Lichtinduzierte GFP-Expression in Zebrafischembryonen mit dem optogenetischen TAEL/C120-System
19. August 2021
Optogenetik ist ein leistungsfähiges Werkzeug mit vielfältigen Anwendungen. Dieses Protokoll zeigt, wie eine lichtinduzierbare Genexpression in Zebrafischembryonen mit dem blaulichtempfindlichen TAEL/C120-System erreicht werden kann.
Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es sich um eine optogenetische oder lichtaktivierte Methode zur Induktion der Genexpression in einem intakten Organismus handelt. In unserem Fall ein Zebrafisch-Embryo. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Licht als induzierendes Mittel verwendet, das eine sehr präzise, räumliche und zeitliche Kontrolle der Induktion ermöglicht.
Dieses Protokoll wäre nützlich für jede Situation, in der eine induzierbare Genexpression nützlich wäre. Dazu gehören Dinge wie Lineage Tracing, Gain-of-Function-Assays oder Rettungsexperimente. Zunächst positioniert man das LED-Panel relativ zu den Petrischalen mit Embryonen, um mehrere Embryonen gleichzeitig mit 1,5 Milliwatt pro Quadratzentimeter Lichtleistung zu versorgen.
Um das Risiko einer Fotoschädigung des Tail Transcriptional Activator zu verringern, schalten Sie das Licht in Abständen von einer Stunde mit einem Timer-Relais ein, wenn Es länger als drei Stunden leuchtet. Entfernen Sie die Deckel der Petrischale, um die Lichtstreuung durch Kondensation zu minimieren. Stellen Sie Petrischalen mit Kontrollembryonen und einer lichtdichten Box für dunkle Kontrollen auf.
Entfernen Sie Embryonen nach der gewünschten Aktivierungsdauer aus der Beleuchtung. Verwenden Sie für die vollständige RNA-Extraktion ein RNA-Extraktionskit. Die Embryonen werden in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und das überschüssige Eiwasser entfernen.
Nach Zugabe von Lysepuffer homogenisieren Sie die Embryonen mit dem Kunststoffstößel. Übertragen Sie das Lysat in eine mitgelieferte Säule und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers zur Reinigung der RNA. Lagern Sie die gereinigte RNA bei minus 20 bis minus 80 Grad Celsius bis zur Verwendung oder synthetisieren Sie cDNA sofort aus einem Mikrogramm Gesamt-RNA mit dem cDNA-Synthese-Kit, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen.
Fügen Sie ein Mikrogramm RNA in ein dünnwandiges PCR-Röhrchen mit 0,2 Millilitern hinzu, das vier Mikroliter aus fünffacher cDNA-Reaktionsmastermischung enthält, gefolgt von der Zugabe eines Mikroliters mit 20-facher Reverse-Transkriptase-Enzymlösung. Als nächstes bilden Sie ein endgültiges Volumen von 20 Mikrolitern mit nukleasefreiem Wasser. Legen Sie das Rohr in einen programmierten Thermocycler für die cDNA-Synthese.
Lagern Sie die synthetisierte cDNA bei minus 20 Grad Celsius bis zur Verwendung oder sofort zur quantitativen Beurteilung. Richten Sie die quantitativen PCR-Reaktionen ein, die einen cybergrünen Enzym-Master-Mix enthalten. Fünffach verdünnte cDNA- und GFP-Primer in 325 Nanomolarkonzentration in Triplikaten und führen die Reaktion in einer programmierten Echtzeit-PCR-Maschine durch.
Analysieren Sie nach Abschluss der Reaktion die Schmelzkurve, um die Reaktionsspezifität zu bestimmen. Berechnen Sie die lichtaktivierte Induktion als Faltenänderung relativ zu den Kontrollembryonen mit der doppelten Delta-CT-Methode. Und verwenden Sie statistische Software, um die Signifikanz zu bestimmen.
Nachdem Sie die Embryonen aus der Beleuchtung entfernt haben, immobilisieren Sie embryonen für die Bildgebung in 3% Methylcellulose mit 0,01% Tricain in Glasdepressionobjektträgern. Erfassen Sie Fluoreszenz- und Hellfeldbilder auf einem fluoreszierenden Stereomikroskop, das mit einer Digitalkamera verbunden ist, wobei die Standard-GFP-Filtereinstellungen verwendet werden. Verschmelzen Sie Hellfeld- und Fluoreszenzbilder nach der Aufnahme mit einer Bildverarbeitungssoftware.
