Name: Dissektion und Immunhistochemie des Drosophila Adult Leg zur Erkennung von Veränderungen an der neuromuskulären Verbindung für ein identifiziertes Motoneuron (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Lernen Sie eine Präparationsmethode für das adulte Bein von Drosophila melanogaster zur Immunhistochemie. Diese Technik erhält die neuromuskuläre Architektur und ermöglicht die Analyse langsamer degenerativer Veränderungen an identifizierten Motoneuronen.

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Wir danken Eric Roberts für seine Ratschläge zur Bildgebung. Wir möchten auch den Information Technology Services am Rhode Island College und insbesondere Michael Caine und Jake Douglas für die Videografie danken. Monoklonale Antikörper Anti-Dlg und Anti-BRP wurden von UC-Berkeley bzw. Universitaetsklinikim Würzburg entwickelt und stammen von der Developmental Studies Hybridoma Bank, die vom NICHD des NIH erstellt und an der University of Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA 52242, USA, gepflegt wird. Die hier berichtete Forschung wurde vollständig durch das Rhode Island Institutional Development Award (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence des National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Fördernummer [P20GM103430] unterstützt.

Die Verfahren zur Vorbereitung von Arbeitslösungen, die in Verbindung mit diesem Protokoll verwendet werden, sind in Tabelle 1 beschrieben.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td colspan="3">Präparat</td>
			<td colspan="2">Lagerung</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td colspan="3">Machen Sie einen Arbeitsvorrat von 1x PBS aus einer 10x PBS-Stammlösung durch Verdünnen in destilliertem Wasser.  Der pH-Wert des PBS-Arbeitsbestands sollte 7,2- 7,4 betragen</td>
			<td colspan="2">4 °C für mehr als 1 Monat, bis eine bakterielle Kontamination sichtbar ist.</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBT</td>
			<td colspan="3">1x PBS-Lösung mit 0,1% nichtionischem Tensid.</td>
			<td colspan="2">4 °C für mehr als 1 Monat, bis eine bakterielle Kontamination sichtbar ist.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">FA</td>
			<td colspan="3">3,7% ige Formaldehydlösung aus einem 37% igen Formaldehydvorrat und verdünnt in 1x PBS.</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Raumtemperatur. Machen Sie jeden Tag der Sezierung frisch</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">ACHTUNG: Formaldehyd, das als 37% ige Stammlösung geliefert wird, ist ein potenzielles Karzinogen und sollte in einem Abzug verdünnt werden.</td>
		</tr>
<tr>
<td>5% NGS</td>
			<td colspan="3">5% normales Ziegenserum verdünnt in PBT.  Das verwendete Serum sollte mit der Spezies des zu verwendenden sekundären Antikörpers übereinstimmen.</td>
			<td colspan="2">4 °C für mehrere Wochen, bis eine bakterielle Kontamination sichtbar ist</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Lösungen zur Durchführung der Immunzytochemie des adulten Drosophila-Beines . 
1. Erstfixierung von Geweben
<ol><li>Wählen Sie ungefähr 10 Fliegen für jeden Genotyp und jedes Alter aus. Betäuben Sie auf einem Fliegenkissen unter Kohlendioxid (Abbildung 1A, B). HINWEIS: Beginnen Sie mit mehr Fliegen als nötig, um nach der Dissektion eine ausreichend große Stichprobengröße zu gewährleisten.</li>
	<li>Fliegen mit einem Pinsel in einem Glastopf oder einer Schale für ca. 30 Sekunden bis 1 Minute in kaltes Methanol überführen (Abbildung 1C). Das Methanol löst die kutikulären Kohlenwasserstoffe und Fliegen können nun eingetaucht werden, anstatt in wässrigen Lösungen zu schwimmen.</li>
	<li>Mit einer Pinzette fliegen vorsichtig auf PBS übertragen. Spülen Sie 3x in eiskaltem PBS, um überschüssiges Methanol zu entfernen, und halten Sie die Fliegen in PBS bis zur Dissektion und Fixierung auf Eis. An diesem Punkt sezieren Sie Fliegen und fixieren Sie sie innerhalb kürzester Zeit (&lt;30 Minuten).</li>
	<li>Um die Beine zu isolieren, übertragen Sie die Fliegen auf eine silikonelastische Dissektionsschale, die mit kaltem PBS gefüllt ist, entfernen Sie die metathorakalen Beine an der Coxa mit zwei Paar Dumont-Zangen # 5 oder schneiden Sie die Beine mit einer Vanna-Schere ab (Abbildung 1D). Übertragen Sie die Beine in einen Brunnen in einer Kunststoffplatte mit 24 Well, die mit 1 ml PBS gefüllt ist, und halten Sie die Platte auf Eis, bis alle Beine entfernt und in Brunnen übertragen wurden. HINWEIS: Jeder Brunnen kann mindestens 20 Beine halten.</li>
	<li>Ersetzen Sie die PBS-Lösung durch 1 ml FA-Lösung, und drehen Sie sie 30 Minuten lang auf einem Nutator (Abbildung 1E). Die Nutatoreinstellung sollte auf eine mittlere Drehzahl (17 U/min) eingestellt werden. Stellen Sie sicher, dass die Beine während dieser Zeit vollständig in FA-Lösung eingetaucht sind, um eine ausreichende Fixierung zu gewährleisten.</li>
	<li>Um FA-Lösung zu entfernen, waschen Sie 1 ml PBS 3x schnell ein, gefolgt von weiteren 3 Wäschen für jeweils 5 Minuten in 1 ml PBS. Halten Sie Gewebe in 1 ml PBS auf Eis vor und während der unten beschriebenen Dissektionsschritte.</li>
</ol>2. Entfernen der Beinkutikula und Antikörperfärbung
<ol><li>Entfernen der Beinkutikula<ol>
