horizonte in der Erforschung der Chromatin-Struktur höherer Ordnung und ihrer Dynamik in den verschiedenen physiologischen Zuständen der Zelle.

imaging-replicative-domains-ultrastructurally-preserved-chromatin

Research

Forschung

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