Die Quantifizierung der GFP-Expression zeigte eine Induktion der Expression bereits 30 Minuten nach der Blaulichtexposition an. Die GFP-Expression stieg dann bis zu sechs Stunden nach der Aktivierung stetig an. Die GFP-Induktion wurde auch qualitativ bewertet, indem die Fluoreszenzintensität gleichzeitig nach der Aktivierung untersucht wurde.
GFP-Fluoreszenz über dem Hintergrundniveau wurde erstmals drei Stunden nach der Aktivierung beobachtet und wurde nach sechs Stunden nach der Aktivierung merklich heller. Im Gegensatz dazu zeigten Kontrollembryonen für alle Zeitpunkte, die im Dunkeln gehalten wurden, keine nennenswerte GFP-Fluoreszenz. Das aktivierende Licht muss im blauen Bereich des sichtbaren Lichtspektrums liegen.
Sowohl Raumlicht als auch Sonnenlicht enthalten etwas blaues Licht. Achten Sie also darauf, Ihre Negativkontrollen vor Umgebungslichtquellen zu schützen. Das TAEL C120-System ist genetisch kodiert und modular und kann die Expression jedes interessierenden Gens steuern.
In Kombination mit anderen Techniken kann es verwendet werden, um eine Reihe von biologischen Fragen zu beantworten.
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Übersicht
Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung der Optogenetik, um lichtinduzierbare Genexpression in Zebrafischembryonen zu erreichen. Das auf blaues Licht ansprechende TAEL/C120-System ermöglicht eine präzise Kontrolle der Genexpression in einem intakten Organismus.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Optogenetik
- Genexpression
- Zebrafisch-Modelle
Hintergrund
- Die Optogenetik ist eine lichtaktivierte Methode zur Induktion der Genexpression.
- Diese Technik ermöglicht räumliche und zeitliche Kontrolle der Induktion.
- Sie ist besonders nützlich für Linientracing- und Funktionsgewinn-Assays.
- Zebrafischembryonen dienen als Modell zur Untersuchung der Genexpression in vivo.
Zweck der Studie
- Eine Methode zur lichtinduzierbaren Genexpression demonstrieren.
- Ein Protokoll für Forschende bereitstellen, die an optogenetischen Anwendungen interessiert sind.
- Experimente erleichtern, die eine präzise Steuerung der Genexpression erfordern.
Verwendete Methoden
- Positionierung eines LED-Paneels relativ zu Petrischalen mit Embryonen.
- Abgabe von 1,5 Milliwatt pro Quadratzentimeter Licht.
- Induktion der Genexpression in mehreren Embryonen gleichzeitig.
- Nutzung des optogenetischen TAEL/C120-Systems zur Genkontrolle.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Induktion der Genexpression in Zebrafischembryonen.
- Nachweis räumlicher und zeitlicher Kontrolle über die Genaktivierung.
- Bereitstellung eines zuverlässigen Protokolls für zukünftige optogenetische Studien.
- Herausstellung der Vorteile der Verwendung von Licht als Induktionsagent.
Schlussfolgerungen
- Die Optogenetik bietet ein leistungsstarkes Werkzeug zur Untersuchung der Genfunktion.
- Das TAEL/C120-System ist wirksam zur Induktion der Genexpression in vivo.
- Diese Methode kann auf verschiedene biologische Forschungsszenarien angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mithilfe der optogenetischen Kontrolle der Genexpression lässt sich die räumliche und zeitliche Untersuchung biologischer Zielstrukturen in vivo präzise durchführen und unterstützt die Aufklärung von Wirkmechanismen in der frühen Entdeckungsphase. Das TAEL/C120-System bietet eine genetisch kodierbare, lichtschaltbare Plattform zur Validierung therapeutischer Hypothesen mit quantitativen Messgrößen. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem er eine umkehrbare, dosisabhängige Modulation der Genexpression in Zebrafischembryonen ermöglicht.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch induzierbare, reversible Genaktivierung in einem intakten Wirbeltiermodell.
