Name: Ein automatisiertes Kultursystem zur präklinischen Erprobung wirtsgerichteter Therapien für Tuberkulose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Erfahren Sie ein automatisiertes Kultursystem zur quantitativen Erfassung von Mycobacterium tuberculosis in Makrophagen. Diese farbimetrische Methode ermöglicht die schnelle Screening-Prüfung zugelassener Arzneimittel als wirtsgerichtete Therapien gegen Tuberkulose.

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Diese Arbeit wurde von der Science Foundation Ireland (SFI 08/RFP/BMT1689), dem Health Research Board in Irland [HRA-POR/2012/4 und HRA-POR-2015-1145] und dem Royal City of Dublin Hospital Trust finanziert.

Die in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden mit dem abgeschwächten H37Ra-Stamm von Mtb durchgeführt, der in einem Containment Level 2-Labor gehandhabt werden kann. Alle Manipulationen an lebenden Mykobakterien wurden in einer biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II (BSC) durchgeführt. Experimentelle Verfahren wurden entwickelt, um die Erzeugung von Aerosolen zu minimieren. Eukaryotische Zellkultur (THP-1-Zellen) wurde ebenfalls in einer BSC der Klasse II durchgeführt. Das Labor führte eine Risikobewertung durch und stellte sicher, dass alle Verfahren in Übereinstimmung mit den institutionellen und nationalen biologischen Sicherheitsvorschriften durchgeführt wurden. Die humane monozytäre THP-1-Zelllinie wurde verwendet, um die Methode wie beschrieben durchzuführen (Schritt 1). Die Zellen werden nach Stimulation mit Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) vor der Infektion mit Mykobakterien in Makrophagen differenziert.
1. Zellkultur
<ol><li>Vermehrung von H37Ra-Samen in die Log-Phase in Middlebrook 7H9 (MB) Brühe, ergänzt mit Albumin-Dextrose-Katalase (ADC) Anreicherung (10%) und 0,05% Polysorbat 80. Lagern Sie H37Ra-Vorräte in 1 ml Aliquots in einem -80 °C Gefrierschrank für bis zu 1 Jahr.</li>
	<li>Eine 1-ml-Durchstechflasche mit Mtb-H37Ra auftauen und etwa 1 Woche vor dem geplanten Experiment in einen T25-Kolben mit einer Filterkappe mit 9 ml MB-ergänzter Brühe geben. Inkubieren Sie bei 37 °C für 5-7 Tage in einem statischen Inkubator.</li>
	<li>THP-1-Zellen in RPMI-1640, ergänzt mit nicht hitzeabgetötetem 10% fetalem Kälberserum (vollständig (c)RPMI) in einem T75-Kolben in einemCO2-befeuchteten Inkubator bei 5% CO2/37 °C und Subkultur zweimal pro Woche, um eine Dichte von weniger als 1 x 106 Zellen/ml aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Differenzieren Sie THP-1-Zellen 3 Tage vor der Infektion in Makrophagen, indem Sie die Zellen mehrmals mit einer serologischen Pipette in T75-Kolben vorsichtig pipettieren, um Klumpen zu dispergieren und in ein 50-ml-konisches Röhrchen zu legen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur, dekantieren Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 2 ml RPMI. Führen Sie die Zellzählung durch, um die Zellen / ml zu schätzen.</li>
	<li>Saatgut 2 ml THP-1-Makrophagen in 12-Well-Gewebekulturplatten bei einer Dichte von 100.000 Zellen/ml in cRPMI mit 100 ng/ml PMA für 72 h. Entfernen Sie PMA-haltiges Medium aus den Zellen und füllen Sie es vor der MTB-Infektion mit frischem cRPMI auf.</li>
	<li>Richten Sie individuelle Platten für jeden gewünschten Zeitpunkt ein.</li>
	<li>Samenzellen mit der gleichen Dichte (100.000 Zellen / ml) in 2-Well-Glaskammerobjektträgern, um die Multiplizität der Infektion (MOI) zu bestimmen.</li>
	<li>In einen 5%CO2 befeuchteten Inkubator für 3 Tage bei 37 °C geben.</li>
</ol>2. Quantifizierung der MTB-Aufnahme
<ol><li>Bestimmung der Mtb-Aufnahme durch Makrophagen (MOI)
	<ol><li>Richten Sie die biologische Sicherheitswerkbank der Klasse II (BSC) am Tag der Infektion ein und arbeiten Sie an zwei Schichten Seidenpapier, um verschüttete Flüssigkeiten aufzufangen. Stellen Sie Abfallentsorgungsbehälter gemäß den örtlichen Vorschriften auf.</li>
		<li>Aus dem T25-Kolben werden 6-8 ml Mykobakterienkultur entnommen und in ein 15-ml-Polypropylenröhrchen überführt. HINWEIS: Röhrchen mit kleinerem Volumen können für kleinere Experimente verwendet werden.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Röhrchen in einer Tischzentrifuge bei Raumtemperatur für 10 min bei 2890 x g.</li>
		<li>Nehmen Sie das Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge und bringen Sie es in die biologische Sicherheitswerkbank. Warten Sie 1 Min., damit sich die Bakterien ansiedeln können.<ol><li>Gießen Sie den Überstand in den Desinfektionsmittel-Entsorgungsbehälter, verschließen Sie das Röhrchen und resuspendieren Sie die Bakterien im verbleibenden Medium, indem Sie auf die Seite des Röhrchens klopfen. Warten Sie 1 Min., damit sich die Bakterien ansiedeln können.</li>
		</ol></li>
		<li>Fügen Sie 2 ml vorgewärmtes cRPMI hinzu, mischen Sie vorsichtig und geben Sie es in ein 50-ml-konisches Röhrchen.</li>
		<li>Resuspendieren Sie die Mykobakterien sehr vorsichtig mit einer 25 G Nadel und 5 ml Spritze. Um sie zu resuspendieren, ziehen Sie die Mykobakteriensuspension in die Spritze und werfen Sie sie sehr vorsichtig an der Seitenwand des Röhrchens aus, um die Aerosolproduktion zu minimieren. Wiederholen Sie 6-8 mal. HINWEIS: Seien Sie äußerste Vorsicht, da es sich um eine hochdichte Kultur von Mykobakterien handelt. Um das Risiko einer Nadelstichverletzung zu vermeiden, verwenden Sie, wenn möglich, stumpfe Nadeln und Luer-Lock-Spritzen.</li>
		<li>Entsorgen Sie die Nadel und die Spritze in einem scharfen Behälter im BSC.</li>