<li>Die Sezierzange ist erfolgskritisch. Führen Sie leichte parallele Biegungen in beiden Zinken am Ende der superfeinen Pinzette Nr. 5 ein, um eine Fase zu erhalten, mit der die Nagelhaut oberflächlich gegriffen werden kann, anstatt gestochen zu werden, was das Gewebe ruinieren kann (Abbildung 1F, G). HINWEIS: Parallel gebogene Zinken sollten im geschlossenen Zustand über die gesamte Länge des Stiftes miteinander in Kontakt treten (Abbildung 2).</li>
		<li>Die Beine zur Dissektion in eine Silikonelastomerschale in PBS überführen. Richten Sie ein Bein so aus, dass die vordere Seite nach oben zeigt (siehe Abbildung 3 für Informationen zur Anatomie und Ausrichtung des Beines). Halten Sie das Tibiasegment mit einer Pinzette gegen die Silikonelastomerschale. Mit der anderen Pinzette, die mit der schrägen Seite nach unten gehalten wird, greifen Sie ein Stück Nagelhaut am distalen Ende des Femurs und ziehen Sie in die proximale Richtung zum Trochanter.</li>
		<li>Entfernen Sie die Nagelhaut methodisch, bis der nackte Muskel am proximalen Ende des Femurs sichtbar ist (Abbildung 1F, G, H). HINWEIS: Stellen Sie nur oberflächlichen Kontakt mit den Beinen her, indem Sie die abgeschrägte Seite der Pinzette verwenden, um ein Muskelziehen zu vermeiden.</li>
		<li>Sobald alle Beine seziert sind, ersetzen Sie PBS durch FA, um die Beine für 30 Minuten mit Schütteln an einem Nutator bei mittlerer Geschwindigkeit zu fixieren (Abbildung 1I). Waschen Sie die Proben in 1 ml PBS 3-mal schnell und dann 3-mal für jeweils 5 Minuten in PBT (Abbildung 1J). HINWEIS: Wenn Sie mit dem monoklonalen Antikörper NC82 (Anti-Bruchpilot) färben, um aktive Zonen zu markieren, nach der Fixierung für 20 Minuten, da dieses Antigen empfindlich auf längere Fixierungen reagiert.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig02v2.jpg"> Abbildung 2. Modifizierte Pinzette zum Sezieren von Erwachsenenbeinen. (A) Die Enden der Pinzette werden gebogen und dann unten abgeflacht (Pfeil), wodurch durch Feilen auf einem Schleifstein eine Abschrägung entsteht. (B) Im Gegensatz dazu sind die Zinken der unveränderten Pinzette nicht gebogen. Maßstabsleiste = 1 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<ol start="2"><li>Antikörperfärbung<ol>
<li>Um Gewebe für die Antikörperfärbung zu blockieren, ersetzen Sie 1 ml PBT durch blockierende Lösung, die aus 1 ml 5% NGS besteht, das in PBT verdünnt ist. Sezierte Beine 4 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C sezieren, während Sie auf einem Nutator mit mittlerer Drehzahl (17 U/min) schaukeln. Decken Sie bei allen Inkubationen zusätzlich zur Kunststoffabdeckung die Vertiefungen mit Dichtband ab (Abbildung 1J). HINWEIS: 24 Wellplatten werden für die Immunzytochemie anstelle von 1,5 ml oder 2 ml Mikrozentrifuge verwendet, da frühere Versuche, Mikrozentrifugenröhrchen zu verwenden, zu gebrochenen Beinen und beschädigtem Gewebe führten.</li>
		<li>Entfernen Sie die Blocklösung und fügen Sie 300 ml primäre Antikörper hinzu, die in frischer Blockierungslösung verdünnt sind. Das geringe Volumen des verwendeten Antikörpers sollte ausreichen, um das Gewebe zu bedecken. Verschließen Sie die Vertiefungen mit Laborabdichtungsband und Kunststoffdeckel erneut und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C unter Schütteln an einem Nutator mit mittlerer Geschwindigkeit (Abbildung 1J). Die Informationen und Konzentrationen des arbeitsfähigen Antikörperreagenzes, die für diese Studien verwendet wurden, sind in Tabelle 2 beschrieben.</li>
		<li>Primäre Antikörper in 1 ml PBT 3 mal kurz und dann 3 mal für jeweils 15 Minuten waschen (Abbildung 1J). HINWEIS: Verdünnte primäre Antikörper können gespeichert und wiederverwendet werden, wenn sie bei 4 °C für bis zu 2 Wochen gelagert werden.</li>
		<li>Blockieren Sie gewebe erneut in 1 ml 5% NGS für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C (Abbildung 1J).</li>
		<li>Entfernen Sie die 5% NGS-blockierende Lösung und fügen Sie 300 μL der entsprechenden verdünnten fluoreszierenden konjugierten sekundären Antikörper hinzu. Fügen Sie zusätzlich eine 1:2000-Verdünnung des fluoreszenzkonjugierten Phalloidins hinzu, um den Muskel zu markieren (Abbildung 1J).</li>
		<li>Für sekundäre Antikörperinkubationen versiegeln Sie Vertiefungen mit Labordichtband und Deckel. Wickeln Sie die Platten auch in Aluminiumfolie, um Fluorophore vor Licht zu schützen. 6-8 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie sekundäre Antikörper und Phalloidin wie in Schritt 2.2.3 oben beschrieben. Abdeckplatten mit Aluminiumfolie zwischen den Waschungen, um Fluorophore vor Licht zu schützen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Montagebeine
<ol><li>Übertragen Sie die Beine mit einer Pinzette auf eine Rutsche und richten Sie die vordere Seite nach oben aus. Bedecken Sie die Beine mit Montagemedien (Abbildung 1K, L). HINWEIS: Die sezierten Beine können mit einer P1000-Pipettenspitze abgesaugt werden, wenn die untere Bohrung durch Schneiden mit einer Rasierklinge verbreitert wird.</li>
	<li>Fügen Sie Tonabstandhalter zu einem 22x22 mm2 Deckglas (# 1.5 Dicke) hinzu, indem Sie die Deckglasecken über eine kleine Kugel Modelliermasse kratzen. Jede Ecke sollte eine kleine Menge Ton von 1-2 mm Dicke haben (Abbildung 1K).</li>
