Name: Isolierung von menschlichen Neutrophilen aus Vollblut- und Buffycoats (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Lernen Sie die Isolierung reiner, nicht-aktivierter menschlicher Neutrophilen aus Vollblut mittels Dichtegradient-Zentrifugation, Erythrozyten-Sedimentation und schonender Lyse. Diese Methode maximiert Zellviabilität und minimiert Aktivierung für zuverlässige in-vitro-Studien.

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HINWEIS: Menschliche Neutrophile wurden aus venösem Blut aus weggeworfenen Filtern weißer Blutkörperchen isoliert, die aus dem Blood Bank Lab des Boston Children's Hospital gewonnen wurden. Blutspender waren nicht identifizierbar, und es gab keine Interaktion mit lebenden Personen oder Kenntnis von identifizierbaren persönlichen Informationen. Daher wird diese Arbeit nicht als Forschung an menschlichen Probanden gemäß den HHS-Vorschriften für menschliche Probanden (45 CFR Part 46) klassifiziert. Das Boston Children's Hospital Institutional Review Board (IRB) genehmigte das Protokoll.
1. Überlagern des Farbverlaufs
<ol><li>Nach dem Sterilisieren des Buffy Coat oder der Vollblutverpackung und der Laminarhaube teilen Sie das Blut in 50 ml Röhrchen mit 10 ml Blut in jedem Röhrchen.</li>
	<li>Bringen Sie das Volumen mit 5% fetalem Rinderserum (FBS) / Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) auf bis zu 35 ml, um das Blut für einen saubereren Gradienten zu verdünnen. HINWEIS: Bei Verwendung einer Leukapheresemembran können zellen mit einer 60 ml Spritze und 30 ml 5% FBS/HBSS pro Filter ausgespült werden. Verdünnung ist unnötig, wenn mit frisch entnommenem Vollblut gearbeitet wird.</li>
	<li>Schließen Sie den 50-ml-Röhrchendeckel, mischen Sie ihn mehrmals durch Inversion und halten Sie ihn auf den Kopf gestellt, um den Boden frei von Erythrozyten zu haben.</li>
	<li>Fügen Sie 10 ml Dichtegradientenmedium (siehe Materialtabelle)direkt unter das Blut hinzu. Stellen Sie sicher, dass sich das Medium und das Blut nicht vermischen und dass die Grenzfläche scharf ist (Abbildung 1A). HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend. Stellen Sie sicher, dass die Dichtegradientenlösung bei Raumtemperatur (RT) und vor jedem Gradienten gut gemischt ist. Der erste Milliliter des Dichtegradientenmediums muss so langsam wie möglich schonend und gleichmäßig geschichtet werden. Es wird empfohlen, die elektronische Pipettengeschwindigkeit auf niedrig einzustellen.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr vorsichtig in eine Zentrifuge, ohne das Gefälle zu stören, und drehen Sie es bei RT 30 minuten lang mit 400 × g, wobei die Bremse deaktiviert ist. Beobachten Sie, wie sich der gesponnene Gradient in eine obere Serum- / Plasmaschicht, einen mittleren weißen Ring aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs), eine trübe Dichtegradientenmittelschicht und ein unteres Pellet aufteilt, das aus einem weißen, dünnen Neutrophilenband auf der Oberseite der Erythrozyten besteht (Abbildung 1B). HINWEIS: Eine trübe oder undurchsichtige Seite der Röhre nach der Zentrifugation kann darauf hindeuten, dass die Zellen (Neutrophile) aktiviert sind und möglicherweise nicht für die Verwendung geeignet sind.</li>
	<li>Entfernen Sie zuerst die PBMCs, indem Sie die Saugpipette direkt in die PBMC-Schicht einschleusen. Achten Sie darauf, es vollständig abzusaugen, während die Serum- / Plasmaschicht abnimmt, wenn der Ring entfernt wird. Schaben Sie die Seite des Rohres, an der die Zellen mit der Saugpipette pelletiert wurden, um die Entfernung des PMBC zu maximieren. Entfernen Sie vorsichtig die trübe mittlere Schicht des Dichtegradienten zwischen dem PBMC-Ring und dem Neutrophilen/RBC-Pellet. HINWEIS: Das Abkratzen der pelletierten Zellen an der Seite des Röhrchens erhöht die Reinheit der Isolierung erheblich. Achten Sie darauf, das Pellet nicht abzusaugen, da die meisten Neutrophilen direkt auf den Erythrozyten sitzen.</li>
</ol>2. Sedimentation von Erythrozyten (RBCs)
