Name: Im lebenden Organismus Immunogenitätsscreening von tumorabgeleiteten extrazellulären Vesikeln durch Durchflusszytometrie von Milz-T-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Lernen Sie die Durchflusszytometrie zur Analyse der Immunogenität tumorabgeleiteter extrazellulärer Vesikel in Milz-T-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung immunogener EVs für personalisierte Krebstherapien.

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Diese Studie wurde gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 und Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (an H.P.), ein Mechtild Harf Forschungsstipendium der DKMS Foundation for Giving Life (an H.P.) ein Young Investigator Award der Melanoma Research Alliance (an S.H.), ein Stipendium der Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (an F.S.), einen Seed Fund der Technischen Universität München (an S.H.) und ein Forschungsstipendium der Wilhelm Sander Stiftung (2021.041.1, an S.H.). H. P. wird durch das EMBO Young Investigator Program unterstützt.
AUTORENBEITRÄGE:
F.S., H.P. und S.H. entwarfen die Forschung, analysierten und interpretierten die Ergebnisse. F.S. und S.H. schrieben das Manuskript. H.P. und S.H. leiteten die Studie.

Zu Beginn der Experimente waren die Mäuse mindestens 6 Wochen alt und wurden unter bestimmten pathogenfreien Bedingungen gehalten. Das vorliegende Protokoll entspricht den institutionellen ethischen Standards und den geltenden lokalen Vorschriften. Tierversuche wurden von der örtlichen Zulassungsbehörde (Regierung von Oberbayern, München, Deutschland) genehmigt. Mögliche geschlechtsspezifische Verzerrungen wurden in diesen Studien nicht untersucht.
1. Erzeugung und Isolierung von EVs aus Tumorzellen nach Chemotherapie-Exposition
<ol><li>Kultur murine B16-Melanomzellen, die Ovalbumin (B16-OVA) in DMEM (mit 4 mM L-Glutamin und 4,5 g/L D-Glukose) exprimieren, ergänzt mit FCS (10% v/v), Penicillin (100 Einheiten/ml) und Streptomycin (100 μg/ml) bei 37 °C, bis die Zellen stetig wachsen und zu etwa 90% konfluieren. HINWEIS: Führen Sie diesen Abschnitt des Protokolls vollständig unter sterilen Bedingungen mit einer Zellkulturhaube durch. Für die Analyse anderer Krebsentitäten sind Zelllinien, die ein starkes Antigen exprimieren, vorzuziehen, um antigenspezifische T-Zell-Antworten zu bewerten, da sie eine spezifische Ex-vivo-Antigenrestimulation ermöglichen.</li>
	<li>Um die für die EV-Erzeugung erforderlichen Zellkulturmedien vorzubereiten, entleeren Sie Rinder-EVs innerhalb von FCS durch Ultrazentrifugation bei 100.000 x g für 24 h bei 4 ° C und entsorgen Sie dann das Pellet. Alternativ können Sie vorher eine handelsübliche Zubereitung mit wenig tierischen Elektrofahrzeugen wählen.</li>
	<li>Ernten Sie B16-OVA-Zellen und waschen Sie sie zweimal in PBS und säen Sie sie dann in einer Konzentration von 400.000 Zellen / ml in EV-erschöpften Medien. HINWEIS: Passen Sie die Zellkonzentration an die Wachstumsdynamik der untersuchten Zelllinie an, damit die Zellen nicht überwachsen.</li>
	<li>Behandeln Sie B16-OVA-Zellen durch Zugabe von 30 μg Oxaliplatin pro ml und inkubieren Sie 24 h bei 37 °C. Lassen Sie die Kontrollbedingungen unbehandelt. Bei der ersten Verwendung einer genotoxischen Substanz titrieren Sie die gewünschte zytotoxische Wirksamkeit unter Verwendung von Zelllebensfähigkeitstests wie Trypan Blue Exclusion18. HINWEIS: Dieser Assay kann auch EVs bewerten, die in Zellkulturen erzeugt werden, die neben Chemotherapeutika mit anderen immunmodulierenden Substanzen oder ionisierender Bestrahlung behandelt wurden. ACHTUNG: Oxaliplatin verursacht Haut- und schwere Augenreizungen und kann eine allergische Hautreaktion und Atemwegsreizungen verursachen. Oxaliplatin steht im Verdacht, Krebs zu verursachen. Verwenden Sie vorsichtshalber persönliche Schutzausrüstung, einschließlich angemessener Handschuhe, Schutzbrillen, Masken und Kleidung, die vor der Wiederverwendung gereinigt werden. Vermeiden Sie das Einatmen und waschen Sie die Hände nach der Handhabung gründlich. Vermeiden Sie die Freisetzung in die Umwelt und entsorgen Sie Oxaliplatin gemäß den geltenden Vorschriften. Informieren Sie sich ausführlich über das Sicherheitsdatenblatt.</li>
	<li>Sammeln Sie Zellkulturüberstände. Zentrifugieren Sie zuerst bei 400 x g für 5 min bei 4 °C und dann bei 2.000 x g für 30 min bei 4 °C, wobei jedes Mal das Pellet entsorgt wird. Zum Schluss filtern Sie durch eine 220 nm PVDF-Membran. Verwenden Sie für jeden Schritt ein frisches Rohr, um Zelltrümmer zu entfernen. HINWEIS: In diesem Stadium kann der EV-haltige Überstand einen Tag lang bei 4 °C gelagert werden, bevor das Protokoll fortgesetzt wird. Es wird jedoch dringend empfohlen, den beschriebenen Zeitplan mit sofortiger EV-Reinigung einzuhalten.</li>
	<li>Mischen Sie 1 ml Überstand mit 0,5 ml eines bestimmten kommerziell erhältlichen Exosom-Isolationsreagenzes (siehe Materialtabelle) in einem V-förmigen 1,5-ml-Rohr. Pipettieren Sie gründlich auf und ab oder wirbeln Sie, um eine homogene Lösung zu erhalten. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>Zentrifuge bei 10.000 x g für 60 min bei 4 °C. Verwerfen Sie vorsichtig den Überstand. Entfernen Sie die verbleibenden Tropfen, indem Sie das 1,5-ml-Rohr kopfüber auf ein Papiertuch klopfen und durch eine Pipette mit einer feinen Spitze absaugen, ohne das EV-Pellet am Boden zu berühren.<ol>
<li>Entfernen Sie gründlich alle Flüssigkeiten, um eine unkontrollierte Verdünnung des EV-Pellets zu verhindern. Führen Sie diese Aufgaben auch schnell aus, um zu verhindern, dass das Pellet austrocknet.</li>
	</ol></li>
	<li>Suspendieren Sie die EVs in kaltem PBS, indem Sie auf und ab pipettieren, ohne das Pellet mit der Spitze von der Rohrwand zu kratzen. Übertragen Sie nun die Aufhängung Schritt für Schritt von der ersten auf die letzte Röhre, um die EVs zu bündeln. HINWEIS: Verwenden Sie ein PBS-Volumen, das 5 μL multipliziert mit der Anzahl der Röhrchen entspricht. 5 μL der endgültigen Suspension enthalten die isolierten EVs, die aus 400.000 Zellen unter Chemotherapie oder in einem stabilen Zustand freigesetzt werden.</li>
	<li>Verwenden Sie vorzugsweise Elektrofahrzeuge direkt. Wenn dies nicht möglich ist, lagern Sie EV-Suspensionen bei -80 °C in silikonisierten Gefäßen bis zu 28 Tage bis zur Anwendung. HINWEIS: Die hier und in mehreren anderen Publikationen beschriebenen EVs verlieren ihre jeweilige biologische Funktion nicht, wenn sie für diesen Zeitraum bei -80 °C gelagert werden19.</li>
	<li>Quantifizierung und Charakterisierung von EV-Isolaten gemäß den MISEV2018-Richtlinien20. HINWEIS: Mögliche Methoden zur Quantifizierung sind die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)21 und der Nachweis der membrangebundenen Proteine von EV22. Mögliche Ansätze zur weiteren Charakterisierung von EVs sind die Elektronenmikroskopie23 und Western Blot20.</li>