	<li>Um den Dia abzudecken, fügen Sie den Deckglas mit den Tonabstandshaltern hinzu, die zum Objektträger hin zeigen, und drücken Sie vorsichtig auf die Ecken, bis der Deckglas nur noch die Oberfläche des Femurs berührt.</li>
	<li>Um eine Verdunstung zu verhindern, versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit Nagellack und lassen Sie sie an einem dunklen Ort (ca. 10 Minuten) trocknen, bevor Sie sie bei 4 ° C bis zur Bildgebung aufbewahren.</li>
</ol>4. Bildgebung
<ol><li>Aufnahme mit konfokalem Mikroskop (Abbildung 1M). Fügen Sie einen Durchlichtkanal hinzu, um die Qualität der Dissektion besser beurteilen zu können, und Proben mit sichtbar gestörten Muskelfasern im interessierenden Bereich sollten verworfen werden.<ol>
<li>Beginnen Sie mit der Bildgebung von Z-Stacks mit 20-facher Vergrößerung mit 2-fachem Zoom und einer Gesamtbildtiefe von ~ 40 mm, die der Dicke des Femurs entspricht. Für die Erkennung von Fluoreszenzsignalen nehmen Sie Bilder mit Auflösungen auf, die mit der Nyquist-Abtastung übereinstimmen (wir verwenden 1024 x 1024 Pixel mit einer Verweileinstellung von 8-10 μs/Pixel). Die Signalintensität sollte im linearen Bereich liegen, der durch Einstellen der Hohen Spannungsverstärkungseinstellungen erreicht wird. Sobald die Verstärkungseinstellungen für eine Reihe von Stichproben innerhalb eines Experiments festgelegt wurden, sollten sie nicht geändert werden, damit die Signalintensitäten zwischen den Stichproben verglichen werden können.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zur Abbildung synaptischer Boutons und anderer subzellulärer Strukturen nehmen Sie konfokale Bilder mit ≥60-facher Vergrößerung auf. Die Detektoreinstellungen sollten im linearen Bereich liegen, während die Pixeldichte, die Verweildauereinstellungen und die Z-Tiefe für Bilder, die mit geringerer Vergrößerung aufgenommen wurden, ähnlich sein sollten (Schritt 4.1).</li>
</ol>

<ol><li>McDermott, C. J., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+motor+neurone+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of motor neurone disease.</a> BMJ. 336 (7645), 658-662 (2008).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Das Drosophila Adult Leg ist ein ideales Modell zur Untersuchung der Neurodegeneration bei relativer Einfachheit mit gut charakterisierten MNs, die aus Neuroblastenlinien und stereotypen Arborisierungsmustern kartiert wurden. Mehrere Berichte haben zuvor Bein-MNs für die Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen verwendet21,22. Diese Studien verwendeten GFP-exprimierende Linien in Kombination mit Einer Mosaikanalyse mit einem repressiblen Zellmarker (MARCM), um durch die Kutikula zu blättern, und dokumentierten eine Reihe morphologischer Veränderungen. Die Bildgebung von adulten NMJs durch Immunzytochemie mit resezierter Kutikula ermöglicht eine weitere Charakterisierung mit der Fähigkeit, komplexe molekulare Veränderungen mit einer Toolbox von verfügbaren Antikörpern zu verfolgen.
Der immunzytochemische Teil dieses Protokolls ist relativ standardisiert und kann unabhängig vom Genotyp implementiert werden (siehe 23 für eine ausgezeichnete Beschreibung allgemeiner Antikörperfärbemethoden zur Verwendung mit Drosophila). Darüber hinaus können Parameter wie Fluoreszenzintensität, Axonzweiglänge und Boutonzahlen und -größe mit einer Vielzahl verfügbarer ImageJ-Makros bestimmt werden, sobald Bilder aufgenommen und detaillierte Methoden für die quantitative Analyse veröffentlicht wurden (siehe z. B. 24,25,26). Daher ist die Dissektionstechnik die wichtigste Innovation, die hier beschrieben wird. Vor der Dissektion werden die Fliegen in einen Alkohol getaucht, um kutikuläre Kohlenwasserstoffe zu entfernen. Sowohl Ethanol als auch Methanol werden üblicherweise für diesen Zweck verwendet; Wir haben jedoch nur Methanol verwendet. Entscheidend für den Seziererfolg sind mehrere Faktoren: Erstens ermöglicht die Verwendung einer modifizierten Pinzette mit einer Fase einen sehr oberflächlichen Kontakt mit der Kutikula. Zweitens, mit einem Seziermikroskop, das in der Lage ist, eine 60-100-fache Gesamtvergrößerung durchzuführen, so dass die Oberfläche der Kutikula deutlich sichtbar ist. Für Mikroskope mit geringerer maximaler Vergrößerung sind für die meisten gängigen Marken 2-fache Objektive erhältlich und sollten in Kombination mit vorhandenen Linsen ausreichend sein. Drittens macht der anfängliche Fixierungsschritt die Nagelhaut brüchig und leichter wegzuziehen, ohne den darunter liegenden Muskel zu beschädigen. Eine Überfixierung bei diesem Schritt macht das gesamte Bein zu steif für eine effektive Dissektion. Daher sollte die anfängliche Fixierung auf 30 Minuten begrenzt sein. Das Formaldehyd-Fixiermittel dringt nicht genug ein, um das darunter liegende Gewebe während dieser kurzen Zeit effektiv zu vernetzen, und daher ist ein zweiter Fixierungsschritt erforderlich. Vor der zweiten Fixierung sollten Gewebe auf Eis gehalten werden, um Abbau und Veränderungen in der Morphologie zu verhindern. Viertens haben wir festgestellt, dass das Sezieren von Proben während Kälte ebenfalls wichtig ist, wahrscheinlich aus ähnlichen Gründen, da die Nagelhaut brüchig ist und ein kleines Stück leichter entfernt werden kann.