<ol><li>Mit einer 10 ml Pipette das Neutrophilen-/RBC-Pellet in ein sauberes Röhrchen geben. Nicht auf und ab pipettieren. Fügen Sie 5% FBS/HBSS zu einem Endvolumen von 25 ml hinzu. Vorsichtig durch Inversion mischen. HINWEIS: Die Durchführung der RBC-Sedimentation nach der PBMC-Entfernung verbessert die Ausbeute und verringert die Aktivierung10.</li>
	<li>25 ml vorgewärmtes (37 °C) 3% Dextran/0,9% NaCl/H2O werden direkt in das Röhrchengegeben,das das verdünnte Neutrophil/RBC-Pellet enthält, und durch Inversion vorsichtig mischen. Legen Sie das Rohr 15 Minuten lang auf eine ebene, nicht vibrierende Oberfläche (Abbildung 1C). HINWEIS: Eine längere Sedimentation reduziert die Erythrozytenkontamination, verringert aber auch die Ausbeute. Darüber hinaus kann eine längere Dextran-Exposition zu einer Neutrophilenaktivierung oder zum Zelltod führen11.</li>
	<li>Bringen Sie den Schlauch vorsichtig zurück in die Haube (zur sterilen Isolierung). Indem Sie die Pipette nur leicht in die Flüssigkeit eintauchen, sammeln Sie die oberste Schicht (~ 30 ml) und folgen der Flüssigkeitsoberfläche nach unten. HINWEIS: Wenn die Sedimentation eine scharfe Grenzfläche zwischen dem Medium und den Erythrozyten erzeugt, ist das RBC-Pellet kleiner, oder wenn eine höhere Ausbeute gewünscht wird, sammeln Sie bis zu 35 ml.</li>
	<li>Drehen Sie das Rohr (400 × g,10 min, RT, mit niedriger Bremse (3)), was zu einem roten Pellet führt, bei dem keine Partikel im Medium schwimmen.</li>
</ol>3. Analyse der verbleibenden Erythrozyten
<ol><li>Den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.</li>
	<li>25 ml steriles Reinstwasser direkt in das Röhrchen geben und vorsichtig mischen, indem Sie es für 28 s umkehren, um die Erythrozyten zu lysieren. Verwenden Sie kein Pipett, um das Pellet wieder zu versenken. HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 30 s, da längere hypotonische Zustände aktiviert werden und zum Tod von Neutrophilen führen können12.</li>
	<li>Sofort 25 ml steriles 1,8%NaCl/H2Oin das Röhrchen geben und vorsichtig durch Invertieren mischen, um die Lösung wieder in isotonische Bedingungen zu bringen. HINWEIS: Die Lösung sollte rot, aber ohne Trübung sein.</li>
	<li>Drehen Sie sich bei 200 × g für 3-5 min mit niedriger Bremse (Stufe 3), um Erythrozyten und Plättchensedimentierung zusammen mit den Neutrophilen zu minimieren (Abbildung 1D und Abbildung 2)13,14. HINWEIS: Das Pellet sollte weiß mit einer minimalen RBC-Schicht auf der Oberseite sein, die vorsichtig entfernt werden kann, während der Überstand abgesaugt wird.</li>
	<li>Resuspendieren Sie Neutrophile, indem Sie das Kulturmedium (10% FBS/RPMI1640) direkt auf das Pellet pipettieren, aber nicht auf und ab pipettieren. Rocken Sie das Rohr horizontal von einer Seite zur anderen, um die Zellaktivierung zu minimieren. HINWEIS: Zellen sollten in einer Konzentration von ~ 2 × 106 Zellen / ml gehalten werden, da eine höhere Dichte zu einer erhöhten Zellaktivierung / -tod führt15. Aus dem gleichen Grund sollte das Zellpellet so schnell wie möglich resuspendiert werden.</li>
	<li>Wenn eine Zellaggregation oder -verklumpung beobachtet wird, filtern Sie die Zellsuspension mit einem 70-μm-Netz, um verklumpte Neutrophile zu verwerfen.</li>
</ol>4. Bestimmung der Qualität der Neutrophilenisolierung
<ol><li>Färben Sie die Zellen mit Markern, die für Neutrophile (CD66b, CD11b), Eosinophile (CD193)(Abbildung 3)und einen Aktivierungsmarker wie CD62L spezifisch sind (Abbildung 4). Erwerben Sie 20.000 Zellen durch Durchflusszytometrie. Analysieren Sie die Zellreinheit und -aktivierung mit den in Abbildung 3 und Abbildung 4 vorgeschlagenen Gating-Strategien. HINWEIS: Die Qualität der Neutrophilenzubereitung kann unter Verwendung einer 3% igen Essigsäure-Methylenblau-Lösung beurteilt werden, um den einzigartigen gelappten Kern von Neutrophilen zu visualisieren.</li>
	<li>Bestimmung der Zelllebensfähigkeit mit Annexin V/Propidiumiodid (PI) (Abbildung 5). HINWEIS: Die Trypan-Blaufärbung kann verwendet werden, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewerten.</li>
</ol>