</ol>2. Immunisierung von Mäusen mit EVs
<ol><li>Planen Sie das In-vivo-Experiment mit C57BL/6-Mäusen (oder anderen syngenen Mäusen, die der Tumorzelllinie entsprechen), einschließlich Behandlungsgruppen, die EVs erhalten, die von behandelten Zellen, unbehandelten Zellen bzw. PBS (Vehikel) abgeleitet sind. HINWEIS: Verwenden Sie vorzugsweise Mäuse im Alter von 6-8 Wochen, um zu verhindern, dass physiologische Seneszenz die Immunantwort verringert24.</li>
	<li>Mischen Sie 5 μL EV-Suspension mit 55 μL kaltem PBS für jede Maus innerhalb der jeweiligen Behandlungsgruppe, um sie mit EVs zu immunisieren, die aus 4,0 x 105 B16-OVA-Zellen isoliert wurden. HINWEIS: Diese Menge an Elektrofahrzeugen entspricht etwa 2 x 109 Partikeln, die durch eine Nanopartikel-Tracking-Analyse gemessen wurden (Daten nicht gezeigt). OVA-Protein, gemischt mit einem Adjuvans (z. B. LPS), kann als potente Impfstoff-Positivkontrolle angewendet werden.<ol>
<li>Spritzen (Nadelgröße 26-30 G) mit 60 μL der verdünnten EVs bzw. PBS füllen und sofort auf Eis legen. HINWEIS: Im Protokoll wird die Menge der injizierten EVs auf die Anzahl der EV-freisetzenden Tumorzellen normalisiert, um sowohl qualitative als auch quantitative Wirkungen von Oxaliplatin auf die Biogenese von Tumorzell-EV experimentell zu berücksichtigen. Für einige Leser kann die Normalisierung auf eine bestimmte Konzentration von produzierten Elektrofahrzeugen je nach wissenschaftlicher Fragestellung besser zu ihrem Versuchsaufbau passen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impfen Sie EVs oder PBS subkutan in den medialen Aspekt des Oberschenkels der Mäuse und wiederholen Sie die Immunisierung nach 7 Tagen. Vierzehn Tage nach der ersten Behandlung opfern Sie Mäuse, z.B. durch Zervixdislokation, um die Immunantwort zu analysieren. HINWEIS: Alternative subkutane Injektionswege können gemäß den lokalen Standards verwendet werden.</li>
</ol>3. Durchflusszytometrie-Analyse von Milz-T-Zellen
<ol><li>Bereiten Sie das komplette RPMI (cRPMI) vor und kühlen Sie es ab und ergänzen Sie RPMI-1640 mit FCS (10% v/v), Penicillin (100 Einheiten/ml), Streptomycin (100 μg/ml), L-Glutamin (2 mM) und β-Mercaptoethanol (50 μM).</li>
	<li>Sezieren Sie die Milz aus der geöffneten Bauchhöhle. Zerdrücken Sie die Milz mit einem angefeuchteten 100 μm Zellsieb und dem Kunststoffkolben einer Spritze und spülen Sie die Milzzellen in ein 50 ml Rohr mit 5-10 mL cRPMI. Bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entsorgen. HINWEIS: Halten Sie die Zellen wann immer möglich auf Eis. Um die lokale und nicht die Milzimmunantwort zu analysieren, resezieren Sie die entwässernden Popliteal- und Leistenlymphknoten nach demselben Protokoll. Überspringen Sie in diesem Fall den nächsten Schritt für die Lyse von Erythrozyten.</li>
	<li>Um Erythrozyten aus der Zellsuspension zu entfernen, resuspendieren Sie das Pellet mit 2 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Stoppen Sie dann die Reaktion, indem Sie cRPMI hinzufügen. Bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entsorgen.</li>
	<li>Für die Aussaat suspendieren Sie das Zellpellet in cRPMI und zählen Sie die Zellen, um Verdreifachungen von 200.000 Zellen mit 200 μL cRPMI in jede Vertiefung zu legen, wobei eine 96-Well-Platte mit einem U-förmigen Boden verwendet wird. 48 h bei 37 °C inkubieren. HINWEIS: Um die Antigenspezifität aktivierter T-Zellen zu adressieren, fügen Sie 1 μg / ml lösliches Ovalbumin (oder ein anderes Tumorantigen, das der untersuchten Zelllinie entspricht) hinzu oder lassen Sie es ohne zusätzlichen Reiz. Die Zugabe des immundominanten Peptidepitops SIINFEKL anstelle von Ovalbumin in voller Länge ermöglicht eine kürzere Inkubationszeit. Neben der Durchflusszytometrie können das Serum der Mäuse und der Zellkulturüberstand nach 48 h Inkubation auf verschiedene Zytokine analysiert werden.</li>
	<li>Um die intrazelluläre IFN-γ-Färbung zu verbessern, indem unter anderem die Golgi-vermittelte Sekretion von Proteinen blockiert wird, fügen Sie nach 48 h Brefeldin A (5 ng/ml), PMA (20 ng/ml) und Ionomycin (1 μg/ml) zur Zellkultur hinzu. 4 h bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Bevor Sie Oberflächenbiomarker färben, übertragen Sie Splenozyten auf eine 96-Well-Platte mit einem V-förmigen Boden und waschen Sie sie zweimal mit PBS. Fügen Sie dann fluoreszierende Antikörper hinzu, die mit dem lokal verfügbaren Durchflusszytometer kompatibel sind und gegen Oberflächenbiomarker gerichtet sind, CD3, CD8 und CD4 (siehe Materialtabelle), verdünnt 1:400, sowie einen fixierbaren Lebensfähigkeitsfarbstoff, verdünnt 1:1.000 in PBS. Pelletierte Splenozyten in der Färbelösung resuspendieren und 30 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.</li>
	<li>Zur Fixierung und Permeabilisierung von Splenozyten zweimal in FACS-Puffer (PBS plus 3% v/v FCS) waschen und dann in 100 μL Fixations-/Permeabilisierungspuffer (siehe Materialtabelle) pro Vertiefung resuspendieren. 30 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.</li>
	<li>Zur Färbung von intrazellulärem IFN-γ die Splenozyten im Fixations-/Permeabilisierungspuffer waschen und mit fluoreszierenden Antikörpern gegen IFN-γ, verdünnt 1:200 im Puffer, resuspendieren. Inkubieren Sie mindestens 1 h (bis zu einem Maximum von 12 h) bei 4 °C, lichtgeschützt.</li>
	<li>Bevor Sie die Proben mittels Durchflusszytometrie messen, waschen Sie die Splenozyten zweimal im Fixations-/Permeabilisierungspuffer und resuspendieren Sie sie im FACS-Puffer. Analysieren Sie die Aktivierung zytotoxischer T-Zellen gemäß der in Abbildung 2 dargestellten Gating-Strategie.<ol>
<li>Erstens, um einzelne Zellen zu erkennen, tupfen Sie FSC-H gegen FSC-A. Um dann lymphatische Zellen nachzuweisen, tupfen Sie SSC gegen FSC-A. Wählen Sie anschließend lebende CD3+-, CD4-, CD8+-Zellen aus und bestimmen Sie deren IFN-γ-produzierende Teilmenge, um die Aktivierung zytotoxischer T-Zellen in der Milz zu quantifizieren. HINWEIS: Fügen Sie einen FMO-Fleck (Fluorescence-minus-one) mit allen Fluorochromen außer dem gegen IFN-γ gerichteten Fluorochrom als technische Negativkontrolle hinzu.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenic+cell+death+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunogenic cell death in cancer therapy.</a> Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).</li>
<li>Kepp, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+guidelines+for+the+detection+of+immunogenic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death.</a> Oncoimmunology. 3 (9), 955691(2014).</li>
<li>Fuertes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+type+I+IFN+signals+are+required+for+antitumor+CD8%2B+T+cell+responses+through+CD8%7Balpha%7D%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 208 (10), 2005-2016 (2011).</li>