Mit der Praxis stellen wir fest, dass ~ 50% der Dissektionen innerhalb keiner erkennbaren Gewebeschädigung verwendbar sind. Obwohl dieser Prozentsatz im Vergleich zu einigen anderen Geweben niedrig erscheinen mag, ist der Dissektionsvorgang schnell und viele Beine können in 30-60 Minuten bearbeitet werden. Selbst wenn die Erfolgsraten anfangs niedrig sind, ist es daher möglich, 4-5 gute Proben für jede experimentelle Gruppe zu erhalten. Eine Einschränkung kann jedoch die Anzahl der zu einem bestimmten Zeitpunkt verfügbaren Fliegen sein, wenn Genotypen und/oder Alter zu einer erheblichen Letalität führen.
Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass wir aufgrund der Größe nicht in der Lage waren, andere Bereiche des Beines jenseits der proximalen Region des Femurs zu sezieren. So können wir identifizierte MN-Dorne, die das TILM innervieren, zuverlässig untersuchen und es ist möglich, die Kutikula über dem Musculus tibia depressor mit kleinen Veränderungen der Ausrichtung des Beines beim Sezieren zu sezieren. Der Zugang zu anderen Bereichen des Beines hat sich jedoch als schwieriger erwiesen, ohne die axonale Architektur während der Sezierung zu stören.
Hier stellen wir Dissektionsmethoden vor, um Veränderungen am adulten NMJ für definierte MNs zu erkennen, die das Tilm mittels Immunzytochemie innervieren. Das Bein ist nützlich als einfaches System, das nur von ~ 50 MNs innerviert wird und 14 Muskeln mit gut beschriebener Anatomie enthält. Das präparierte Beinpräparat kann über Genotypen hinweg verwendet werden und eine Reihe von Antikörpern steht für die NMJ-Visualisierung zur Verfügung, ohne dass genotypisch komplexe Bestände von Reportergenkonstrukten in mutierten Hintergründen aufgebaut werden müssen. Dieser Ansatz wird eine detailliertere Charakterisierung von Veränderungen am NMJ für MN-Erkrankungen und andere altersbedingte Erkrankungen ermöglichen.

Motoneuronerkrankungen (MN) umfassen eine Gruppe heterogener Erkrankungen, zu denen eine fortschreitende Degeneration gehört, die zu Muskelschwund und Lähmung als primärem klinischem Phänotyp führt1. Obwohl selten mit einer globalen Prävalenz von 4,5 pro 100.000, wird erwartet, dass diese Prävalenz mit einer alternden Bevölkerung zunehmen wird2. Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist die häufigste MN-Erkrankung (MND) und verläuft in der Regel innerhalb kurzer Zeit nach der Diagnose tödlich, da keine krankheitsmodifizierenden Behandlungen verfügbar sind3. MNDs haben eine langwierige präsymptomatische Phase mit frühen molekularen Biomarkerveränderungen und funktionellen Bildgebungsveränderungen bei Patienten gemeinsam4. Frühe präsymptomatische zelluläre Pathologie wird auch in nicht-menschlichen Krankheitsmodellen beobachtet5,6,7,8. Die Untersuchung früher Veränderungen an der neuromuskulären Verbindung ist wichtig für das Verständnis der Pathogenese der MN-Krankheit und kann bei der Entwicklung einer frühen Diagnostik und potenzieller Therapeutika helfen.
In Drosophila gibt es eine Fülle von genetischen und molekularen Werkzeugen, um die Struktur und Funktion der neuromuskulären Verbindung zu sezieren (NMJ, siehe9 für einen Überblick über die gut charakterisierte Larven-NMJ). Diese Werkzeuge in Kombination mit einer kurzen Lebensdauer machen Drosophila zu einem hervorragenden Modell, um neurodegenerative Veränderungen am NMJ zu untersuchen. Insbesondere sind MNs, die erwachsene Muskeln innervieren, während der gesamten ~ 90-tägigen Erwachsenenlebensspanne vorhanden und unterliegen normalen Alterungsprozessen10,11,12,13. Die adulten MNs bieten daher die Möglichkeit, langsame degenerative Veränderungen im Gegensatz zu Larven-NMJs zu untersuchen, die nur für einen kurzen Zeitraum von ~ 1 Woche vor der Metamorphose existieren14,15.