<ol><li>Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil%3A+A+cell+with+many+roles+in+inflammation+or+several+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types.</a> Frontiers in Physiology. 9, 113(2018).</li>
<li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+function%3A+from+mechanisms+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).</li>
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<li>Siemsen, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+from+nonhuman+species%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation from nonhuman species.</a> Methods in Molecular Biology. 1124, 19-37 (2014).</li>
<li>Hasenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+immunomagnetic+negative+enrichment+of+neutrophil+granulocytes+from+murine+bone+marrow+for+functional+studies+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo.</a> PLoS One. 6 (2), 17314(2011).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass die Forschung in Ermangelung eines Interessenkonflikts durchgeführt wurde.

Aufgrund der kurzen Lebensdauer, des terminalen Differenzierungsstatus und des lytischen Gehalts von Neutrophilen war die Untersuchung dieser Zellen schon immer eine Herausforderung. Neben der Verwendung von Mausmodellen oder Zellen aus Patientenkohorten sind Zelllinien nützliche Werkzeuge, um die Neutrophilenbiologie zuuntersuchen 16. Neutrophilenähnliche Zelllinien können jedoch nicht alle Aspekte der Neutrophilenbiologie vollständig wiederholen, was eine zusätzliche Schwierigkeitsschicht bei der Untersuchung dieser Zellen hinzufügt. Das am häufigsten verwendete In-vitro-Modell ist die HL-60-Zelllinie, die durch Behandlung mit Dimethylsulfoxid oder Retinsäure in neutrophile Zellen differenziert werden kann17,18. Obwohl diese Zellen bei der Untersuchung von Migration und Atemausbrüchen nützlich sind, sind sie nicht geeignet, um die mikrobiozide Aktivität von Neutrophilen zu untersuchen. Es gibt andere Zelllinien (PLB-98, NB4), und sie sind auch mit ihren Einschränkungen verbunden19. 
Es ist von entscheidender Bedeutung, Beobachtungen mit primären humanen Neutrophilen zu validieren, die mit Mauskrankheitsmodellen und Zelllinien gemacht wurden. Neutrophile können nicht effizient kryokonserviert werden und werden daher oft frisch aus Vollblut- oder Buffy-Mänteln isoliert, die von Spendern gewonnen und sofort verarbeitet werden. Einmal isoliert, beginnen die Zellen eine komplexe Form des spontanen Todes zu durchlaufen, reguliert durch Oxidation, zytoplasmatische Caspasen und Proteasen, die in neutrophilen Granula gefunden werden20,21. Unsachgemäße Isolationsmethoden oder -techniken können zur Aktivierung von Neutrophilen führen und nur den Zelltod beschleunigen. Es ist unerlässlich, eine zuverlässige und konsistente Methode zu haben, um reine und qualitativ hochwertige Neutrophile von Spendern zu erhalten. 
Es wurden viele Methoden zur Isolierung menschlicher Neutrophilen veröffentlicht10,22. Sie fallen hauptsächlich in zwei Kategorien, mit einigen gemeinsamen Strategien. Die erste Kategorie ist Antikörper-basiert, entweder durch positive oder negative Selektion. Eine positive Selektion würde Neutrophile direkt markieren und somit eine hochreine Zellpopulation liefern, obwohl sie auch zu einer schnellen Zellaktivierung, zum Zelltod sowie zur unerwünschten Markierung von Neutrophilen führt23. Negative Selektion, obwohl die Zellen nicht markiert und eine sehr reine Population ergebend, beschleunigte den Tod von Neutrophilen, obwohl der genaue Mechanismus unbekannt ist (Abbildung 5). Ob die Gen- oder Proteinexpression auch nach positiver oder negativer Selektion verändert ist, muss weiter untersucht werden. Darüber hinaus können diese Methoden aufgrund der Menge an Antikörpern, die benötigt werden, um die anderen Zelltypen zu erschöpfen, keine großen Mengen an Neutrophilen ausgeben. Antikörper-basierte Assays können jedoch immer noch für Kurzzeitkulturen und Experimente in kleinerem Maßstab verwendet werden und sind Methoden der Wahl für Experimente, die eine sehr hohe Zellreinheit erfordern, wie z. B. Gen- und Proteinexpressionsstudien. 
Die zweite Art der Isolationsmethode ist gradienten- und dichtebasiert. Es beinhaltet normalerweise Percoll, Ficoll-Paque oder andere Polysaccharid / Polyvinylpyrrolidon-Komponenten und nutzt die Zentrifugationskraft, um verschiedene Arten von Blutzellen basierend auf der Zelldichte zu trennen. Diese Methoden werden oft durch die Sedimentation der roten Blutkörperchen durch Dextran ergänzt. Diese Methoden können größere Skalen von Ausgangsmaterial verarbeiten und können auch eine hohe Reinheit erreichen. Ein Vorbehalt der dichtebasierten Isolierung ist die ineffiziente Trennung anderer weit weniger häufiger Granulozyten (meist Eosinophile) von Neutrophilen, und es ist daher die Haupteinschränkung des vorgestellten Protokolls, da selbst das Vorhandensein einer kleinzelligen Kontamination die Reaktion der Neutrophilen beeinflussen kann24.
Hier wird eine zusammengefasste Methode vorgestellt, die auf Gradientenisolation basiert und frühere Methoden10,22 verfeinert. Wir nutzen die derzeitige Unterbewertung der Neutrophilenspezifitäten, um rein menschliche Neutrophile mit begrenzten Restplättchen und Erythrozyten zuverlässig zu isolieren und so die Aktivierung von Neutrophilen und einen beschleunigten Tod zu verhindern. Der wichtigste Schritt ist die Schichtung des Gradienten, die viel effektiver erreicht wird, indem das Dichtegradientenmedium unter dem Blut hinzugefügt wird, um eine scharfe Grenzfläche zu erhalten. Eine schnelle Untersuchung des PBMC-Rings und des Gradienten nach der Zentrifugation kann mögliche Kontaminationen, Aktivierungen und geringe Ausbeuten aufdecken. Bei der Arbeit mit einer Leukapheresemembran oder einem Buffy-Mantel ist die Verdünnung des Blutes wichtig, da eine übermäßige Zelldichte zu Zellaggregation führen würde, was zu Verunreinigungen und Zellaktivierung führen würde. 
Dieses Protokoll sollte innerhalb von 2 h abgeschlossen werden, um die Zellfrische zu gewährleisten, und Schritte mit dem Dichtegradientenmedium, Dextran und der Lyse sollten sofort durchgeführt werden, da die Exposition gegenüber diesen Lösungen Neutrophile verändern kann. Mit diesem Protokoll beträgt die erwartete Ausbeute an Neutrophilen mindestens ~ 10 Millionen / 10 ml Vollblut und mindestens ~ 60 Millionen / 10 ml Buffy Coat. Die Bewertung der Isolationsqualität sollte wie folgt erfolgen: aktivierte Neutrophile sollten weniger als 10%, Lymphozytenkontamination weniger als 5%, minimal eosinophil (gleiche Seitenstreuung, aber niedrigere Vorwärtsstreupopulation) und Zelllebensfähigkeit sollte über 90% liegen. Eine geringere Reinheit kann durch unsachgemäße Schichtung oder Lagerung des Dichtegradientenmediums oder durch die Qualität und Frische des Ausgangsblutprodukts entstehen.