<li>Sistigu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell-autonomous+contribution+of+type+I+interferon+signaling+to+the+efficacy+of+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer cell-autonomous contribution of type I interferon signaling to the efficacy of chemotherapy.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1301-1309 (2014).</li>
<li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+human+tumours%3A+impact+on+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li>
<li>Shankaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFNgamma+and+lymphocytes+prevent+primary+tumour+development+and+shape+tumour+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity.</a> Nature. 410 (6832), 1107-1111 (2001).</li>
<li>Tesniere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenic+death+of+colon+cancer+cells+treated+with+oxaliplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin.</a> Oncogene. 29 (4), 482-491 (2010).</li>
<li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li>
<li>Zomer, A., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+extracellular+vesicle+transfer+on+cellular+heterogeneity+in+cancer%3A+What+are+the+potential+clinical+ramifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Implications of extracellular vesicle transfer on cellular heterogeneity in cancer: What are the potential clinical ramifications.</a> Cancer Research. 76 (8), 2071-2075 (2016).</li>
<li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+tumor-mediated+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Exosomes and tumor-mediated immune suppression.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1216-1223 (2016).</li>
<li>Wolfers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+exosomes+are+a+source+of+shared+tumor+rejection+antigens+for+CTL+cross-priming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming.</a> Nature Medicine. 7 (3), 297-303 (2001).</li>
<li>Zeelenberg, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor+antigens+to+secreted+membrane+vesicles+in+vivo+induces+efficient+antitumor+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses.</a> Cancer Research. 68 (4), 1228-1235 (2008).</li>
<li>Diamond, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+Shuttle+TREX1-Sensitive+IFN-Stimulatory+dsDNA+from+Irradiated+Cancer+Cells+to+DCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Exosomes Shuttle TREX1-Sensitive IFN-Stimulatory dsDNA from Irradiated Cancer Cells to DCs.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 910-920 (2018).</li>
<li>Kitai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-containing+exosomes+derived+from+cancer+cells+treated+with+topotecan+activate+a+STING-dependent+pathway+and+reinforce+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity.</a> Journal of Immunology. 198 (4), 1649-1659 (2017).</li>
<li>Heidegger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIG-I+activation+is+critical+for+responsiveness+to+checkpoint+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockade.</a> Science Immunology. 4 (39), 8943(2019).</li>
<li>Schadt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-cell-intrinsic+cGAS+expression+mediates+tumor+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cancer-cell-intrinsic cGAS expression mediates tumor immunogenicity.</a> Cell Reports. 29 (5), 1236-1248 (2019).</li>
<li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+immunization+of+a+TLR9+agonist+virus-like+particle+enhances+anti-PD1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">In situ immunization of a TLR9 agonist virus-like particle enhances anti-PD1 therapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), (2020).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).</li>
<li>Jeyaram, A., Jay, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+and+storage+stability+of+extracellular+vesicles+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Preservation and storage stability of extracellular vesicles for therapeutic applications.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 1(2017).</li>
<li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Vestad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+concentration+analyses+of+extracellular+vesicles+by+nanoparticle+tracking+analysis%3A+a+variation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087(2017).</li>
<li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11271(2017).</li>
<li>Yuana, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+extracellular+vesicles+in+fresh+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles in fresh plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Kapasi, Z. F., Murali-Krishna, K., McRae, M. L., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+generation+but+normal+maintenance+of+memory+T+cells+in+old+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Defective generation but normal maintenance of memory T cells in old mice.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1567-1573 (2002).</li>
<li>Bloom, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tyrosinase-related+protein+2+as+a+tumor+rejection+antigen+for+the+B16+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 185 (3), 453-459 (1997).</li>
<li>Patel, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+exosome+isolation+methods+using+culture+supernatant+for+optimum+yield%2C+purity+and+downstream+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 5335(2019).</li>
<li>DeGrendele, H. C., Kosfiszer, M., Estess, P., Siegelman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+activation+and+associated+primary+adhesion+is+inducible+via+T+cell+receptor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation.</a> The Journal of Immunology. 159 (6), 2549-2553 (1997).</li>
<li>Yang, S., Liu, F., Wang, Q. J., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+shedding+of+CD62L+%28L-selectin%29+regulates+the+acquisition+of+lytic+activity+in+human+tumor+reactive+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The shedding of CD62L (L-selectin) regulates the acquisition of lytic activity in human tumor reactive T lymphocytes.</a> PLoS One. 6 (7), 22530(2011).</li>
<li>Bek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+intrinsic+RIG-I+signaling+turns+melanoma+cells+into+type+I+interferon-releasing+cellular+antitumor+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Targeting intrinsic RIG-I signaling turns melanoma cells into type I interferon-releasing cellular antitumor vaccines.</a> Oncoimmunology. 8 (4), 1570779(2019).</li>
<li>Nabet, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+RNA+unshielding+couples+stromal+activation+to+pattern+recognition+receptor+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer.</a> Cell. 170 (2), 352-366 (2017).</li>
<li>Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+masters+of+intercellular+communication+and+potential+clinical+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1139-1143 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt vorliegt.

