Extrazellulärer Vesikelaufnahme-Assay mittels konfokaler Mikroskop-Bildgebungsanalyse

Dieses Protokoll bietet eine robuste Methodik für die Analyse von Elektrofahrzeugen auf zellulärer Ebene und einen praktischen Ansatz für eine effiziente EV-Aufnahme und EV-Tracking-Analyse. Diese Methode der EV-Kennzeichnung eliminiert die co-Fällung von Elektrofahrzeugen und Farbstoffen und verbessert so die EV-Signale. Die EV-Aufnahme wird durch volumetrische Analyse gemessen, um die internalisierten EVs von den oberflächlichen EVs zu unterscheiden.

EVs sind aktive Fracht, daher ermöglicht ihre Aufnahme den Transfer biochemischer Moleküle. Für die Forschung zur EV-basierten Arzneimittelabgabe und Krebstherapie kann diese Technik ein Bewertungsinstrument sein. Die Aufnahme von Elektrofahrzeugen spielt eine Rolle in der interzellulären Kommunikation und wird in verschiedenen Forschungsbereichen wie Krebsbiologie, Neurowissenschaften und Arzneimittelabgabe untersucht.

Dieses Protokoll ermöglicht möglicherweise einen effizienten EV-Aufnahmeassay. Zur Isolierung extrazellulärer Vesikel oder EVs wird ein Milliliter vorbearbeiteter Zellkulturmedien in die Probenkammer des nanofiltrationsbasierten mikrofluidischen Geräts injiziert. Um das Gerät zu bedienen, drehen Sie das Gerät in der Tischspinnmaschine mit 3000 U / min für 10 Minuten.

Entfernen Sie nach dem Spinnen die Flüssigkeit aus der Abfallkammer durch Pipettieren oder Ansaugen und wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal, um weitere zwei Milliliter des Zellkulturmediums zu verarbeiten. Als nächstes, um die isolierten EVs zu waschen, injizieren Sie einen Milliliter PBS in die Probenkammer und drehen Sie das Gerät in der Tischspinnmaschine. Für die immunfluoreszierende Markierung der EVs wird ein Mikrogramm pro Milliliter des EV-spezifischen Antikörpers in das Elutionsloch des Geräts injiziert, das 100 Mikroliter isolierter EVs enthält.

Dann eine Stunde im Dunkeln auf einem Plattenschüttler inkubieren, um die gleichmäßige Verteilung des Antikörpers über die Probe zu gewährleisten. Als nächstes befestigen Sie ein Klebeband am Elutionsloch. Injizieren Sie einen Milliliter PBS in die Probenkammer, um Restantikörper auszuwaschen, und drehen Sie dann das Gerät, bis die Probenkammer leer ist.

Wiederholen Sie die Wäsche, indem Sie einen weiteren Milliliter PBS in die Probenkammer injizieren und das Gerät wie zuvor gezeigt drehen. Nachdem Sie die Restflüssigkeit aus der Kammer entfernt haben, pipettieren Sie die fluoreszierend markierten EVs aus der Membrankammer in eine bernsteinfarbene Röhre oder ein Mikrorohr. Schützen Sie die Röhre bis zum Gebrauch vor Licht.

Säen Sie viermal 10 bis zur vierten PC3-Zelle in eine 35-Milliliter-Schale mit einem Milliliter-Medium. Lassen Sie die Zellen über Nacht unter optimalen Zellkulturbedingungen haften. Am nächsten Tag waschen Sie die anhaftenden Zellen zweimal mit Exosomen-depletierten Medien.

Nach dem Verdünnen der fluoreszenzmarkierten EVs auf die entsprechende Konzentration unter Verwendung exosomenarmer Medien werden die verdünnten EVs zu den adhärenten Zielzellen gegeben und für die gewünschte experimentelle Zeit inkubiert. Nachdem Sie nicht internalisierte EVs durch dreimaliges Waschen der Zellen mit exosomenfreien Medien entfernt haben, markieren Sie das Zytoplasma der anhaftenden Zellen mit einem Mikrogramm pro Milliliter CMTMR und inkubieren Sie unter optimalen Zellkulturbedingungen. Für die Lebendzellbildgebung legen Sie die vorbereiteten Zellen in den Inkubator auf der Bühne.

Nachdem Sie die Bildgebungsparameter basierend auf Kontrollproben festgelegt haben, bestimmen Sie die Tiefe der Zielzellen und den Bereich der Stapelgröße in Z-Richtung, um konfokale 3D-Bilder zu erfassen, und stellen Sie dann die Bildaufnahme auf mehrere Z-gestapelte Bilder von zellspezifischem Farbstoff und EV-spezifischem Farbstoff gleichzeitig ein. Verwenden Sie für die Bildverarbeitung eine automatische Bildverarbeitungssoftware. Um virtuelle Flächen der Zellen zu erstellen, klicken Sie auf Neue Flächen hinzufügen.