Das angeborene Immunsystem besteht aus vielen Zelltypen, die die Immunhomöostase und pathogene Clearance zusammen mit vielen anderen physiologischen Funktionen aufrechterhalten. Neutrophile bilden den größten Pool weißer Blutkörperchen im menschlichen Kreislauf1. Die meisten reifen Neutrophilen werden im Knochenmark gespeichert, dem Ort der Entstehung neuer Neutrophilen, auch Granulopoese genannt. Im Knochenmark verlassen Granulozytenvorläufer den Zellzyklus und differenzieren sich terminal, wobei sie ihre charakteristischen segmentierten Kerne und Granula erwerben2. Unter entzündlichen Bedingungen werden Neutrophile als Reaktion auf Chemokine, Zytokine und schadensassoziierte und pathogenassoziierte molekulare Muster aus dem Blutkreislauf und aus dem Knochenmark mobilisiert, um eine Vielzahl von Funktionen auszuführen. Dazu gehören die Zytokinsekretion, die direkte Phagozytose des Erregers, die Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies, die Degranulation antimikrobieller Proteine und die Bildung neutrophiler extrazellulärer Fallen.
Die Moleküle, die von Neutrophilen zur Bekämpfung von Infektionen verwendet werden, sind für die Mikroben und den Wirt toxisch. So sind die Lebensdauer und die richtige Entfernung von alternden / sterbenden Neutrophilen stark reguliert, und sie haben eine begrenzte Lebensdauer im Kreislauf (<48 h)3. Aufgrund dieses kurzen Überlebens produziert der menschliche Körper jeden Tag durchschnittlich 100 Milliarden neue Neutrophile, um die Homöostase der Bevölkerung aufrechtzuerhalten4. Notfall-Granulopoese kann die Freisetzung von Neutrophilen, sowohl reifen als auch unreifen, im Blut während Entzündungen und Infektionen weiter erhöhen5. Die Bedeutung von Neutrophilen in der angeborenen Immunantwort wird von Patienten mit erworbener oder angeborener Neutropenie hervorgehoben, die anfällig für bakterielle und Pilzinfektionen sind6.
Viele Herausforderungen ergeben sich beim Studium der Neutrophilenbiologie und ihrer Rolle in der Immunantwort aufgrund ihrer Natur, einschließlich ihres kurzen Überlebens und ihres zytotoxischen Gehalts. Neutrophilenähnliche Zelllinien wurden üblicherweise von humanen promyelozytären Leukämie-HL-60-Zellen und PLB-985-Zellenunterschieden 7,8. Obwohl sie eine neutrophilenartige Morphologie aufweisen und chemotaxis durchführen können, können diese Zelllinien die Biologie der Neutrophilen nicht vollständig rekapitulieren. In-vitro-Assays, die diese Zelllinien verwenden, sind auch nicht in der Lage, In-vivo-Experimente zu rekapitulieren. Darüber hinaus muss die Differenzierung dieser Zellen induziert werden und könnte durch Genmanipulation vor der Differenzierung beeinträchtigt werden.
In jüngster Zeit wurden Methoden entwickelt, um diese Probleme zu umgehen, indem induzierbare Promotoren verwendet werden, um die Genexpression nach der Differenzierung in HL-60-Zellen zu modulieren9. Selbst mit solchen Werkzeugen sind primäre menschliche PMNs erforderlich, um Ziele mit pharmakologischen Ansätzen zu validieren. Daher ist es unerlässlich, reine und inaktivierte Neutrophile zu erhalten, die aus Blut isoliert wurden, um die Ergebnisse von Zelllinien- und Tiermodellen zu validieren. Dieser Beitrag stellt ein überarbeitetes PMN-Isolationsprotokoll vor, in dem die Vor- und Nachteile aktueller Methoden bewertet wurden10. Es wurde eine Kombination entwickelt, die aus Gradientenzentrifugation zur Trennung von PMNs von anderen Immunzellen, kurzer Dextran-basierter Sedimentation zur Entfernung des Großteils der Erythrozyten, schneller Rest-Erythrozyten-Lyse über osmotischen Druck und Low-Speed-Zentrifugation zur Entfernung von Thrombozytenkontamination besteht.

<table><tbody><tr><td>3% Essigsäure mit Methylenblau-Stammzellentechnologien</td><td></td><td>#07060</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT</td><td>Invitrogen</td><td>A24858</td><td>FACS-Analysator</td></tr><tr><td>Cd11b-PE</td><td>Biolegend</td><td>301305</td><td></td></tr><tr><td>CD14-BV421</td><td>Biolegend</td><td>367144</td><td></td></tr><tr><td>CD193-BV605</td><td>Biolegend</td><td>310716</td><td></td></tr><tr><td>CD19-PerCP</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>302228</tr><tr><td>CD3-PerCP</td><td>biolegend</td><td>300326</td><td></td></tr><tr><td>CD41-APC</td><td>biolegend</td><td>303710</td><td></td></tr><tr><td>Cd45-APC</td><td>biolegend</td><td>103111</td><td></td></tr><tr><td>CD62L-PE</td><td>biolegend</td><td>304802</td><td></td></tr><tr><td>CD66b-FITC</td><td>biolegend</td><td>305103</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>22625101</td><td>Zentrifuge</td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Fisher</td><td>BP1580</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>R& D-Systeme</td><td>S11150H</td><td>Komplementinaktivierung von FBS wird empfohlen</td></tr><tr><td>FITC Annexin V Apoptose Detection Kit I</td><td>BD</td><td>556547</td><td></td></tr><tr><td>Hanks balancierte Salzlösung (-CaCl2), (-MgCl2) (-MgSO4)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td>HBSS ohne Ca2+/Mg2+ wird empfohlen&nbsp; da sie nachweislich zur Aktivierung von Neutrohpil führen</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell technologies</td><td>#07801</td><td>Dichtegradient Medium</td></tr><tr><td>MACSxpress Vollblut-Neutrophilen-Isolationskit, human</td><td>Miltenyi</td><td>130-104-434</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung, 0,4%</td><td>Thermofisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Reinstwasser</td><td>KD medical</td><td>RGF-3410</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von menschlichen neutrophilen aus vollblut- und buffycoats