Dieses Protokoll bietet eine immunologische In-vivo-Bewertung von EVs, die aus Melanomzellen unter chemotherapieinduziertem Stress gewonnen werden, während es sich an EVs anpasst, die von verschiedenen Krebsarten unter verschiedenen Behandlungen emittiert werden. Die Immunisierung von Mäusen mit EVs, die aus Oxaliplatin-behandelten B16-OVA-Zellen gewonnen werden, erweitert beispielsweise IFN-γ-produzierende CD8+ T-Zellen in der Milz, die durch Ex-vivo-Inkubation mit Ovalbumin weiter stimulier...

Das Immunsystem spielt eine zentrale Rolle im Kampf gegen Krebs, sowohl wenn es durch Immun-Checkpoint-Hemmung angeregt wird, als auch für die Wirksamkeit konventioneller Krebstherapien. Tumorzellen, die genotoxischen Therapien wie den Chemotherapeutika Oxaliplatin und Doxorubicin oder der ionisierenden Strahlenbehandlung erliegen, können Antigene und gefahrenassoziierte molekulare Muster (DAMPs) freisetzen, die möglicherweise eine adaptive Antitumor-Immunantwort auslösen1. Zu den bekanntesten DAMPs im Zusammenhang mit dem immunogenen Zelltod gehören Find-me-Signale wie chemotaktisches ATP, Eat-Me-Signale wie die Exposition von Calreticulin, das die Aufnahme von Tumorzellen durch Antigen-präsentierende Zellen fördert, und die Freisetzung von HMGB1, das Mustererkennungsrezeptoren aktiviert und dadurch die Kreuzpräsentation von Tumorantigenen verbessert2. Darüber hinaus werden Typ-I-Interferone (IFN-I), die über tumorabgeleitete immunogene Nukleinsäuren oder andere Reize induziert werden, von dendritischen Zellen wahrgenommen, so dass sie tumorspezifische zytotoxische T-Zellen effektiv primieren können3,4. Klinisch, aktivierte und proliferierende CD8+ T-Zellen, die den Tumor infiltrieren, bieten bei vielen Krebspatienten einen unabhängigen prognostischen Faktor für ein verlängertes Überleben. IFN-γ wird aus solchen aktivierten T-Zellen freigesetzt und vermittelt direkte antiproliferative Wirkungen auf Krebszellen und treibt die Th1-Polarisation und die zytotoxische T-Zell-Differenzierung voran, wodurch es zu einer wirksamen Immunüberwachung gegen Krebs beiträgt5,6. Oxaliplatin ist ein echter immunogener Zelltodinduktor, der eine solche adaptive Immunantwort gegen Krebs vermittelt7. Die Fülle der anfänglichen immunogenen Signale, die von Tumorzellen unter therapieinduziertem Stress freigesetzt werden, muss jedoch noch vollständig enthüllt werden. Trotz erheblicher Fortschritte in der Krebsimmuntherapie bleibt die Ausweitung des Nutzens auf einen größeren Teil der Patienten eine Herausforderung. Ein detaillierteres Verständnis der immunogenen Signale, die die T-Zell-Aktivierung initiieren, könnte die Entwicklung neuartiger Therapien leiten.
Eine heterogene Gruppe von membranumschlossenen Strukturen, die als extrazelluläre Vesikel (EVs) bekannt sind, scheinen als interzelluläre Kommunikationsgeräte zu dienen. EVs, die von praktisch allen Zelltypen emittiert werden, transportieren funktionelle Proteine, RNA, DNA und andere Moleküle zu einer Empfängerzelle oder können den Funktionszustand einer Zelle verändern, indem sie einfach an Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden. Ihre biologisch aktive Fracht variiert erheblich je nach Art und Funktionszustand der erzeugenden Zelle8. In der Krebsimmunologie wurden EVs, die aus Tumorzellen freigesetzt werden, überwiegend als Gegner der Immuntherapie angesehen, da sie schließlich das invasive Wachstum fördern, metastasierende Nischen9 präformen und die Immunantwort unterdrücken10. Im Gegensatz dazu haben einige Studien gezeigt, dass EVs Tumorantigene auf dendritische Zellen übertragen können, um eine effektive Kreuzpräsentation zu ermöglichen11,12. EVs können immunstimulierende Nukleinsäuren liefern, wenn sie unter therapieinduziertem Stress entstehen, was eine Anti-Tumor-Immunantwort ermöglicht13,14. Es wurde kürzlich gezeigt, dass die Erfassung solcher RNA- und DNA-angeborenen Immunliganden in der Tumormikroumgebung die Reaktionsfähigkeit auf die Checkpoint-Blockade signifikant moduliert15,16,17. Daher muss die immunogene Rolle von EVs, die von Tumorzellen unter verschiedenen therapieinduzierten Belastungen freigesetzt werden, weiter aufgeklärt werden. Da EVs ein junges, aber wachsendes Forschungsfeld darstellen, ist die Standardisierung der Methoden noch nicht abgeschlossen. Daher ist der Austausch von Wissen unerlässlich, um die Reproduzierbarkeit der Forschung über Wechselwirkungen zwischen EVs und Krebsimmunologie zu verbessern. Vor diesem Hintergrund beschreibt dieses Manuskript ein einfaches Protokoll zur Beurteilung der immunogenen Wirkung von tumorabgeleiteten EVs in vivo.
Diese Bewertung wird durchgeführt, indem tumorabgeleitete EVs erzeugt, Empfängermäuse mit diesen EVs immunisiert und Milz-T-Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Die EV-Erzeugung erfolgt idealerweise durch die Aussaat muriner Tumorzellen in einem EV-freien Zellkulturmedium für einen hohen Reinheitsgrad. Zellen werden mit einem spezifischen Zellstressreiz wie einer Chemotherapie behandelt, um die Wirkung von therapieinduzierten EVs mit der Ausgangsimmunogenität der jeweiligen tumorabgeleiteten EVs zu vergleichen. Die Isolierung von Elektrofahrzeugen kann durchaus durch verschiedene Techniken erfolgen, die je nach In-vivo-Anwendbarkeit und lokaler Verfügbarkeit ausgewählt werden sollten. Das folgende Protokoll beschreibt einen niederschlagsbasierten Assay mit einem kommerziellen Kit zur EV-Reinigung. Mäuse werden zweimal mit diesen EVs immunisiert. Vierzehn Tage nach der ersten Injektion werden T-Zellen aus der Milz extrahiert und mittels Durchflusszytometrie auf die IFN-γ-Produktion analysiert, um eine systemische Immunantwort zu bewerten. Auf diese Weise wird das Potenzial von tumorabgeleiteten EVs, die unter verschiedenen therapeutischen Therapieschemata entstehen, relativ einfach, schnell und mit hoher Validität bewertet13. Daher eignet sich diese Methode für ein immunologisches Screening von EVs aus Krebszellen unter verschiedenen Bedingungen.