		<li>Die Suspension in ein 2-ml-Mikrofugenröhrchen (mit Schraubverschluss) geben und bei Raumtemperatur 3 min bei 100 x g zentrifugieren, um verbleibende Klumpen zu pelletieren. Bringen Sie das Röhrchen in die Sicherheitswerkbank zurück und warten Sie 1 Min., bis sich die Bakterien ansiedeln können.</li>
		<li>Übertragen Sie die oberen 1-1,5 mL des Überstands in ein neues Röhrchen. Entsorgen Sie das Originalrohr im Abfalleimer mit Desinfektionsmittel. Gut mischen und verschiedene Mengen der mykobakteriellen Suspension (z. B. 5, 25, 50, 150 μL) in die 2-Well-Glaskammerobjektträger geben und 3 h in einem CO2-Inkubator bei 37 °C inkubieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Färbung für säurefeste Bakterien (AFB) HINWEIS: Nach 3 h Inkubation werden die Makrophagen gewaschen und mit Paraformaldehyd fixiert, um Mykobakterien zu inaktivieren. Die Objektträger werden dann mit einem modifizierten Auramine O-Kit (siehe Materialtabelle) gefärbt, um die Phagozytosierung von Mykobakterien pro Zelle zu schätzen. Aufgrund ihrer wachsartigen Zellwand behalten Mykobakterien den Auramin-Farbstoff nach einer Säure-Alkohol-Wäsche. Die Makrophagenkerne werden dann mit Hoechst gegengefärbt. Diese Methode ermöglicht es, die Anzahl der phagozytierten Bakterien pro Zelle zu zählen und wird verwendet, um die Multiplizität der Infektion (MOI) der Makrophagen zu bestimmen.<ol><li>Entfernen Sie das Medium aus dem Glaskammerobjektträger, nachdem Sie dreimal auf und ab pipettiert haben, um Bakterien zu entfernen, die nicht phagozytiert wurden.</li>
		<li>Einmal mit 2 mL PBS bei Raumtemperatur waschen.</li>
		<li>Lagerbestände von 4% Paraformaldehyd, gelöst in PBS in Aliquoten bei -20 °C für bis zu 6 Monate. Ein Aliquot von 4% Paraformaldehyd unmittelbar vor Gebrauch auftauen. Mit PBS auf 2% Paraformaldehyd verdünnen und 2 ml pro Vertiefung hinzufügen.</li>
		<li>10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Der Glaskammerobjektträger kann in dieser Phase zur Färbung aus der Sicherheitswerkbank entnommen werden.</li>
		<li>Waschen Sie die Rutsche unter einem sanften Leitungswasserstrahl.</li>
		<li>Geben Sie genügend Auramin auf den Objektträger, um die Zellen mit einer Kunststofftransferpipette abzudecken, und inkubieren Sie für 1 min bei Raumtemperatur im Dunkeln (Abdeckung mit Aluminiumfolie).</li>
		<li>Waschen Sie überschüssigen Farbstoff mit Leitungswasser vom Objektträger und fügen Sie den Entfärbungsmittel / Quencher für 1 min im Dunkeln hinzu.</li>
		<li>Den Überschuss mit Leitungswasser abwaschen und 15 min bei Raumtemperatur mit Hoechst 33342 (10 μg/ml in PBS) im Dunkeln inkubieren.</li>
		<li>Den Hoechst-Fleck mit Leitungswasser abwaschen, die Kammern entfernen, überschüssiges Wasser vom Objektträger ablassen, einen Tropfen Antifade und Deckglas hinzufügen und an der Luft trocknen.</li>
		<li>Untersuchen Sie den Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop mit dem 100-fachen Ölobjektiv. Mykobakterien fluoreszieren unter dem FITC-Filter grün. Die Kerne fluoreszieren blau unter dem DAPI-Filter (Abbildung 1C).</li>
		<li>Bestimmen Sie das MOI, indem Sie die Anzahl der pro Zelle phagozytierten Mykobakterien und den Prozentsatz der infizierten Zellen zählen.</li>
		<li>Berechnen Sie das Volumen der mykobakteriellen Suspension, die benötigt wird, um die erforderliche MOI basierend auf der Oberfläche einer Vertiefung in der Platte zu erreichen. Zum Beispiel beträgt die Oberfläche der in diesem Experiment verwendeten Glaskammerobjektträger 4 cm2. Ein niedriger MOI (ca. 1-2 Bazillen/Zelle) ist wünschenswert für Experimente, die über mehrere Tage (z.B. 5 Tage) durchgeführt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Infektion von Makrophagen
	<ol><li>Mischen Sie die Mykobakteriensuspension gut und fügen Sie den Zellen die benötigte Menge auf 12-Well-Platten hinzu, sobald das Volumen bestimmt wurde, das erforderlich ist, um den gewünschten MOI zu erreichen.</li>
		<li>Bei 37 °C für 3 h inkubieren, damit Mykobakterien phagozytiert werden können.</li>
		<li>Entfernen Sie extrazelluläre Bakterien, indem Sie die Vertiefungen mehrmals mit warmem RPMI oder HBSS waschen.</li>
		<li>Lysieren Sie die Makrophagen in einer Vertiefung (3-Stunden-Probe), um die prozentuale Zeit bis zur Positivität (TTP) des ursprünglichen Inokulums (3-Stunden-Probe) zu bestimmen, wie in Schritt 3 unten beschrieben.</li>
		<li>Frisches cRPMI und die erforderlichen Medikamentendosen oder Vehikelkontrolle in die verbleibenden Vertiefungen geben, die Platten imCO2-Inkubator bei 37 °C für die erforderliche Zeit inkubieren (abhängig vom Versuchsplan, aber in der Regel in mehreren Abständen zwischen 1 und 8 Tagen).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Entnahme von Proben für das Flüssigkultur-Detektionssystem
HINWEIS: Am Tag der Infektion werden extrazelluläre Mykobakterien durch Waschen entfernt, und intrazelluläre Mykobakterien werden durch Lyse einer Vertiefung von Makrophagen (3 h Probe) geerntet, um die anfängliche Menge zu bestimmen, die als Ausgangskontrolle für die Infektion phagozytiert wird. Zu folgenden Zeiten werden sowohl das Medium, das Zelllysat als auch die Waschungen kombiniert, um das gesamte mykobakterielle Wachstum zu messen. Extrazelluläres und intrazelluläres Wachstum können auf Wunsch auch getrennt beurteilt werden.
<ol><li>Entnahme einer 3-stündigen Probe zur Bestimmung der TTP
	<ol><li>Nach den ersten 3 Stunden der Infektion werden extrazelluläre Mykobakterien aus allen Vertiefungen abgewaschen, wie in Schritt 2.3.3 beschrieben. Fügen Sie 1 ml frische Medien in die 3-Stunden-Kontrollmulde hinzu, um das Lysatvolumen mit denen späterer Zeitpunkte auszugleichen. HINWEIS: Siehe Schritt 3.2.7, wenn extrazelluläre Mykobakterien von der Analyse ausgeschlossen werden sollen.</li>