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

Neutrophile (PMNs) sind die am häufigsten vorkommenden Leukozyten im menschlichen Kreislauf und reichen von 40 bis 70% der gesamten Blutleukozyten. Sie sind die ersten Zellen, die am Ort der Entzündung durch schnelle Extravasation durch Gefäße rekrutiert werden. Dort führen Neutrophile eine Reihe von Funktionen aus, um eindringende Krankheitserreger abzutöten und Immunsignale zu vermitteln. Frisch gereinigte Neutrophile aus menschlichem Blut sind das Modell der Wahl für Studien, da keine Zelllinie die PMN-Funktionen und die Biologie vollständig repliziert. Neutrophile sind jedoch kurzlebige, endständig differenzierte Zellen und sehr anfällig für die Aktivierung als Reaktion auf physikalische (Temperatur, Zentrifugationsgeschwindigkeit) und biologische (Endotoxin, Chemo- und Zytokine) Reize. Daher ist es wichtig, einer standardisierten, zuverlässigen und schnellen Methode zu folgen, um reine und nicht aktivierte Zellen zu erhalten. Dieses Protokoll stellt ein aktualisiertes Protokoll dar, das Dichtegradientenzentrifugation, Sedimentation der roten Blutkörperchen (RBC) und RBC-Lyse kombiniert, um eine hohe PMN-Reinheit zu erreichen und die Zellaktivierung zu minimieren. Darüber hinaus werden auch Methoden zur Beurteilung der Qualität, Lebensfähigkeit und Reinheit der Neutrophilisolierung diskutiert.