<table><tbody><tr><td>Anti-CD3 FITC</td><td>Biolegend</td><td>100204</td><td>Klon 17A2</td></tr><tr><td>Anti-CD4 PacBlue</td><td>Biolegend</td><td>100428</td><td>Klon GK1.5</td></tr><tr><td>Anti-CD8 APC</td><td>Biolegend</td><td>100712</td><td>Klon 53-6.7</td></tr><tr><td>Anti-IFN&gamma; PE</td><td>eBioscience</td><td>RM90022</td><td>Klon XMG1.2</td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Biolegend</td><td>420601</td><td>Brefeldin A Lösung (1.000x)</td></tr><tr><td>Zellsieb, 100 & Mikro; m</td><td>Greiner</td><td>542000</td><td>EASYstrainer 100 & micro; m</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium mit D-Glucose (4,5 g/L) und L-Glutamin (4 mM)</td></tr><tr><td>FBS Good Forte</td><td>PAN BIOTECH</td><td>P40-47500</td><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td></tr><tr><td>Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff eFluor 506</td><td>eBioscience, Abteilung Thermo Fischer Scientific</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>Fixierungs-/Permeabilisierungskonzentrat</td><td>eBioscience</td><td>00-5123-43</td><td>Fixierungs-/Permeabilisierungskonzentrat (10x)</td></tr><tr><td>Fixierungs-/Permeabilisierungsverdünnungsmittel</td><td>eBioscience</td><td>00-5223-56</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>407952</td><td>aus Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, &ge; 97% (HPLC)</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-032</td><td>L-Glutamin (200 mM)</td></tr><tr><td>Ovalbumin</td><td>InvivoGen</td><td>vac-pova</td><td>Ovalbumin mit < 1 EU/mg Endotoxin - CAS 9006-59-1</td></tr><tr><td>Oxaliplatin</td><td>Apotheke des MRT-Krankenhauses</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>1514-122</td><td>Mischung aus Penicillin (10.000 U/ml) und Streptomycin (10.000 ug/ml)</td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td>Phorbol 12-Myristat-13-acetat, &ge 99% (HPLC)</td></tr><tr><td>PVDF-Filter, 0,22 & Mikro; m, für Spritzen</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td>Millex-GV Filtereinheit 0,22 &micro; m Durapore PVDF Membran</td></tr><tr><td>Lysepuffer für rote Blutkörperchen</td><td>Invitrogen</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>11875</td><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium mit D-Glucose (2,00 g/L) und L-Glutamin (300 mg/L), ohne HEPES-Spritze</td></tr><tr><td>, 26 g</td><td>BD Biosciences</td><td>305501</td><td>1 mL Sub-Q Spritzen mit Nadel (0,45 mm x 12,7 mm)</td></tr><tr><td>Reagenz zur vollständigen Exosomenisolierung</td><td>Invitrogen</td><td>4478359</td><td>Zur Isolierung aus Zellkulturmedien</td></tr><tr><td>&beta; -Mercaptoethanol</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>31350</td><td>&beta; -Mercaptoethanol (50 mM)</td></tr></tbody></table>

im lebenden organismus immunogenitätsscreening von tumorabgeleiteten extrazellulären vesikeln durch durchflusszytometrie von milz-t-zellen