Um die virtuellen Zellenoberflächen zu konfigurieren, klicken Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen, und wählen Sie Qualität als Filtertyp aus. Schwellenwert für den entsprechenden Wert für den niedrigen Grenzwert durch visuelle Inspektion, legen Sie den Maximalwert für den oberen Grenzwert fest und klicken Sie auf die Schaltfläche Fertig stellen Weiter, um die virtuellen Punkte der EVs zu erstellen, klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Spots hinzufügen. Wählen Sie unter Algorithmuseinstellungen die Option Unterschiedliche Spotgrößen und Berechnung der kürzesten Entfernung aus, klicken Sie dann auf Weiter und wählen Sie Kanal 1 Alexa Fluor 488 als Quellkanal aus.

Geben Sie unter Punkterkennung den entsprechenden Wert für den geschätzten XY-Durchmesser ein und klicken Sie auf Weiter. Um die virtuellen EV-Punkte zu konfigurieren, klicken Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen und wählen Sie Qualität als Filtertyp aus. Legen Sie den unteren Schwellenwert für eine visuelle Inspektion fest, und klicken Sie auf Weiter Für den Typ der Punktbereiche wählen Sie Absolute Intensität und dann auf Weiter.

Um einen Schwellenwert für den Bereich der EV-Punkte festzulegen, geben Sie den entsprechenden Wert für Bereichsschwellenwert durch visuelle Inspektion ein. Wählen Sie unter Bereichsvolumen die Option Durchmesser von und klicken Sie auf Fertig stellen. Um die gruppierten Spots innerhalb der gebauten Oberfläche aufzuteilen, klicken Sie auf die Build Spots und gehen Sie zu Filter.

Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Hinzufügen , und wählen Sie Kürzeste Entfernung zu Flächen, Flächen fläche 1 als Filtertyp aus. Nachdem Sie den niedrigsten Schwellenwert für den unteren Grenzwert und den entsprechenden Wert für den oberen Grenzwert festgelegt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Abschnitt auf die neuen Spots duplizieren. Um die EVs innerhalb der Zellen automatisch zu zählen, klicken Sie auf die Auswahl Build Spots 1, gehen Sie zu Statistik und exportieren Sie den Wert aus der Gesamtzahl der Spots.

Um die Anzahl der Zellen zu ermitteln, klicken Sie auf Die erstellten Flächen 1, wechseln Sie dann zu Statistik, und exportieren Sie den Wert der Gesamtzahl der Flächen aus Gesamt. Gehen Sie schließlich zur Registerkarte Detailliert unter Statistik, um das Volume zu exportieren. EVs, die mit einem nanofiltrationsbasierten mikrofluidischen Gerät aus PC3-Zellkulturmedien isoliert wurden, wurden mit einem Fluor-4-konjugierten EV-spezifischen Antikörper markiert und mittels konfokaler 3D-Mikroskopie visualisiert.

Die internalisierten EVs wurden als puncta visualisiert und eine individuelle EV.Post-Verarbeitung dieser Bilder ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung der EV-Internalisierung in die Zellen. Die Ergebnisse des EV-Aufnahmetests deuten darauf hin, dass das Niveau der EV-Aufnahme von der Länge der Inkubationszeit abhängt. Die Anzahl der internalisierten EVs kann auf das Empfängerzellvolumen normalisiert werden, um die tatsächliche Rate der EV-Aufnahme für die angegebene Zelle zu bestimmen.

Dieses Verfahren ermöglicht den systematischen Ausschluss von nicht internalisierten Elektrofahrzeugen, um die Anzahl der internalisierten Elektrofahrzeuge genau zu messen. Die Größenverteilung der verinnerlichten EV-Punkte ist hier dargestellt. Die wichtigsten Schritte sind also die Verwendung des mikrofluidischen Geräts für die EV-Markierung, die Minimierung der Hintergrundfluoreszenz bei der Visualisierung fluoreszierender EVs und dann die Post-Imaging-Analyse zur Bestimmung von internalisierten gegenüber oberflächlichen EVs.

So kann intrazelluläres EV-Tracking in Echtzeit auf einer 3D-Ebene durchgeführt werden, und zusätzlich kann eine EV-Trafficking-Analyse auf räumlichen/zeitlichen Auflösungen und die Co-Lokalisierung von EVs mit subzellulären Organellen erreicht werden. Wir glauben daher, dass diese Technik eine einfachere und effizientere Möglichkeit bietet, EVs innerhalb der intra- und extrazellulären Matrizen für Forscher im Bereich der zellulären Kommunikation für EVs zu untersuchen.