	</ol></li>
	<li>Musterkollektion
	<ol><li>Warme MB-Brühe und Instrumentenkulturflaschen, um sie auf Raumtemperatur zu bringen.</li>
		<li>Überführen Sie das Medium von der 12-Well-Platte in die entsprechenden beschrifteten konischen Rohre.</li>
		<li>500 μL steriler Lysepuffer (0,1% Triton x-100 in PBS, gefiltert durch einen sterilen 0,2 μm Filter) für 10 min in jede Vertiefung geben.</li>
		<li>Die Zellen vorsichtig mit einem sterilen Schaber aus dem Vertiefung abkratzen und mit dem Medium im entsprechenden konischen Röhrchen verbinden.</li>
		<li>Waschen Sie die Vertiefung mit 0,5 ml sterilem PBS und geben Sie sie in das entsprechende Röhrchen.</li>
		<li>Führen Sie jede Probe 6-8 Mal vorsichtig durch eine Nadel und Spritze (25 G), um die Klumpen aufzubrechen. Verdünnte Proben 1:10 in MB-Brühe; 100 μL Probe + 900 μL MB Medium.</li>
		<li>Zu den erforderlichen Zeiten/Tagen (in der Regel zwischen 1 und 8 Tagen) werden die restlichen Proben mit den Schritten 3.2.1-3.2.6 entnommen. HINWEIS: Forscher ziehen es möglicherweise vor, extrazelluläre Mykobakterien von ihrer Analyse auszuschließen, in diesem Fall wird in Schritt 3.2.2 oben das Medium aus jeder Vertiefung verworfen und Makrophagen werden mehrmals gewaschen, bevor Lysepuffer hinzugefügt wird.</li>
	</ol></li>
	<li>Beimpfung und Beladung von Instrumentenkulturflaschen HINWEIS: Details zum Flüssigkulturgerät und den zugehörigen Verbrauchsmaterialien finden Sie in der Materialtabelle.<ol><li>Sterilisieren Sie den Gummiverschluss der Instrumentenkulturflasche mit Seidenpapier, das mit 70% Alkohol getränkt ist, und lassen Sie es an der Luft trocknen. HINWEIS: Dieser Schritt muss im BSC durchgeführt werden.</li>
		<li>Bereiten Sie die Flaschen vor, indem Sie genügend Nährstoffergänzungen für alle Proben in ein konisches Röhrchen (0,5 ml / Flasche) geben. Verwenden Sie eine Nadel und eine Spritze, um 0,5 ml Nährstoffergänzung in die Instrumentenkulturflasche zu injizieren.</li>
		<li>500 μL der verdünnten Probe (1:10) werden in ein 1 ml V-Bodenröhrchen pipettiert.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Nadel und eine Spritze, um die 500 μL Probe in die zugewiesene Instrumentenkulturflasche zu injizieren.</li>
		<li>Sterilisieren Sie den Gummiverschluss der Instrumentenkulturflasche mit Seidenpapier, das mit 70% Alkohol getränkt ist, und lassen Sie es an der Luft trocknen. Wischen Sie die Flaschen mit Seidenpapier ab, das mit 70% Alkohol getränkt ist, bevor Sie sie aus dem BSC entfernen.</li>
		<li>Transportieren Sie die Flaschen vorsichtig von der Biosicherheitswerkbank zum Beladungsinstrument.</li>
		<li>Drücken Sie die Ladetaste am automatisierten mikrobiellen Detektionssystem.</li>
		<li>Scannen Sie die Barcodes auf Instrumentenkulturflaschen und legen Sie die Flaschen bis zu 42 Tage lang bei 37 °C in den Inkubator des Detektionssystems. Lesen und notieren Sie die Zeit, die benötigt wird, um eine Positivität vom Instrumentenbildschirm aus zu erreichen. HINWEIS: Der Barcode ermöglicht es dem Gerät, die Flasche zu identifizieren und Reflexionswerte mit einer bestimmten Flasche zu verknüpfen.</li>
		<li>Berechnen Sie die prozentuale Zeit bis zur Positivität (TTP), indem Sie die TTP des anfänglichen intrazellulären Inokulums (Tag 0) mit der von Makrophagen vergleichen, die für die angegebenen Zeiten kultiviert wurden. Eine positive Veränderung des prozentualen TTP bedeutet mykobakterielles Wachstum13. Zum Beispiel für Tag 3: Prozentuale Veränderung der Zeit bis zur Positivität = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62838/62838eq01.jpg"></li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Bowness, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+Mycobacterium+tuberculosis+MGIT+time+to+positivity+and+cfu+in+sputum+samples+demonstrates+changing+bacterial+phenotypes+potentially+reflecting+the+impact+of+chemotherapy+on+critical+sub-populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">The relationship between Mycobacterium tuberculosis MGIT time to positivity and cfu in sputum samples demonstrates changing bacterial phenotypes potentially reflecting the impact of chemotherapy on critical sub-populations.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (2), 448-455 (2015).</li>
<li>Basu Roy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+auto-luminescent+fluorescent+BCG+whole+blood+assay+to+enable+evaluation+of+paediatric+mycobacterial+responses+using+minimal+blood+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">An auto-luminescent fluorescent BCG whole blood assay to enable evaluation of paediatric mycobacterial responses using minimal blood volumes.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 151(2019).</li>
<li>Christophe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+identifies+decaprenyl-phosphoribose+2%27+epimerase+as+a+target+for+intracellular+antimycobacterial+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), 1000645(2009).</li>
<li>Franzblau, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+methods+used+for+the+evaluation+of+compounds+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis.</a> Tuberculosis. 92 (6), Edinburgh. 453-488 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Autoren haben die in diesem Protokoll beschriebene Flüssigkulturmethode verwendet, um das Mtb-Wachstum in Monozyten-abgeleiteten Makrophagen und Alveolarmakrophagen und THP-1-Zellen zu überwachen, die mit PMA11,16,17 differenziert sind. Diese Technik kann auch für die Verwendung mit nicht adhärenten Zellenmodifiziert werden 12. In jüngerer Zeit wurde das Instrument auch in präklinischen Studien verwen...