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Der durch Chemotherapie oder Bestrahlung verursachte immunogene Zelltod von Tumoren kann tumorspezifische T-Zell-Reaktionen auslösen, indem er gefahrenassoziierte molekulare Muster freisetzt und die Produktion von Typ-I-Interferon induziert. Immuntherapien, einschließlich der Checkpoint-Hemmung, sind in erster Linie auf bereits vorhandene tumorspezifische T-Zellen angewiesen, um eine therapeutische Wirkung zu entfalten. Daher können synergistische Therapieansätze, die den immunogenen Zelltod als intrinsischen Krebsimpfstoff nutzen, ihre Reaktionsfähigkeit verbessern. Das Spektrum immunogener Faktoren, die von Zellen unter therapieinduziertem Stress freigesetzt werden, bleibt jedoch unvollständig charakterisiert, insbesondere in Bezug auf extrazelluläre Vesikel (EVs). EVs, nanoskalige membranöse Partikel, die von praktisch allen Zellen emittiert werden, sollen die interzelluläre Kommunikation erleichtern und bei Krebs nachweislich Cross-Priming gegen Tumorantigene vermitteln. Um die immunogene Wirkung von EVs aus Tumoren unter verschiedenen Bedingungen zu beurteilen, werden anpassungsfähige, skalierbare und valide Methoden gesucht. Daher wird hierin ein relativ einfacher und robuster Ansatz zur Beurteilung der In-vivo-Immunogenität von Elektrofahrzeugen vorgestellt. Das Protokoll basiert auf der Durchflusszytometrie-Analyse von Milz-T-Zellen nach In-vivo-Immunisierung von Mäusen mit EVs, isoliert durch fällungsbasierte Assays aus Tumorzellkulturen unter Therapie oder stationären Bedingungen. Zum Beispiel zeigt diese Arbeit, dass die Oxaliplatin-Exposition von B16-OVA-murinen Melanomzellen zur Freisetzung immunogener EVs führte, die die Aktivierung tumorreaktiver zytotoxischer T-Zellen vermitteln können. Daher identifiziert das Screening von EVs durch In-vivo-Immunisierung und Durchflusszytometrie Bedingungen, unter denen immunogene EVs entstehen können. Die Identifizierung der Bedingungen der immunogenen EV-Freisetzung ist eine wesentliche Voraussetzung, um die therapeutische Wirksamkeit von EVs gegen Krebs zu testen und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu erforschen, um letztendlich neue Erkenntnisse über die Rolle von EVs in der Krebsimmunologie zu gewinnen.

Dieses Protokoll soll die einfache und leicht reproduzierbare Beurteilung der Immunogenität von tumorabgeleiteten EVs erleichtern. Dabei werden Mäuse mit EVs beimpft, die aus In-vitro-Kulturen von Tumorzellen gewonnen werden, die das Modellantigen Hühnerovalbumin (OVA) exprimieren. Die anschließende Immunantwort wird in Milz-T-Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert.
Abbildung 1 gibt einen Überblick über die praktischen Schritte des gesamt...

Dieses Manuskript beschreibt, wie die In-vivo-Immunogenität von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie beurteilt werden kann. EVs, die von Tumoren stammen, die einem behandlungsinduzierten immunogenen Zelltod unterzogen werden, scheinen in der Tumorimmunüberwachung besonders relevant zu sein. Dieses Protokoll veranschaulicht die Beurteilung von Oxaliplatin-induzierten immunstimulierenden Tumor-EVs, kann aber an verschiedene Einstellungen angepasst werden.

Im lebenden Organismus Immunogenitätsscreening von tumorabgeleiteten extrazellulären Vesikeln durch Durchflusszytometrie von Milz-T-Zellen