Bei der Verwendung des Dichtegradienten zur Reinigung von Neutrophilen ist es entscheidend, dass die Grenzfläche zwischen dem Blut und dem Dichtegradientenmedium so scharf wie möglich ist und dass nach der Zentrifugation eine deutliche Schichttrennung verbleibt (Schritt 1.4). Nach der RBC-Lyse sollte der Puffer deutlich rot und nicht trüb sein (Schritt 3.3). Wenn das Präparat trüb ist, kann eine zweite Lyserunde (Schritt 3) erforderlich sein, obwohl dies das Überleben der Neutrophilen beeinträchtigen kann (Abbildung 1). Nach der Lyse wird eine Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit (200 × g)empfohlen, wenn die Reinheit priorisiert wird, da sie die Thrombozytenkontamination erheblich reduziert. Die Hochgeschwindigkeitszentrifugation (400 × g)erhöht jedoch die Ausbeute auf Kosten der Reinheit (Schritt 3.4, Abbildung 2). Nach der Neutrophilenisolierung kann die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung zur Beurteilung der Isolationsreinheit verwendet werden (Schritt 4.1) und sollte der Mikroskopie vorgezogen werden. Obwohl die FSC/SSC-Verteilung der Zellen allein eine Schätzung der Zellisolationsqualität liefert (Abbildung 3A), sollte die Verwendung spezifischer Zellmarker bevorzugt werden. In diesem Fall werden die häufigsten kontaminierenden Zellpopulationen mit spezifischen Antikörpern zusammen mit CD66b gefärbt, die spezifisch auf Granulozyten exprimiert werden. Die CD45-Färbung wird verwendet, um Leukozyten (CD45+) und rote Blutkörperchen und Blutplättchen (CD45-) zu unterscheiden.
Andere Kontaminanten sind Lymphozyten (CD3+ oder CD19+, Abbildung 3F),Monozyten (CD14+, Abbildung 3D) und Eosinophile (CD193+, Abbildung 3G). CD11b ist ein Integrin, das auf der myeloischen Linie exprimiert wird; Neutrophile und Monozyten sind CD11b+, während Lymphozyten CD11b- sind (Abbildung 3C). Da die Neutrophilenaktivierung nachgeschaltete Experimente beeinflussen kann, sollte die Expression von CD62L bewertet werden; Neutrophile werden cd62L- sobald sie aktiviert sind (Schritt 4.1). Das Peptid fMLP kann als Positivkontrolle für die CD62L-Ausscheidung verwendet werden (Abbildung 4). Es ist auch wichtig, den Zustand von Neutrophilen vor der Durchführung von Assays zu bewerten; Neutrophile haben eine relativ kurze Halbwertszeit, und die Aktivierung kann sie weiter verkürzen (Schritt 4.2). Eine Standard-Annexin-V- und PI-Färbung kann Aufschluss über den Lebend-/Totstatus der Neutrophilenkultur zu bestimmten Zeitpunkten geben (Abbildung 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62837/62837fig01.jpg"> Abbildung 1: Dichtegradienten mittelbasierte Trennung von Granulozyten. (A) Vor und (B) nach der Zentrifugation. Beachten Sie die scharfe Grenzfläche zwischen den mittleren Schichten des Blutes und des Dichtegradienten. (C) Sedimentation des Pellets in B resuspendiert (1:1) in 5% FBS/HBSS und 3% Dextran-0,9% NaCl. ( D) PMN-Pellet nach Lyse der verbleibenden Erythrozyten im Überstand von (C) mitH2O. Abkürzungen: PBMC = periphere mononukleäre Blutzelle; PMN = Neutrophil; RBC = rote Blutkörperchen; FBS = fötales Rinderserum; HBSS = Hanks ausgewogene Salzlösung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62837/62837fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62837/62837fig02.jpg"> Abbildung 2:Das Drehen mit niedrigeren Geschwindigkeiten nach rbzerzogener Lyse verringerte die Thrombozytenkontamination. Nach der Lyse von Erythrozyten mitH2Owurden die Zellen bei 200 × g (A) oder 400 × g (B) heruntergeschüttelt. Neutrophile wurden gefärbt, und es wurde eine Durchflusszytometrie-Analyse durchgeführt, wie in Abbildung 3beschrieben, mit dem Zusatz von Anti-CD41 zur Markierung der Blutplättchen. Abkürzungen: RBC = rote Blutkörperchen; CD41 = Differenzierungscluster 41; SSC-A = seitliche Streufläche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62837/62837fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62837/62837fig03.jpg"> Abbildung 3: Beurteilung von Neutrophilen, die aus buffy coat isoliert wurden. Isolierte Neutrophile wurden nach einem Standardprotokoll mit Anti-CD66b, Anti-CD11b, Anti-CD14 und Anti-CD193 gefärbt. Einzelne Zellen (B) wurden von Gesamtzellen ( A )abgegrenzt. (C) CD11b+ Zellen wurden aus einzelnen Zellen gated. (D) Punktdiagramm mit Neutrophilen (CD66b+, CD14 niedrig/-) und einer sehr geringen Monozytenkontamination (CD66b-, CD14+, Q1). (E) CD66b- und CD66b+ Zellen wurden gated. (F) CD66b- Zellen waren positiv für Lymphozytenmarker (CD3, CD19). (G) Expression von CD11b und CD193 in CD66b+ Zellen, die unterschiedliche neutrophile (CD66b+, CD11b+, CD193-) und eosinophile (CD66b+, CD11b-, CD193+) Populationen zeigen. In dem hier gezeigten repräsentativen Ergebnis beträgt die Neutrophilenreinheit ~ 93% mit ~ 3,7% Lymphozyten und ~ 3,7% eosinophiler Kontamination. (H) Quantifizierung der Neutrophilenreinheit nach der Reinigung. Die Daten werden aus 5 Einzelstudien zusammengestellt und als Mittelwert ± SD dargestellt. Abkürzungen: CD = Cluster of Differentiation; SSC-A = SSC-A = seitliche Streufläche; FSC-A = Vorwärtsstreufläche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62837/62837fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62837/62837fig04.jpg"> Abbildung 4: Die Gradientenreinigung verursachte keine CD62L-Ausscheidung. (A-B) Kontrolle (A) oder fMLP-stimulierte Neutrophile (B) (1 mM fMLP für 15 min bei 37 °C) wurden mit Neutrophilenmarkern und CD62L gefärbt. (C) Die mittlere Fluoreszenzintensität für CD62L ist in fMLP-behandelten Zellen erniedrigt, was auf CD62L-Ausscheidung und Neutrophilenaktivierung hinweist. Abkürzungen: CD26L = L-selectin; fMLP = N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanin; SSC-A = SSC-A = seitliche Streufläche; FSC-A = Vorwärtsstreufläche; PE = Phycoerythrin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62837/62837fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62837/62837fig05.jpg"> Abbildung 5: Spontaner Tod von Neutrophilen, die durch Dichtegradienten oder Neutrophilenisolationskit gereinigt wurden. Neutrophile wurden mit Dichtegradienten (A und B) oder handelsüblichen Mikrokügelchen (C und D) gereinigt und für 0 h (A und C) oder 24 h (B und D) in RPMI-10% FCS kultiviert. Die Zellen wurden mit Annexin V und PI zu jeweiligen Zeitpunkten nach einem Standardprotokoll gefärbt. (E) Quantifizierung des gereinigten spontanen Todes von Neutrophilen. n=5, Mittelwert ± SD. Abkürzungen: SSC-A = SSC-A = seitliche Streufläche; FSC-A = Vorwärtsstreufläche; PI = Propidiumiodid; FCS = fötales Kalbserum; FITC = Fluoresceinisothiocyanat; AV5 = Anhang V. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62837/62837fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von Neutrophilen aus Vollblut, Buffy Coats oder Leukapheresemembranen, um eine gute Ausbeute, hohe Reinheit und minimale Zellaktivierung zu erreichen. Wir verwenden Gradientenreinigung, Sedimentation der roten Blutkörperchen (RBC) und RBC-Lyse, um ein hochwertiges / reines Neutrophilenpräparat zu erhalten.

Isolierung von menschlichen Neutrophilen aus Vollblut- und Buffycoats

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...