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), der Erreger der Tuberkulose, war 2019 weltweit der bedeutendste Killer für Infektionskrankheiten1. Um der Abwehr des Wirts zu entgehen, untergräbt Mtb die mykobakterizide Aktivität von angeborenen Immunzellen wie Makrophagen und dendritischen Zellen (DCs), so dass es intrazellulär persistieren und replizierenkann 2. Das Fehlen eines wirksamen Impfstoffs zur Vorbeugung der Lungentuberkulose bei Erwachsenen und das zunehmende Auftreten arzneimittelresistenter Stämme unterstreichen den dringenden Bedarf an neuen Therapien.
Adjunktive wirtsgerichtete Therapien (HDT) könnten die Behandlungszeit verkürzen und helfen, Resistenzen zu überwinden3. Die präklinische Bewertung von HDT-Kandidaten in vitro zur Bestimmung der mykobakteriziden Aktivität in Makrophagen beruht häufig auf der Quantifizierung des Mtb-Wachstums durch koloniebildende Einheiten (CFU) auf festen Agarplatten. Dies ist ein langsamer, arbeitsintensiver Assay, der sich nicht für ein schnelles Screening von Medikamenten eignet. Kommerziell erhältliche automatisierte, brühebasierte mikrobielle Nachweissysteme werden häufiger in klinischen mikrobiologischen Laboratorien für den Nachweis und die Prüfung der Arzneimittelempfindlichkeit von Mtb und anderen mykobakteriellen Spezies in klinischen Proben eingesetzt4. Diese Instrumente messen das Wachstum indirekt auf der Grundlage der bakteriellen Stoffwechselaktivität, die zu physikalischen Veränderungen in den Kulturmedien (Veränderung des CO2- oderO2-Spiegels oder-Drucks) führt, die im Laufe der Zeit überwachtwerden 5. Der Messwert ist Time to Positivity (TPP), von dem zuvor gezeigt wurde, dass sie mit der Mtb-CFU in Sputumproben von TB-Patienten als Reaktion auf Behandlung 6,7 und in Lysaten infizierter muriner Lunge und Milz8 korreliert. Darüber hinaus wurden Flüssigkultur-Detektionssysteme verwendet, um die Wirkung konventioneller pathogengesteuerter Therapien auf das Wachstum von Mykobakterien in axenischen Kulturen und kultivierten Makrophagen zu messen 9,10. Das Instrument wurde auch verwendet, um die angeborene Fähigkeit von dendritischen Zellen und von Alveolarmakrophagen zu untersuchen, das intrazelluläre Wachstum von Mtb11,12 zu kontrollieren. Dieses experimentelle Protokoll zeigt, dass ein Flüssigkultur-Diagnosesystem angepasst werden kann, um ein präklinisches Screening von HDT auf TB in kultivierten Makrophagen durchzuführen. Im Vergleich zur CFU-Aufzählung besteht der Hauptvorteil dieser Technik darin, dass sie den experimentellen Arbeitsaufwand und die Zeit, die zur Quantifizierung des intrazellulären mykobakteriellen Wachstums / Überlebens erforderlich sind, erheblich reduziert. Diese Technik beruht auf dem Zugang zu einem automatisierten Kulturinstrument, mit dem das Überleben intrazellulärer Mykobakterien in Immunzellen beurteilt werden kann, die mit einer breiten Palette pharmakologischer Reagenzien behandelt wurden, die auf zelluläre Funktionen abzielen, um die Immunität des Wirts zu stärken.