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Dieses Video zeigt, wie die In-vivo-Immunogenität von tumorabgeleiteten extrazellulären Vesikeln oder EVs mittels Durchflusszytometrie beurteilt werden kann. Das hierin beschriebene Screening-Verfahren ist relativ einfach durchzuführen und kann an verschiedene Einstellungen angepasst werden. Bei Krebs wird die Identifizierung von Zuständen immunogener extrazellulärer Vesikel von besonderer translationaler Relevanz freigesetzt.Daher könnten autologe Elektrofahrzeuge als personalisierte Krebsbehandlungen eingesetzt werden. Den ersten Teil des Verfahrens wird Tatiana Nedelko, eine technische Assistentin aus meinem Labor, demonstrieren. Um mit der Herstellung von Zellkulturmedien zu beginnen, die für extrazelluläre Vesikel oder EVs benötigt werden, erschöpfen Sie die Rinder-EVs in FCS-Medien durch Ultrazentrifugation bei 100.000 mal g für 24 Stunden bei 4 Grad Celsius.Entsorgen Sie das Pellet nach der Zentrifugation. Ernten Sie die murinen B16-Melanomzellen, die Ovalbumin oder B16-OVA-Zellen exprimieren, aus der Kultur und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Dann säen Sie die Zellen in einer Konzentration von 400.000 Zellen pro Milliliter in den EV-erschöpften Medien.Als nächstes behandeln Sie die B16-OVA-Zellen mit 30 Mikrogramm Oxaliplatin pro Milliliter und inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit unbehandelten Kontrollproben. Nach 24 Stunden den Überstand sammeln, um bei 400 mal g für fünf Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugieren. Entsorgen Sie das Pellet vor der Zentrifugation erneut bei 2.000 mal g für 30 Minuten bei 4 Grad Celsius.Filtern Sie nach dem Auswerfen des Pellets den Überstand durch einen 220 Nanometer großen PVDF-Membranfilter in ein frisches Rohr. Mischen Sie dann 1 Milliliter Überstand mit 0,5 Millilitern eines bestimmten kommerziell erhältlichen Exosom-Isolationsreagenzes. Wirbeln Sie vor und geben Sie die Mischung in 1,5-Milliliter-Röhrchen, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 4 Grad Celsius.Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Mischung bei 10.000 mal g für 60 Minuten bei 4 Grad Celsius. Nachdem Sie den Überstand vorsichtig entsorgt haben, entfernen Sie die verbleibenden Tropfen, indem Sie das 1,5-Milliliter-Rohr kopfüber auf ein Papiertuch klopfen und durch eine feine Pipettespitze absaugen, ohne das EV-Pellet am Boden zu berühren. Resuspendieren Sie das Pellet in kaltem PBS, indem Sie es auf und ab pipettieren, ohne das Pellet mit der Spitze zu zerkratzen.Bündeln Sie dann die EVs aus allen Röhren. Wenn Sie sie nicht sofort verwenden, lagern Sie die EV-Suspensionen bei 80 Grad Celsius in silikonisierten Gefäßen bis zu 28 Tage bis zur Anwendung. Um jede Maus in der Behandlungsgruppe mit EVs zu immunisieren, die von 4,0 x 10 bis zu den fünften B16-OVA-Zellen isoliert wurden, mischen Sie 5 Mikroliter der EV-Suspension mit 55 Mikrolitern kaltem PBS.Als nächstes füllen Sie Spritzen, die mit 26- bis 30-Gauge-Nadeln montiert sind, mit 60 Mikrolitern der verdünnten EVs oder PBS und legen Sie die Spritze dann sofort auf Eis. Impfen Sie die EVs oder PBS subkutan in den medialen Aspekt des Oberschenkels der Mäuse. Wiederholen Sie die Immunisierung nach sieben Tagen.14 Tage nach der ersten Behandlung opfern Sie die Mäuse, um die Milz zu resezieren. Dann zerdrücken Sie die resezierte Milz mit einem angefeuchteten 100-Mikrometer-Zellsieb und dem Kunststoffkolben einer Spritze. Spülen Sie die Milzzellen in ein 50-Milliliter-Rohr mit 5 bis 10 Millilitern des kühlen kompletten RPMI.Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 mal g für fünf Minuten bei 4 Grad Celsius, bevor Sie den Überstand verwerfen. Um Erythrozyten aus der Zellsuspension zu entfernen, resuspendieren und inkubieren Sie das Zellpellet mit 2 Millilitern des Lysepuffers der roten Blutkörperchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Stoppen Sie dann die Reaktion, indem Sie fünf bis 10 Milliliter vollständiges RPMI hinzufügen, gefolgt von einer Zentrifugation, wie zuvor beschrieben.Nachdem Sie das Zellpellet in vollständigem RPMI resuspendiert haben, zählen Sie die Zellen von jeder Maus und legen Sie die Triplikatoren von 200.000 Splenozykten mit 200 Mikrolitern cRPMI in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit einem U-förmigen Boden. Dann inkubieren Sie die Platten für 48 Stunden bei 37 Grad Celsius. Nach 48 Stunden behandeln Sie die Zellkultur mit 5 Nanogramm pro Milliliter Brefeldin A, 20 Nanogramm pro Milliliter PMA und 1 Mikrogramm pro Milliliter Ionomycin bei 37 Grad Celsius für 4 Stunden.Nach der Inkubation die Splenozyten auf eine 96-Well-Platte mit einem V-förmigen Boden übertragen und die Zellen zweimal mit PBS waschen. Die pelletierten Splenozyten werden in der frisch zubereiteten Färbelösung resuspendiert und die Zellsuspension 30 Minuten lang bei 4 Grad Celsius lichtgeschützt inkubiert. Zur Fixierung und Permeabilisierung die Splenozyten zweimal im FACS-Puffer waschen und dann die Splenozyten in 100 Mikrolitern pro Vertiefung der Fixations- und Permeabilisierungslösung resuspendieren, gefolgt von einer Inkubation im Dunkeln, wie zuvor erläutert.Um das intrazelluläre Interferon gamma zu färben, waschen Sie die Splenozyten im Fixations- oder Permeabilisierungspuffer, bevor Sie die Zellen mit den fluoreszierenden Antikörpern gegen Interferon gamma verdünnt 1:200 im Puffer erneut senden. Inkubieren Sie die Splenozyten für 1 bis 12 Stunden bei 4 Grad Celsius im Dunkeln. Nach gründlichem Waschen und Resuspension im FACS-Puffer analysieren Sie die Aktivierung von zytotoxischen T-Zellen gemäß der im Manuskript erläuterten Gating-Strategie.Im repräsentativen Bild ist die Gating-Strategie zur Analyse der Aktivierung zytotoxischer T-Zellen dargestellt. Die Zellen wurden als einzelne Zellen, die Lymphozyten-Untergruppe, die lebensfähigen CD3-positiven T-Zellen und die CD4-negativen CD8-positiven zytotoxischen T-Zellen eingezäunt. Die intrazelluläre Akkumulation des Interferon-Gammas wurde als Surrogatmarker für die Aktivierung bewertet.Nach der Immunisierung mit EVs aus den Tumorzellen wurde die Induktion von antigenspezifischen T-Zell-Reaktionen bei Empfängermäusen untersucht. Die tumorabgeleiteten EVs, die unter genotoxischen Stressbedingungen wie der Oxaliplatinbehandlung kultiviert wurden, induzierten im Gegensatz zu unbehandelten EVs eine starke Aktivierung der splenischen zytotoxischen T-Zellen. Die fahrzeugbehandelte Tiergruppe zeigte die geringste Reaktion.Die Aktivierung von Milz-T-Zellen wurde nach der Ex-vivo-Restimulation entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von Ovalbumin bestimmt. Die Produktion des Interferon-Gammas war erhöht, wenn die Splenozyten von Tumor-EV-behandelten Tieren vor der Analyse mit dem Modell-Tumorantigen Ovalbumin restimuliert wurden. Bitte beachten Sie, dass reproduzierbare Ergebnisse von der konstanten Isolationswirksamkeit von Elektrofahrzeugen abhängen.Stellen Sie daher sicher, dass EV-Pellets vollständig und zeitnah resuspendiert werden, um eine Austrocknung zu vermeiden. Mit diesem Protokoll konnten wir spezifische Signalwege innerhalb von Tumorzellen analysieren, die die Immunogenität von von Tumorzellen abgeleiteten EVs bestimmen. Dies könnte den Weg ebnen, um solche immunogenen EVs in der Krebsbehandlung zu nutzen.