- Operationaler Wert: Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung, indem lichtinduzierte Expression über GFP-Reporter und qRT-PCR-Quantifizierung mit phänotypischen Endpunkten verknüpft wird.
- Predictiver Wert: Erleichtert Gain-of-Function- und Rescue-Experimente, um die ausreichende Beteiligung von Zielstrukturen und die Relevanz von Signalwegen in krankheitsrelevanten Kontexten zu bewerten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt quantitative, lichtabhängige GFP-Expression, die mittels Fluoreszenzmikroskopie und qRT-PCR messbar ist, zur Verwendung in der Wirkstoff- oder Bedingungsscreening.
- Reproduzierbarkeit: Ermöglicht standardisierte Induktionsprotokolle mit definierten Lichtintensitäten (1,5 mW/cm²) und zeitlicher Kontrolle, um die Variabilität zwischen Wiederholungen zu minimieren.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit Mehrfach-Well-Formaten unter Verwendung von LED-Panelen, um mehrere Embryonen gleichzeitig unter kontrollierter Beleuchtung zu behandeln.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsmodellierung: Unterstützt auf Zebrafischen basierende präklinische Modelle, bei denen die zeitliche Kontrolle der Genexpression induzierbare therapeutische Interventionen nachahmt.
- Biomarker-Korrelation: GFP- und qRT-PCR-Ergebnisse dienen als übertragbare pharmakodynamische Messgrößen für die Aktivierung von Signalwegen und die Modulation von Zielstrukturen.
- Risikominderung: Ermöglicht die Reduzierung von Zielrisiken, indem die Notwendigkeit und Ausreichung durch induzierbare Gain-of-Function- und Rescue-Experimente vor Studien an Säugetieren getestet werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung eines Targets bis hin zur Identifizierung eines Leitwirkstoffs ein und ermöglicht die iterative Validierung molekularer Targets in einem Wirbeltiersystem.
- Entdeckungsbiochemie: Überprüft die Zielgen-Notwendigkeit und Signalwegaktivierung durch zeitlich gesteuerte, lichtinduzierte Expression in vivo.
- Screening: Liefert quantitative, normalisierte Ergebnisse (Faltungsänderung GFP) zum Vergleich genetischer oder pharmakologischer Bedingungen.
- Analytik: Verwendet die doppelte Delta-CT-qRT-PCR und Fluoreszenzintensität für den statistischen Vergleich zwischen induzierten und dunklen Kontrollen.
- Translationale Forschung: Verknüpft induzierbare Expression mit phänotypischen Ergebnissen beim Zebrafisch und unterstützt so die Übertragung in präklinische Wirksamkeitsprüfungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das modulare TAEL/C120-System kann jedes Gen des Interesses antreiben und ermöglicht die Wiederverwendung über mehrere Zielstrukturen und Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem präzise zeitliche Kontrolle über die Genexpression in einem komplexen Organismus ermöglicht wird.
- Operationaler Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Lichtzufuhr und interne Dunkelkontrollen, um Umweltvariabilität zu berücksichtigen.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem eine schnelle, reversible Modulation von Zielstrukturen ermöglicht wird, um deren phänotypische Konsequenzen zu bewerten.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem Zielstrukturen in einem physiologisch relevanten, induzierbaren System validiert werden, bevor ressourcenintensive Entwicklungsstufen eingeleitet werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Zebrafischaufzucht, Mikroinjektion und dem Aufbau optogenetischer Hardware.
- Benötigt LED-Beleuchtungssysteme, die eine präzise Steuerung der blauen Lichtintensität und -zeit ermöglichen.
- Setzt standardisierte Protokolle für die Dauer der Lichtexposition und die Aufrechterhaltung dunkler Kontrollbedingungen voraus, um die Vergleichbarkeit der Daten sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen beim Einsatz in verschiedenen embryonalen Entwicklungsstadien oder genetischen Hintergründen.
- Ist durch die Lichtdurchdringung in undurchsichtigen Geweben begrenzt, was jedoch bei Zebrafischembryonen aufgrund ihrer optischen Klarheit gemindert ist.