<table><tbody><tr><td>IX51 Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus, Japan</td><td>N/A</td><td>AFB-Detektion und Bildgebung</td></tr><tr><td>2 mL Mikroröhrchen, flacher Boden, Schraubverschluss, steril</td><td>Sarstedt, North Carolina, USA</td><td>72.694.006</td><td>Mtb-Infektion von Makropahgen</td></tr><tr><td>5 mL Spritze, Luer-Lock</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>SZR-150-031K</td><td>Mtb-Infektion von Makropahgen/CFU</td></tr><tr><td>50 mL Röhrchen, steril</td><td>Sarstedt, North Carolina, USA</td><td>62.547.254</td><td>Mtb-Infektion durch Makropahges</td></tr><tr><td>all-trans-Retinsäure (ATRA) &ge; 98% (HPLC)</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>R2625</td><td>Wirtsgerichteter Therapiekandidat</td></tr><tr><td>BacT/ALERT 3D Mikrobielles Detektionssystem</td><td>Biomerieux ( Hampshire, UK)</td><td>247001</td><td>Brühebasiertes farbmetrisches Detektionssystem</td></tr><tr><td>BACT/ALERT MP&nbsp; BACT/ALERT MP Nahrungsergänzungsmittel</td><td>Biomerieux ( Hampshire, UK)</td><td>414997</td><td>Farbmetrischer Nachweisassay auf Brühe</td></tr><tr><td>BACT/ALERT MP Kulturflaschen</td><td>Biomerieux ( Hampshire, Großbritannien)</td><td>419744</td><td>Farbmetrischer Nachweisassay auf Brühbasis</td></tr><tr><td>BD BBL Middlebrook ADC Anreicherung, 20 mL</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>M0553</td><td>Mycobacterium Flüssigkultur</td></tr><tr><td>BD BBL Middlebrook OADC Anreicherung, 20mL</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>M0678</td><td>Koloniebildende Einheiten</td></tr><tr><td>Zellschaber, 25 cm</td><td>Sarstedt, North Carolina, USA</td><td>83.1830</td><td>Ernte von Lmakrophagenlysaten</td></tr><tr><td>Corning Spritzenfilter, 0,2 &Mikro; m</td><td>Corning Incorporated, Deutschland</td><td>431219</td><td>Sterilisation von Lysepuffer</td></tr><tr><td>Deckglas (Borosilikat), 24 x 50 mm, #1,5 Dicke</td><td>VWR International Limited</td><td>631 - 0147</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximid, aus mikrobieller</td><td>Basis Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>C7698</td><td>Koloniebildende Einheiten</td></tr><tr><td>Dako Fluoreszierendes Eindeckmedium</td><td>Agilent Technologies Ireland</td><td>Limited S3023</td><td>Antifade Eindeckmittel</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>D8537</td><td>Mtb-Infektion von Makropahgen</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, Gibco</td><td>Thermo Fisher, Massachusetts, USA</td><td>10270106</td><td>Makrophagen-Zellkultur</td></tr><tr><td>Glycerin, Difco</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>228220</td><td>Koloniebildende Einheiten</td></tr><tr><td>Hoescht 33342 (BisBenzimid H 33342 Trihydrochlorid)</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>B2261</td><td>Kernfärbung</td></tr><tr><td>IFN&gamma;, rekombinante humane</td><td>F& D Systems Inc, Minnesota, USA</td><td>285-IF</td><td>Wirtsgerichteter Therapiekandidat</td></tr><tr><td>Labtek 2-Well-Kammerobjektträger, steril, Nunc</td><td>Thermo Fisher, Massachusetts, USA</td><td>TKT-210-150R</td><td>Mtb-Infektion von Makropahgen</td></tr><tr><td>L-Asparagin, wasserfrei</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>A4159</td><td>Koloniebildende Einheiten</td></tr><tr><td>Linezolid</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>PZ0014</td><td>Antibiotikum</td></tr><tr><td>Microlance Injektionsnadel 25 G</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>300400</td><td>Mtb-Infektion von Makropahgen/CFU</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Agar Base</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>M0303</td><td>Koloniebildende Einheiten</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 Bouillon Base</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>M0178</td><td>Mycobacterium Flüssigkultur</td></tr><tr><td>Modifizierte Auramin O Flecken- und Entfärbungsmittel</td><td>Scientific Device Laboratory, IL, USA</td><td>345-250</td><td>AFB-Färbung</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>158127</td><td>Mtb-Infektion von Makropahgen</td></tr><tr><td>Petrischale, 92 x 16 mm (20/Beutel)</td><td>Sarstedt, North Carolina, USA</td><td>82.1473.001</td><td>Koloniebildende Einheiten</td></tr><tr><td>Phorbol 12-Myristat-13-acetat (PMA)</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>P8139</td><td>Makrophagen-Zellkultur</td></tr><tr><td>Polysorbat 80, Difco</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>231181</td><td>Mycobacterium Flüssigkultur</td></tr><tr><td>RPMI-1640, Gibco</td><td>Thermo Fisher, Massachusetts, USA</td><td>52400025</td><td>Makrophagen-Zellkultur</td></tr><tr><td>Steriler Zellspreader, L-förmiger</td><td>Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA</td><td>RB-44103</td><td>Koloniebildende Einheiten</td></tr><tr><td>T25 TC Kolben, abgewinkelter Hals, Filterkappe, steril, Nunc</td><td>Thermo Fisher, Massachusetts, USA</td><td>156367</td><td>Mycobacterium Flüssigkultur</td></tr><tr><td>THP-1 Zelllinie</td><td>ATCC, Virginia, USA</td><td>ATCC tib-202</td><td>Makrophagen-Zellkultur</td></tr></tbody></table>