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Research

Forschung

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Cancer Research

Krebsforschung

Generierung von T-Lymphozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) gibt einen alternativen Ansatz der Verwendung von embryonalen Stammzellen für die T-Zell-basierten Immuntherapie. Verfahren zeigt, dass durch Verwendung von...

Gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in Richtung T-Lymphozyten

Dieses Video demonstriert den Immunfang von extrazellulären Vesikeln mit fluoreszenzmarkierten Antikörper-Magnet-Nanopartikel-Konjugaten. Der Prozess umfasst die Komplexbildung, die Färbung mit fluoreszenzmarkierten Nachweisantikörpern, die magnetische Trennung und die durchflusszytometrische Analyse zur antigenen Charakterisierung.

Immuneinfang und Durchflusszytometrie extrazellulärer Vesikel zur antigenen Charakterisierung

Wir beschreiben Ganztier-Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Techniken zur Überwachung der Expansion von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen als Reaktion auf die Immunisierung mit Nanopartikeln in einem Mausmodell der Impfung.

Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, für die Erkennung von in Vivo Antigen-spezifische Tötung einer Ziel-Zelle in einem Mausmodell ermöglichen.

In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

Das Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Methode zur Verwendung mit Zelle Kultur Überstände, Oberfläche Epitope auf kleine extrazelluläre Vesikel (EV) zu erkennen. Es nutzt spezifische EV Immunopräzipitation mit Perlen mit Antikörpern, die Oberflächenantigen CD9, erkennen CD63 und CD81 gekoppelt. Die Methode ist für nachgeschaltete Flow Cytometry Analyse optimiert.

Fließen Sie durchflusszytometrischen Analyse der extrazellulären Vesikel aus Zelle konditioniertes Medien

Wir beschreiben hier einen in vivo tötenden Assay basierenden Strömungszysam, der die Untersuchung der Immunodominanz in zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) auf ein Modell-Tumor-Antigen ermöglicht. Wir stellen Beispiele dafür zur Verfügung, wie dieser elegante Test für mechanistische Studien und für die Wirksamkeit von Medikamenten eingesetzt werden kann.

Schneider In Vivo Cytotoxicity Assays zur Untersuchung von Immunodominanz in modularspezifischen CD8+ T Cell-Reaktionen

Der vorliegende Bericht hebt die chronologischen Anforderungen an die extrazelluläre Vesikel-Isolierung (EV) von Mikroglia oder Blutmakrophagen hervor. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge wurden als Regulatoren des Neuritenwachstums evaluiert, während von Blutmakrophagen abgeleitete Elektrofahrzeuge bei der Kontrolle der C6-Gliomzellinvasion in In-vitro-Assays untersucht wurden. Ziel ist es, diese EV-Funktionen als Immunvermittler in bestimmten Mikroumgebungen besser zu verstehen.

Charakterisierung von immunzellulären Vesikeln und Untersuchung der funktionellen Auswirkungen auf die Zellumgebung

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Entstehung von orthotopischen Bauchspeicheldrüsentumoren und die schnelle Verdauung von frisch isolierten murinen Bauchspeicheldrüsentumoren. Nach der Verdauung können lebensfähige Immunzellpopulationen für weitere nachgelagerte Analysen verwendet werden, einschließlich der Ex-vivo-Stimulation von T-Zellen zur intrazellulären Zytokindetektion durch Durchflusszytometrie.

Generierung von orthotopischen Pankreastumoren und Ex-vivo-Charakterisierung der tumorinfiltrierenden T-Zell-Zytotoxizität

Die neueste Generation von EV-Charakterisierungswerkzeugen ist in der Lage, eine einzelne EV-Analyse über mehrere Parameter gleichzeitig durchzuführen. Die Nano-Durchflusszytometrie misst alle biologischen Partikel größer als 45 nm ohne Markierung und identifiziert spezifische Eigenschaften von Subpopulationen durch eine Vielzahl von fluoreszierenden Markierungstechniken.

Charakterisierung einzelner extrazellulärer Vesikel-Transmembranproteine mittels Nano-Durchflusszytometrie

Das Protokoll enthält detaillierte Methoden, um zu beurteilen, ob die Nanoemulsion Ophiopogonin D Adjuvans eine effektive zelluläre Immunantwort fördert.

In vitro Bewertung der zellulären Aktivität des Nanoemulsionsimpfstoff-Adjuvans Ophiopogonin D

Wir beschreiben eine Methode, um tumorinfiltrierende Lymphozyten (TILs) von Mäusen mittels Durchflusszytometrie für den adoptiven Zelltransfer zu nutzen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die spezifische Zytotoxizität von TILs gegen Tumore in einem syngenen Pankreaskarzinom-Mausmodell zu verifizieren und Einblicke in die Entwicklung adoptiver Zelltherapien für Bauchspeicheldrüsenkrebs zu geben.

Durchflusszytometrie-basierte Isolierung und therapeutische Bewertung von tumorinfiltrierenden Lymphozyten in einem Mausmodell für Bauchspeicheldrüsenkrebs

Lernen Sie die Durchflusszytometrie zur Analyse der Immunogenität tumorabgeleiteter extrazellulärer Vesikel in Milz-T-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung immunogener EVs für personalisierte Krebstherapien.

Im lebenden Organismus Immunogenitätsscreening von tumorabgeleiteten extrazellulären Vesikeln durch Durchflusszytometrie von Milz-T-Zellen (Video) | JoVE Journal

Im lebenden Organismus Immunogenitätsscreening von tumorabgeleiteten extrazellulären Vesikeln durch Durchflusszytometrie von Milz-T-Zellen

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