Neutrophile sind endständig differenzierte Zellen, und derzeit gibt es keine Zelllinien, um die Neutrophilenbiologie vollständig zu rekapitulieren. Daher ist es notwendig, reine, inaktivierte, gesunde und frische Neutrophile zu erhalten, um ihre Biologie zu studieren. Diese Refresh-Methode kombiniert Dichtegradient, Sedimentation, schonende Lyse, um eine reine neutrophile Zubereitung zu erhalten.Es ist einfach einzurichten, erfordert einfache Ausrüstung und wenig Übung. Der technische Aspekt, wie das Gradient Layering, dieser Methode erfordert etwas Übung, aber sobald der Gradient perfektioniert ist, sollten die anderen Schritte ein Kinderspiel sein. Beginnen Sie mit der Sterilisation des Buffy-Mantels, der Verpackung und der laminaren Kapuze.Dann fügen Sie 10 Milliliter des Blutes in ein 50 Milliliter Röhrchen hinzu. Um das Blut für einen Gradientenreiniger zu verdünnen, fügen Sie 5% FBS / HBSS hinzu und machen Sie das Volumen auf 35 Milliliter auf. Nachdem Sie den Deckel geschlossen haben, drehen Sie das Röhrchen mehrmals zum Mischen um und halten Sie das Röhrchen dann auf dem Kopf, um den Boden frei von roten Blutkörperchen zu erhalten.Fügen Sie 10 Milliliter des Dichtegradientenmediums direkt unter dem Blut hinzu, um sicherzustellen, dass sich das Medium und das Blut nicht vermischen und die Grenzfläche scharf bleibt. Drehen Sie das Rohr 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 400 g und achten Sie darauf, die Bremse zu deaktivieren. Beobachten Sie nach dem Spinnen den Gradienten, der in eine obere Serumplasmaschicht, einen mittleren weißen Ring aus peripheren mononukleären Blutzellen, eine trübe Dichtegradientenmittelschicht und ein unteres Pellet aus einem weißen, dünnen Neutrophilenband auf den roten Blutkörperchen unterteilt ist.Um PBMC zu entfernen, lassen Sie die Saugpipette direkt in die PBMC-Schicht austreten und vollständig absaugen, während die Serumplasmaschicht beim Entfernen des Rings abgenommen wird. Kratzen Sie die Seite des Rohres mit der Saugpipette ab, um die Entfernung des PBMC zu maximieren. Entfernen Sie vorsichtig die trübe Mittlere Schicht des Dichtegradienten zwischen dem PBMC-Ring und dem Neutrophilen-/RBC-Pellet.Verwenden Sie für die Erythrozytensedimentation eine 10-Milliliter-Pipette, um das Neutrophilen-/ERYTHRC-Pellet in ein sauberes Röhrchen zu überführen. Dann fügen Sie 5% FBS/HBSS zu einem Endvolumen von 25 Millilitern hinzu. 25 Milliliter der vorgewärmten Lösung, die 3%Dextran/0,9%NaCl enthält, werden direkt in das Röhrchen gegeben und durch Inversion vorsichtig vermischt.Legen Sie das Rohr für 15 Minuten auf eine nivellierte und nicht vibrierende Oberfläche. Nachdem Sie das Röhrchen wieder in die Haube gelegt haben, tauchen Sie die Pipette leicht in die Flüssigkeit ein und sammeln Sie etwa 30 Milliliter der obersten Schicht auf, die der Flüssigkeitsoberfläche nach unten folgt. Drehen Sie das Röhrchen, um ein rotes Pellet ohne schwimmende Partikel im Medium zu erhalten.Zur Lyse des verbleibenden Erythrozyten den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören. Fügen Sie 25 Millimeter steriles Reinstwasser direkt in das Röhrchen hinzu und mischen Sie es vorsichtig, indem Sie das Röhrchen 28 Sekunden lang umkehren, um das RBC zu lysieren. Dann sofort 25 Milliliter sterile 1,8% NaCl-Lösung, die in Wasser zubereitet wurde, in das Röhrchen geben und die Lösung durch sanftes Mischen wieder in isotonische Bedingungen bringen.Drehen Sie das Rohr bei 200 mal g für drei bis fünf Minuten mit einer niedrigen Bremse, um die Sedimentation von RBC und Blutplättchen mit Neutrophilen zu minimieren. Um das weiße Neutrophilenpellet wiederzuverwenden, fügen Sie das Kulturmedium direkt auf das Pellet auf, aber nicht auf und ab pipettieren. Als nächstes schaukeln Sie die Röhre horizontal von einer Seite zur anderen, um die Zellaktivierung zu minimieren.Wenn eine Zellaggregation oder -verklumpung beobachtet wird, filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Netz, um die verklumpten Neutrophilen zu verwerfen. Um die Qualität des isolierten Neutrophilenpräparats zu beurteilen, färben Sie die Zellen mit Markern, die für Neutrophile, Eosinophile und einen Aktivierungsmarker spezifisch sind. Nach dem Erwerb von 20.000 Zellen mittels Durchflusszytometrie analysieren Sie die Zellreinheit und -aktivierung unter Verwendung der Gating-Strategien und bestimmen die Zelllebensfähigkeit mit Annexin V/Propidiumiodid, wie im Textmanuskript beschrieben.Der Dichtegradient mit einer niedrigen Geschwindigkeit ergab Neutrophile mit mehr Reinheit, während eine hohe Geschwindigkeit zu einer erhöhten Ausbeute auf Kosten der Reinheit führte. Unter Verwendung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung lieferte allein die Zellverteilung eine Schätzung der Zellisolationsqualität, wobei die Verwendung spezifischer Zellmarker bevorzugt werden sollte. Die identifizierten kontaminierenden Zellpopulationen waren Monozyten, Lymphozyten und Eosinophile.Die enorme Neutrophilenausbeute wurde mit diesem Protokoll erreicht. Die Expression von CD62L wurde beurteilt. Die mittlere Fluoreszenzintensität für CD62L war in den Positivkontrollzellen erniedrigt, was auf CD62L-Ausscheidung und Neutrophilenaktivierung hinweist.Die Gesundheit der Neutrophilen sollte vor der Durchführung des Assays beurteilt werden, da die Neutrophilen eine relativ kurze Halbwertszeit haben und die Aktivierung die Lebensdauer weiter verkürzt. Nach der Neutrophilenreinigung unter Verwendung des Dichtegradienten und kommerzieller Mikrokügelchen wurden die Zellen 24 Stunden lang kultiviert und das Zellüberleben mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Quantifizierung lebensfähiger Zellen zeigte, dass die Dichtegradientenreinigung nach 24 Stunden zu lebensfähigeren Zellen führte als die Aufreinigung mit einem Kit.Es ist wichtig, dass die Gradientenschichtungs- und Zentrifugationsschritte so gut wie möglich durchgeführt werden, da dies die Qualität der Zubereitung stark beeinträchtigt. In-vitro-Experimente und biochemische Assays können nach diesem Verfahren durchgeführt werden. Auch könnte eine negative Selektion durchgeführt werden, wenn hochreine Zellen benötigt werden, wie in Zytokin- und Proteinexpressionsexperimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Neutrophile Granulozyten gehören zu den ersten Zellen, die auf dem Gelände der entzündlichen Immunantwort kommen, und ihre Funktionen und Mechanismen wurden ausführlich in vitro untersucht. Wir zeigen eine Standard-Dichtegradienten Trennverfahren für die menschliche Neutrophile aus dem Vollblut unter Verwendung kommerziell erhältlicher Trennmedien isolieren.