ein automatisiertes kultursystem zur präklinischen erprobung wirtsgerichteter therapien für tuberkulose

An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), der Erreger der Tuberkulose (TB), war bis zum Aufkommen von COVID-19 der weltweit bedeutendste Killer für Infektionskrankheiten. Mtb hat sich entwickelt, um in seiner intrazellulären Umgebung zu bestehen, die Abwehr des Wirts zu umgehen und hat Resistenzen gegen viele antituberkulöse Medikamente entwickelt. Ein Ansatz zur Lösung von Resistenzen besteht darin, bestehende zugelassene Medikamente zu identifizieren, die die Immunantwort des Wirts auf Mtb verstärken. Diese Medikamente könnten dann als adjunktive wirtsgerichtete Therapien (HDT) umfunktioniert werden, um die Behandlungszeit zu verkürzen und Antibiotikaresistenzen zu überwinden.
Die Quantifizierung des intrazellulären Mtb-Wachstums in Makrophagen ist ein entscheidender Aspekt bei der Beurteilung potenzieller HDT. Der Goldstandard zur Messung des Mtb-Wachstums ist das Zählen koloniebildender Einheiten (CFU) auf Agarplatten. Dies ist ein langsamer, arbeitsintensiver Assay, der sich nicht für ein schnelles Screening von Medikamenten eignet. In diesem Protokoll wurde ein automatisiertes, brühebasiertes Kultursystem, das häufiger zum Nachweis von Mtb in klinischen Proben verwendet wird, für das präklinische Screening wirtsgerichteter Therapien angepasst. Die Fähigkeit des Flüssigkultur-Assay-Systems zur Untersuchung des intrazellulären Mtb-Wachstums in Makrophagen, die mit HDT behandelt wurden, wurde bewertet. Die HDTs, die auf ihre Fähigkeit getestet wurden, das MTB-Wachstum zu hemmen, waren all-trans-Retinsäure (AtRA), sowohl in Lösung als auch in Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) -Mikropartikeln und der Kombination von Interferon-gamma und Linezolid. Zu den Vorteilen dieser automatisierten Flüssigkultur-basierten Technik gegenüber der CFU-Methode gehören die einfache Einrichtung, die weniger arbeitsintensive Vorbereitung und die schnellere Zeit bis zum Ergebnis (5-12 Tage im Vergleich zu 21 Tagen oder mehr für Agarplatten).