Hier beschreiben wir ein Dissektionsverfahren, mit dem wir eine immunzytochemische Analyse von MNs im erwachsenen Bein durchführen können. Jedes erwachsene Bein wird von ~ 50 MNs innerviert, die sich auf das zugehörige Beinmuskel synapsieren, um die Fortbewegung voranzutreiben. Die Beinanatomie, mechanische Physiologie und Neurobiologie wurde gut beschrieben16,17,18. Axon-Dorne von Bein-MNs wurden zuvor durch Bildgebung durch Kutikula in verfüllten oder genetisch markierten Zellpopulationen unter Verwendung des bipartiten Gal4 / UAS-Systems charakterisiert, und bildgebende Verfahren wurden zuvor veröffentlicht19. Die hier vorgestellten Dissektionsmethoden bewahren die Axonverzweigungsmorphologie und ermöglichen es uns, eine Vielzahl von Antikörpern zu nutzen, um verschiedene molekulare Komponenten des NMJ zu markieren. Unsere bisherigen Arbeiten konzentrierten sich auf Projektionen eines definierten MN im metathorakalen (3.) Bein, das den Musculus tibia levator (tilm) innerviert und konsistente Arborisierungsmuster und Boutonzahlen aufweist. Zunächst untersuchten wir altersabhängige Veränderungen in Drosophila-Superoxid-Dismutase-1 (dsod1)-Mutanten und fanden Veränderungen, die mit dem Abbau des NMJ20 übereinstimmen. Diese Dissektionsmethoden bieten die Möglichkeit, langsame degenerative Veränderungen am NMJ für andere ALS-Modelle, grundlegende Studien des Alterns und andere MN-assoziierte Krankheiten besser zu charakterisieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig01.jpg"> Abbildung 1. Workflow-Zusammenfassung zum Sezieren von Beinen. Ausführliche Anweisungen finden Sie unter Protokoll. (A,B) Fliegen werden selektiert und betäubt. (C) Fliegen werden auf Methanol übertragen und mit PBS gewaschen. (D) Die metathorakalen Beine werden an der Basis der Coxa entfernt, während sie mit einem Seziermikroskop sichtbar gemacht werden (~ 30-fache Vergrößerung); Maßstabsleiste = 500 μm. (E) Die Beine werden dann in 3,7% iger Formaldehyd/ PBS (FA) -Lösung für 30 Minuten in Vertiefungen von 24-Well-Platten fixiert und dann WIRD FA durch Waschen mit PBS entfernt. (F, G, H) Die Beine werden auf Silikonelastomer-Sezierschalen übertragen und ein Stück Kutikula wird mit einer abgeschrägten Pinzette aus dem proximalen Femur entfernt, während es unter einem Seziermikroskop bei 80x visualisiert wird. Maßstabsleiste = 50 μm. (I) Die Beine werden nach der Dissektion in FA fixiert und in PBS und dann PBT (PBS+ 0,1% nichtionisches Tensid) gewaschen. (J) Die Beine werden einer immunzytochemischen Färbung unterzogen. (K,L) Die Beine werden auf einen Glasträger übertragen, in Montagemedien geklärt und mit einem Deckglas bedeckt, das Tonabstandshalter enthält. Maßstabsbalken = 2 mm und 500 μm. (M) Die Beine werden konfokal mikroskopisch abgetastet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platten</td><td>Corning</td><td>3473</td><td>Hydrophobe, extrem niedrige Befestigungsfläche</td></tr><tr><td>2x Objektivzubehör</td><td>Olympus</td><td>110AL2X</td><td>Schraubaufsatz</td></tr><tr><td>Anti-ATP5A-Primärantikörper</td><td>Abcam</td><td>ab14748</td><td>Monoklonaler</td></tr><tr><td>Maus-Antibruchpilot-Primärantikörper</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>Maus monoklonal</td></tr><tr><td>Anti-Scheiben große primäre Antikörper</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank</td><td>4F3</td><td>Maus monoklonal</td></tr><tr><td>Anti-hrp primärer Antikörper</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>123-605-021</td><td>Alexa Fluor 647 konjugierter polyklonaler</td></tr><tr><td>Anti-Polyubiquitin (FK2) Primärantikörper</td><td>Millipore Sigma</td><td>04-263</td><td>Maus monoklonal</td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td>Objektive (NA):&nbsp; 10x (0,4), 20x (0,85), 40x (1,20), 60x (1,42), 100x (1,40)</td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Corning</td><td>285022</td><td>160-190 mm Dicke</td></tr><tr><td>Präparierzange</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Dumont #5SF</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td>37% Stamm stabilisiert mit Methanol</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus Sekundärantikörper</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>115-545-146</td><td>Alexa Fluor 488 konjugiertes</td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB036768</td><td>0,2 mm gefiltert</td></tr><tr><td>Labor-Dichtungsband</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-254</td><td>Parafilm M</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A413</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-123</td><td>76mm x 25mm</td></tr><tr><td>Eindeckmedien</td><td>Molekulare Sonden</td><td>S36972</td><td>Slowfade Diamant Einbettmedien</td></tr><tr><td>Nichtionisches Tensid</td><td>Acros Organics</td><td>215680010</td><td>Triton-X 100</td></tr><tr><td>Nutator</td><td>Fisher Scientific</td><td>S06622</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A34055</td><td>Alexa Fluor 555- konjugierter</td></tr><tr><td>Schleifstein</td><td>Fine Science Tools</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>Silikonelastomer</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>2423610</td><td>Sylgard 184</td></tr></tbody></table>

dissektion und immunhistochemie des drosophila adult leg zur erkennung von veränderungen an der neuromuskulären verbindung für ein identifiziertes motoneuron

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster stellt ein genetisch handhabbares Modell zur Untersuchung der neuronalen Struktur und Funktion sowie nachfolgender Veränderungen der Krankheitszustände dar. Die gut charakterisierte larvale neuromuskuläre Verbindung wird oft für solche Studien verwendet. Die schnelle Larvenentwicklung, gefolgt von Muskelhistolyse und Umbau des Nervensystems während der Metamorphose, macht dieses Modell jedoch problematisch für die Untersuchung langsamer altersabhängiger degenerativer Veränderungen, wie sie bei amyotropher Lateralsklerose auftreten. Alternativ leben erwachsene Fliegen 90 Tage lang und das erwachsene Bein kann verwendet werden, um Motoneuronveränderungen im Laufe der Erwachsenenlebensspanne mit In-vivo-Fluoreszenzbildgebung durch die Kutikula zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Beindissektionstechnik in Verbindung mit Immunzytochemie, die die Untersuchung molekularer Veränderungen an der neuromuskulären Verbindung identifizierter adulter Beinmotorneuronen ermöglicht. Diese Techniken können mit einer Vielzahl von Antikörpern gekoppelt werden, die sowohl prä- als auch postsynaptische Strukturen markieren. Zusammen ermöglichen diese Verfahren eine vollständigere Charakterisierung langsamer altersabhängiger Veränderungen bei erwachsenen Fliegen und können auf mehrere Motoneuron-Krankheitsmodelle angewendet werden.