Neutrophile Isolation Protocol

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes, PBMCs, die Monozyten und Lymphozyten enthalten, aus einem menschlichen Buffy-Coat durch Dichtegradientenzentrifugation. Die isolierten PBMCs können für weitere Analysen verwendet werden.

Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes aus menschlichen Buffy Coats

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von zytotoxischen Neutrophilen hoher Dichte und Neutrophilen niedriger Dichte aus dem Blut einer tumortragenden Maus durch diskontinuierliche Saccharosegradientenzentrifugation.

Isolierung von zytotoxischen Neutrophilen aus tumortragendem Mausblut

Im folgenden Protokoll beschreiben wir eine sehr einfache Möglichkeit, Neutrophil Extracellular Traps (NETs) aus humanem Vollblut unter Verwendung leicht verfügbarer Reagenzien zu isolieren. Dann zeigt, wie die isolierten Netze können in einem in vitro-Adhäsionstest mit Krebszellen verwendet werden.

Vereinfachte Menschen Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolierung und Handhabung

Neutrophile spielen nicht nur eine wichtige Rolle bei der Abwehr des Wirts gegen eindringende Mikroorganismen, sondern sind auch an der Immunüberwachung von Tumorzellen beteiligt. Hier beschreiben wir Techniken im Zusammenhang mit der Isolierung von Neutrophilen mit Anti-Tumor-Eigenschaften und Methoden zur Überwachung der Funktion von Anti-Tumor-Neutrophilen in vitro und in vivo.

Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen mit Anti-Tumor-Eigenschaften

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommende Art von weißen Blutkörperchen. Die Isolierung von Neutrophilen aus menschlichem Blut durch die Dichtegradiententrennungsmethode und die Differenzierung von humanen promyelozytären (HL60) Zellen entlang des granulozytären Weges werden hier beschrieben; ihre Rolle bei der Empfindlichkeit von Lymphomzellen gegenüber Anti-Lymphom-Wirkstoffen zu testen.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Wir beschreiben hier ein Verfahren zum Erhalt und eine neu charakterisierte Subpopulation von Neutrophilen stammRiesenFressZellen zu identifizieren. Diese Zellen entwickeln sich in Kultur aus frischem menschlichem Blut Neutrophilen und werden durch Phagozytose, Autophagie, ungeheuer groß, und längere Lebensdauer aus. Diese Methode ist wesentlich zur Weiterentwicklung dieses einzigartigen Neutrophilen stamm Subpopulation untersuchen.

Entwicklung und Identifizierung eines neuen Subpopulation von humanen neutrophilen abgeleiteten Riesen Phagozyten In Vitro

Diese Forschung skizziert zwei Techniken zur Isolierung reichlich neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) aus dem Knochenmark von Ratten. Eine Methode kombiniert ein kommerzielles Neutrophilen-Isolationskit mit einer Dichtegradientenzentrifugation, während die andere nur eine Dichtegradientenzentrifugation verwendet. Beide Ansätze liefern funktionelle NETs, die die von peripheren Blutneutrophilen übertreffen.

Einzigartiger Ansatz zur Isolierung von Neutrophilen im Knochenmark von Ratten mit vergleichbarer Kapazität

Dieses Protokoll beschreibt eine automatisierungskompatible Methode mit hohem Durchsatz zur Isolierung von mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes für Biobanking und andere Zwecke.

Isolierung von mononukleären Zellen des humanen peripheren Blutes aus Buffy Coats durch immunmagnetische Hochdurchsatz-Bead-Trennung

Hier bieten wir einen zuverlässigen Ansatz für die Isolierung von Neutrophilen niedriger und normaler Dichte aus Vollblut mittels magnetischer Isolierung (negative Selektion) und diskontinuierlichem Dichtegradientenmedium. Es gewährleistet die unberührte Isolierung hochreiner Zellen (≥93%) und ermöglicht eine genaue nachgelagerte Analyse von Neutrophilen-Subpopulationen, die für das Verständnis ihrer Rolle bei Gesundheit und Krankheit entscheidend ist.

Die Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen niedriger und normaler Dichte aus Vollblut

Neutrophile niedriger Dichte (LDN) nehmen bei mehreren Krankheiten signifikant zu. LDN werden in der Regel durch Zellsortierung isoliert. Wir stellen eine praktische Methode vor, um reines und lebensfähiges LDN zu erhalten. Nach der Dichtegradientenzentrifugation von peripherem Blut werden die Zellen mit magnetischen Mikrokügelchen inkubiert und dann LDN durch magnetische Säulen getrennt.

Schnelle magnetische Mikrobead-Methode zur effizienten Aufreinigung von Neutrophilen niedriger Dichte

Lernen Sie die Isolierung reiner, nicht-aktivierter menschlicher Neutrophilen aus Vollblut mittels Dichtegradient-Zentrifugation, Erythrozyten-Sedimentation und schonender Lyse. Diese Methode maximiert Zellviabilität und minimiert Aktivierung für zuverlässige in-vitro-Studien.

Isolierung von menschlichen Neutrophilen aus Vollblut- und Buffycoats

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