Das in dieser Studie verwendete automatisierte Flüssigkulturgerät überwacht alle 10 min den CO2 -Gehalt. Eine Farbänderung im Sensor am Boden der Instrumentenflasche wird farbmetrisch gemessen und als Reflexionseinheiten ausgedrückt. Die Gerätesoftware wendet dann Detektionsalgorithmen an, um die Zeit bis zur Positivität (TTP) zu berechnen, d. H. Die Anzahl der Tage von der Inokulation bis zur Markierung der Kulturen als positiv (Abbildung 1A). Eine umgekehrte Beziehung zwischen T...

Eine schnelle und effiziente Quantifizierung des intrazellulären M . tuberculosis-Wachstums ist entscheidend für verbesserte Therapien gegen Tuberkulose (TB). Dieses Protokoll beschreibt einen brühebasierten kolorimetrischen Detektionsassay unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkultursystems zur Quantifizierung des Mtb-Wachstums in Makrophagen, die mit Wirtstherapiekandidaten behandelt werden.

Ein automatisiertes Kultursystem zur präklinischen Erprobung wirtsgerichteter Therapien für Tuberkulose

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent ...

Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es weniger arbeitsintensiv und zeitaufwendig ist als die traditionelle Methode zur Zählung koloniebildender Einheiten, um das intrazelluläre Wachstum von Mycobacterium tuberculosis abzuschätzen. Diese Technik erleichtert es Forschern, von der FDA zugelassene Medikamente schnell zu untersuchen, um sie als wirtsgerichtete Therapien zur Behandlung von Tuberkulose wiederzuverwenden. Die Methode ist sehr einfach und unkompliziert.Grundkenntnisse über mykobakterielle und EO-Träger-T-Zell-Kulturtechniken würden ausreichen, um dem Protokoll Schritt für Schritt zu folgen. Zunächst werden sechs bis acht Milliliter abgeschwächte mykobakterielle Kultur H37Ra aus dem T25-Kolben in ein 15-Milliliter-Polypropylenrohr überführt. Zentrifugieren Sie das Röhrchen in einer Tischzentrifuge.Nachdem Sie das Röhrchen vorsichtig entfernt haben, geben Sie das Röhrchen in den biologischen Sicherheitsschrank und warten Sie eine Minute, bis sich die Bakterien abgesetzt haben. Gießen Sie den Überstand in den Desinfektionsmittel-Entsorgungsbehälter. Verschließen Sie dann die Röhre und suspendieren Sie die Bakterien im verbleibenden Medium, indem Sie vorsicht

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von Mycobacterium tuberculosis ist anspruchsvoll, aber von entscheidender Bedeutung für die Patientenversorgung. Diese Mikrotiterplatten-Format bietet Tests von 12 antimykobakterielle Drogen und bietet minimale hemmende Konzentration (MIC)-Werte, die in eine geeignete Behandlung helfen werden.

Antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von Mycobacterium tuberculosis-Komplexes für die First und Second Line Drugs von Bouillon Verdünnung in einem Mikrotiterplatten-Format

Mycobacterium tuberculosis bildet Wirkstoff toleranten Biofilme, wenn unter bestimmten Bedingungen kultiviert. Hier beschreiben wir Verfahren zur Kultivierung von M. Tuberkulose Biofilmen und die Bestimmung der Häufigkeit des Drogenkonsums tolerant persisters. Diese Protokolle werden für weitere Studien sinnvoll in die Mechanismen der Verträglichkeit der Medikamente in M. Tuberkulose.

Wachstum von Mycobacterium tuberculosis Biofilme

Dieses Video zeigt einen Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mycobacterium tuberculosis (Mtb)-Infektionen. Es wird ein in vitro Infektionsmodell mit Mtb/Makrophagen-Aggregaten erstellt, das eine in vivo Infektion nachahmt. Bei der Einführung geeigneter Antibiotika wird deren Wirksamkeit mittels Resuzarin-Assay getestet, um das Überleben von Bakterien mit steigenden Wirkstoffkonzentrationen zu überwachen.