Abbildung 4 zeigt ein repräsentatives Beispiel für ein metathorakales Bein, das mit Anti-HRP, Anti-Dlg und Phalloidin gefärbt ist. Bei Dissektionen, bei denen die Nagelhaut aus dem proximalen Teil des Femurs entfernt wird, sind stereotype Dornen in der Nähe der Sehne sichtbar, die durch Autofluoreszenz leicht erkannt werden können. Beachten Sie, dass das Eindringen von Antikörpern in das Bein für eine kurze Strecke über den Bereich hinaus erfolgt, in dem die Kutikula entfernt wurde (Abbildung 4A). Diese Bereiche können effektiv abgebildet werden, wenn ein starkes Fluoreszenzsignal vorhanden ist. Die Bildgebung bei geringer Vergrößerung (20-fach mit 2-fachem Zoom) ermöglicht eine einfache Bestimmung von 1) wie viel Nagelhaut entfernt wird und 2) ob während der Dissektion Schäden aufgetreten sind. Eine erhöhte Vergrößerung (60-fach) zeigt stereotype Projektionen auf die Kachel (Abbildung 4B). Unsere Arbeit konzentrierte sich auf eine MN, die wahrscheinlich von der I-MN-Linie abgeleitet ist, die das Tilm im proximalen Femur innerviert (Kasten, Abbildung 4B und Abbildung 4C). Eine weitere Vergrößerung (100-fach mit 2-fachem Zoom) ermöglicht eine effektive Visualisierung synaptischer Boutons (Abbildung 4D).
Um morphologische Veränderungen am erwachsenen NMJ im Laufe der Zeit zu untersuchen, haben wir zuvor dsod1-Mutanten als Modell für ALS verwendet. Bouton-Schwellung tritt bei gealterten dsod1H71Y-Mutanten im Verhältnis zu dsod1null und dsod1+ auf (Abbildung 5A, B). Am Larven-NMJ wird häufig der monoklonale Antikörper NC82 verwendet, um aktive Zonen zu markieren, und dies kann diese Strukturen leicht am adulten NMJ sichtbar gemacht werden (Abbildung 5C). Schwach positive HRP-Axonäste sind in dsod1H71Y-Mutanten reichlich vorhanden und diese Zweige zeigen oft eine schwache und diffuse BRP-Lokalisation (Pfeile).
Wichtig für die Neurodegeneration ist, dass kommerziell erhältliche Antikörper ubiquitinierte Proteine nachweisen können, die häufig in Aggregaten vorkommen, und wir haben ubiquitinierte Aggregate in terminalen Axonen von MNs in gealterten mutierten Dsod1-Fliegen sowie innerhalb von Muskeln nachgewiesen (Abbildung 6A). Auch Antikörper, die Mitochondrien markieren, können morphologische Veränderungen mit dem Alter erkennen (Abbildung 6B).
Bei einigen Präparaten machen Muskelschäden während der Dissektion die Probe unbrauchbar. Zunächst können solche Schäden häufig auftreten, aber mit der Praxis tritt eine Verbesserung ein. Beispiele für gute Dissektionen zeigen Abbildung 7A, C, während schlechte Dissektionen in Abbildung 7B, D gezeigt werden. Schlechte Dissektionen verursachen eine Desorganisation der Muskelfasern, wie sie durch Phasenkontrastmikroskopie nachgewiesen wurde (Abbildung 7B), oder fehlende Muskelfasern, die durch fluoreszierend konjugiertes Phalloidin sichtbar gemacht werden (Abbildung 7D, Pfeil). Die Kombination aus der Verwendung von Phalloidin zur Markierung von Muskeln und Durchlichtbildern kann helfen, solche Muskelschäden zu erkennen, die bei der Betrachtung unter einem Seziermikroskop möglicherweise nicht offensichtlich sind.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig03.jpg"> Abbildung 3. Anatomie des Drosophila-Beines . (A) Diagramm der vorderen Seite eines metathorakalen Beines, gekennzeichnet durch das Vorhandensein von Borsten im Gegensatz zu der markanten nackten Kutikula auf der hinteren Seite. Das segmentierte Bein besteht aus der Coxa (Cx), dem Trochanter (Tr), dem Femur (Fe), der Tibia (Ti), 5 Tarsalsegmenten (Ta1-5) und der Klaue (Cl) in der Reihenfolge von proximal (Pr) bis distal (Di). Dorsale (D) und ventrale (V) Seiten des Femurs sind ebenfalls indiziert. Maßstabsleiste =100 μm. (B) Diagramm des Femurs, der die Muskeln Tibia Levator (Tilm), Tibia Depressor (Tidm), Langer Sehnenmuskel 2 (ltm2) und Tibia Reduktor (Tirm) sowie Axonprojektionen im proximalen Femur enthält, die das Tilm innervieren. Es wird angenommen, dass diese stereotypen axonalen Projektionen von Neuroblasten der I-Linie abgeleitet sind16, und die zweite Arborisation ist am einfachsten durch Dissektion zugänglich (boxed). Maßstabsleiste = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig04.jpg"> Abbildung 4. Der sezierte metathorakale Femur enthüllte eine stereotype MN-Architektur, die die Kachel innervierte. Die Immunzytochemie wurde verwendet, um Neuronen (HRP), Bandscheiben (DLG) und Muskeln (Phalloidin) zu markieren. Z-Stacks wurden mittels konfokaler Mikroskopie durch den gesamten Femur erfasst und als maximale Serienprojektion dargestellt. (A) Ein Durchlichtkanal wurde ebenfalls einbezogen, um zu veranschaulichen, dass während der Dissektion keine nachweisbaren Muskelschäden aufgetreten sind. Das Bild wurde mit 20-facher Vergrößerung aufgenommen, Maßstabsleiste = 50 μm. (B) Identifizierte Dorne, die der Tilme zugeordnet sind (boxed area, center), Maßstabsleiste =20 μm; und (C) bei 60-facher Vergrößerung, Maßstabsbalken = 20 μm. (D) DLG-umgebende Boutons waren bei Wildtyptieren offensichtlich, wenn sie bei 100-facher Vergrößerung mit 2-fachem Zoom abgebildet wurden; Maßstabsleiste = 2 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig05.jpg"> Abbildung 5. Beispiel für altersabhängige Veränderungen in der