Ein Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen ein Mycobacterium tuberculosis-Infektionsmodell

Hier beschreiben wir einen phänotypischen Assay, der auf die High-Throughput/High-Content-Screens von klein-interferierender synthetischer RNA (siRNA), chemischer Verbindung und Mycobacterium tuberculosis mutierte Bibliotheken anwendbar ist. Diese Methode beruht auf dem Nachweis von fluoreszierend gekennzeichneter Mycobacterium tuberculosis in fluoreszierend markierten Wirtszellen mittels automatisierter konfokaler Mikroskopie.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Wir haben für die Entdeckung neuer Verbindungen gegen Mycobacterium tuberculosis ein modulares Hochdurchsatz - Screening - System entwickelt, und die intrazelluläre Targeting-Brühe in Bakterien sowie Zytotoxizität gegen die Säuger - Wirtszelle wächst.

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Neue Modelle und Assays, die den frühen Prozess der Arzneimittelentwicklung für Anti-Tuberkulose-Medikamente der nächsten Generation verbessern würden, sind sehr wünschenswert. Hier beschreiben wir einen schnellen, kostengünstigen und BSL-2-kompatiblen Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mycobacterium tuberculosis, der leicht für das Hochdurchsatz-Screening angepasst werden kann.

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Die Bestimmung koloniebildender Einheiten (KBE) ist die Goldstandard-Technik zur Quantifizierung von Bakterien, einschließlich Mycobacterium tuberculosis , die Wochen brauchen kann, um sichtbare Kolonien zu bilden. Hier beschreiben wir eine Mikrokbe für die KBE-Bestimmung mit erhöhter Zeiteffizienz, reduziertem Laborplatz und Reagenzienkosten sowie Skalierbarkeit auf Experimente mit mittlerem und hohem Durchsatz.

Mikrokoloniebildender Unit-Assay zur Wirksamkeitsbewertung von Impfstoffen gegen Tuberkulose

In dieser Studie wurde ein Assay für das Hochdurchsatz-Screening gegen Mycobacterium abscessus mit einem kürzlich entwickelten Doppelreporterstamm entwickelt, der Fluoreszenz und Lumineszenz verwendet, um die Lebensfähigkeit von Bakterien schnell zu beurteilen. Dieses Protokoll wird für Forscher relevant sein, die neue Medikamente gegen diese arzneimittelresistenten Bakterien untersuchen wollen.

Assay-Entwicklung für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening gegen Mykobakterien

Hier demonstrieren wir die Herstellung von Mtb-Kulturfiltrat (CF), dem bakteriellen Wachstumsmedium, das aus Proteinen besteht, die von den Bakterien sezerniert werden. Mtb sezerniert Proteine, um die Signalübertragung des Wirts und die Immunantwort zu modulieren, die für die Pathogenese entscheidend sind. Die präparierten CFs werden mittels Massenspektrometrie analysiert, um alle sekretorischen Faktoren zu identifizieren.

Herstellung von Mycobacterium tuberculosis-Kulturfiltrat zum Verständnis der TB-Pathogenese

Hier stellen wir ein Protokoll zur Identifizierung potenzieller Anti-Tuberkulose-Medikamentenkandidaten durch phänotypisches Screening vor, das die chemische Synthese einer 4-Aminochinolin-Verbindung, die Bestimmung der minimalen inhibitorischen Konzentration gegen Mycobacterium tuberculosis und die Bewertung ihrer Zytotoxizität in Säugetierzelllinien umfasst.

Identifikation potenzieller Anti-TB-Kandidaten: Ein Schritt-für-Schritt-Leitfaden zur Synthese, MIC-Bestimmung und Zytotoxizitätsbewertung in Säugetierzellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die intravitale Bildgebung einer abgeschwächten, BSL-2-zugelassenen Mycobacterium tuberculosis. Spannung in der Mauslunge unter Verwendung eines permanenten Lungenfensters. Dieser Ansatz ermöglicht eine longitudinale, einzelzellige Auflösungsanalyse früher Wirts-Pathogen-Interaktionen, einschließlich bacillärer Lokalisation, vaskulärer Dynamik und Makrophagenaufnahme innerhalb derselben Lungenmikroumgebung.

Intravitale Bildgebung der abgeschwächten auxotrophen Mycobacterium tuberculosis in der Mauslunge während früher intravaskulärer Infektion

Erfahren Sie ein automatisiertes Kultursystem zur quantitativen Erfassung von Mycobacterium tuberculosis in Makrophagen. Diese farbimetrische Methode ermöglicht die schnelle Screening-Prüfung zugelassener Arzneimittel als wirtsgerichtete Therapien gegen Tuberkulose.

Ein automatisiertes Kultursystem zur präklinischen Erprobung wirtsgerichteter Therapien für Tuberkulose

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