Boutonmorphologie, die mit der Beindissektionstechnik nachgewiesen werden können. Bouton-Schwellungen werden bei gealterten dsod1H71Y-Mutanten beobachtet. (A) Repräsentative Bilder von HRP-gefärbten Boutons von jungen (neu veröffneten, Tag 0 Erwachsene) und alten (Tag 10) Fliegen, Maßstabsbalken = 1 μm. (B) Boutongrößen wurden aus den jeweiligen Genotypen mit der Maßfunktion in ImageJ quantifiziert. S&lt;0,0001 (2-Wege-ANOVA mit Post-hoc-Tukey-Test). (C) Aktive Zonen innerhalb synaptischer Boutons, die mit dem monoklonalen Antikörper NC82 (Anti-Bruchpilot) markiert sind; Maßstabsleiste = 1 μm. Abbildung geändert von20Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig05large.jpg" target="_blank">klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig06.jpg"> Abbildung 6. Häufige Marker im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen, die in Drosophila-Beinpräparaten verwendet werden. (A) Subzelluläre polyubiquitinierte Aggregate werden in terminalen Axonen und Muskeln von gealterten dsod1H71Y-Fliegen nachgewiesen. Immunzytochemie mit Anti-Polyubiquitin (FK2) detektiert Puncta (Pfeile) in gealtertem dsod1H71Y/H71Y, Maßstabsbalken = 20 μm (links) und 5 μm (rechts). (B) Geschwollene Mitochondrien können mit Anti-ATP5A nachgewiesen werden, Skala bar = 1 μm. Abbildung geändert von20Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig06large.jpg" target="_blank">klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig07v2.jpg"> Abbildung 7. Beispiele für gute und schlechte Dissektionen. (A) Dissektion, die die zugrunde liegende Muskelarchitektur nicht stört. (B) Ein Beispiel für eine schlechte Dissektion, die ausgefranste Muskelfasern (Pfeil) zeigte und nicht für die Analyse verwendet werden konnte. Beide Proben wurden mittels Phasenkontrastmikroskopie aufgenommen. Maßstabsleiste = 50 μm. (C) Beispiel für eine gute Dissektion, aufgenommen durch konfokale Mikroskopie mit HRP (grün) und Phalloidin (blau). (D) Bei einer schlechten Dissektion fehlen dorsale Muskelfasern der TILM (Pfeil). Maßstabsleiste = 50 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antikörper/Färbung</td>
			<td>Verdünnung*</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-ATP5A</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-Bruchpilot (nc82)</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-Cystein-Stringprotein (ab49)</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-Discs groß (4F3)</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-HRP</td>
			<td>1:550</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-Polyubiquitin (FK2)</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-Repo (8D12)</td>
			<td>1:5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phalloidin</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>*Verdünnt in 5% NGS</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2. Antikörper und Verdünnungen. Die kommerziellen Lieferanten der in diesen Studien verwendeten Antikörper sind in der Materialliste aufgeführt.

Wir beschreiben eine Dissektionstechnik, die die Architektur der neuromuskulären Verbindung bewahrt und eine detaillierte immunzytochemische Untersuchung von Motoneuronen im adulten Drosophila-Bein ermöglicht.

Dissektion und Immunhistochemie des Drosophila Adult Leg zur Erkennung von Veränderungen an der neuromuskulären Verbindung für ein identifiziertes Motoneuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Dissektionsmethoden für das erwachsene Bein von Drosophila zu demonstrieren. Diese Technik entfernt einen Teil der Nagelhaut und legt das darunter liegende Gewebe auf eine Weise frei, die die neuronale und muskuläre Architektur bewahrt. Dieses Verfahren ermöglicht es uns, die neuromuskuläre Verbindung für identifizierte Motoneuronlauben unter Verwendung von immunzytären chemischen Standardtechniken zu charakterisieren.Die Dissektion ist besonders nützlich für die Untersuchung langsamer degenerativer Veränderungen, die über relativ lange Zeiträume auftreten. Der Zeitaspekt ist eine wichtige Überlegung, da die gut charakterisierte neuromuskuläre Verbindung von Drosophila-Larven etwa fünf bis sieben Tage vor Beginn der Metamorphose stabil ist. Umgekehrt sind die erwachsenen Neuronen während des gesamten Lebens einer erwachsenen Fliege vorhanden, etwa 90 Tage für einen wildtypischen, im Labor aufgezogenen Drosophila melanogaster.Die Technik ist flexibel und kann auf eine Reihe von Genotypen für verschiedene Krankheitsmodelle angewendet werden und eine Reihe von Antikörpern verwenden, die für Drosophila als Modellsystem verfügbar sind. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Dissektionsmethoden für das erwachsene Bein von Drosophila zu demonstrieren. Diese Technik entfernt einen Teil der Nagelhaut und legt das darunter liegende Gewebe so frei, dass die neuronale und muskuläre Architektur erhalten bleibt.Mit einem Pinsel Fliegen in einem Glastopf oder einer Schale für etwa 30 Sekunden bis zu einer Minute in kaltes Methanol überführen. Das Methanol löst die kutikulären Kohlenwasserstoffe, und Fliegen können jetzt in wässrigen Lösungen eingetaucht werden, anstatt zu schwimmen. Mit einer Pinzette fliegen vorsichtig auf PBS übertragen.Spülen Sie dreimal in eiskaltem PBS, um überschüssiges Methanol zu entfernen, und halten Sie fliegen in PBS auf Eis bis zur Dissektion und Fixierung. An dieser Stelle sollten Fliegen innerhalb kürzester Zeit, vorzugsweise weniger als 30 Minuten, seziert und fixiert werden. Fliegen in eine silikonelastische Dissektionsschale geben, die mit kaltem PBS gefüllt ist.Entfernen Sie die metathorakalen Beine an der Coxa mit zwei Paaren der Dumont-Pinzette Nummer fünf oder schneiden Sie die Beine mit einer Vannas-Schere ab. Übertragen Sie die Beine in einen Brunnen in einem Kunststoff, 24 Well Platte gefüllt mit einer Mil PBS, und halten Sie die Platte auf Eis, bis alle Beine entfernt und in Brunnen übertragen werden. Wir verwenden normalerweise 20 Beine pro Brunnen.Ersetzen Sie die PBS-Lösung durch eine Milliliter FA-Lösung und drehen Sie sie 30 Minuten lang auf einem Nutator. Die Nutatoreinstellung ist auf eine mittlere Drehzahl einzustellen. Stellen Sie sicher, dass die Beine während dieser Zeit vollständig in die Lösung eingetaucht sind.Um FA-Lösung zu entfernen, waschen Sie in einem mil PBS dreimal schnell, gefolgt von weiteren drei Wäschen für jeweils fünf Minuten in einem mil PBS. Halten Sie Gewebe in einer Mil PBS auf Eis, vor und während der Dissektionsschritte. Um einen kurzen Überblick über die Anatomie der Drosophila-Beine zu geben, sind die Beinsegmente angegeben, einschließlich der Coxa, des Trochanters, des Femurs, der Tibia und der fünf Tarsalsegmente.Hier sehen wir eine vordere Ansicht des Beines, erkennbar an der Anwesenheit von sensorischen Borsten im Gegensatz zu nackter Kutikula auf der hinteren Seite. Die Ausrichtung der proximal-distalen Achse und der dorsal-ventralen Achse sind ebenfalls angegeben. Dieses Dissektionsverfahren entfernt ein kleines Stück Kutikula aus dem proximalen Femur, so dass Axonlauben, die dorsal herausragen und den Musculus tibia levator innervieren, untersucht werden können.Unsere bisherige Arbeit konzentrierte sich auf die indizierte Laube, die aus der präsumtiven Neuroblasten-Augenlinie stammt. In diesem Teil des Verfahrens entfernen wir die Nagelhaut von der vorderen Seite des Femurs. Die Sezierzange ist entscheidend für den Erfolg, und wir haben festgestellt, dass die Einführung einer leichten Biegung am Ende der superfeinen Pinzette Nummer fünf eine Fase bietet, die es ermöglicht, die Nagelhaut oberflächlich zu greifen, anstatt gestochen zu werden, was das Gewebe ruinieren kann.Die Beine zur Dissektion in eine Silikonelastomerschale in PBS überführen. Befestigen Sie das Tibiasegment mit einer Pinzette an der Silikonelastomerschale, wie hier auf der rechten Seite gezeigt. Greifen Sie mit der anderen Pinzette, die mit der Schräge nach unten gehalten wird, ein Stück Nagelhaut am distalen Ende des Femurs und ziehen Sie in die proximale Richtung zum Trochanter.Entfernen Sie die Nagelhaut methodisch, bis der nackte Muskel am proximalen Ende des Femurs sichtbar ist. Sobald alle Beine seziert sind, ersetzen Sie PBS durch FA-Lösung, um die Beine für 30 Minuten mit Schütteln auf einem Nutator bei mittlerer Geschwindigkeit zu postfixieren. Anschließend werden die Proben in einem mil PBS dreimal schnell und dann dreimal für jeweils fünf Minuten in PBT-Lösung gewaschen.Um Gewebe zu blockieren, ersetzen Sie ein mil PBT durch eine Blockierenlösung, die aus einem mil 5% normalem Ziegenserum besteht, das in PBT verdünnt ist. Inkubieren Sie sezierte Beine für vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie die blockierende Lösung und ersetzen Sie sie durch einen primären Antikörper, der in blockierender Lösung verdünnt wird.Hier verwenden wir Anti-Discs groß bei einer bis 200 Verdünnung. Teller wieder auf einen Shaker legen und über Nacht bei vier Grad inkubieren. Nach der primären Antikörperinkubation werden die primären Antikörper dreimal kurz in einem mil PBT und dann dreimal für jeweils 15 Minuten gewaschen.Blockieren Sie Gewebe wieder in einer Mühle 5% normales Ziegenserum für mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie die Blockierende Lösung und fügen Sie 300 Mikroliter der entsprechenden verdünnten fluoreszierenden konjugierten sekundären Antikörper hinzu. Zusätzlich fügen Sie eine bis 2000 Verdünnung von fluoreszenzkonjugiertem Phalloidin hinzu, um den Muskel zu markieren.Um zu inkubieren, versiegeln Sie die Vertiefungen mit Laborsiegelband und Deckel. Wickeln Sie die Platten auch in Aluminiumfolie, um Fluorophore vor Licht zu schützen. Sechs bis acht Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.Um ungebundene sekundäre Antikörper zu entfernen, führen Sie Waschungen mit PBT in einer ähnlichen Weise durch, die zuvor beim Waschen des primären Antikörpers beschrieben wurde. Nach diesem Schritt können die Samples nun gemountet und abgebildet werden. Ordnen Sie die Beine mit der vorderen Seite nach oben an und bedecken Sie sie bei Bedarf mit zusätzlichen Montagemedien.Kratzen Sie vorsichtig die Ecken eines Deckels über eine Tonkugel. Der resultierende Ton dient als Abstandshalter zwischen dem Objektträger und dem Deckslip, so dass das Gewebe nicht zerquetscht wird. Drücken Sie auf den Abdeckzettel, bis er die Oberseite der Beine berührt.Verschließen Sie die Kanten mit Nagellack und lagern Sie sie bis zur Bildgebung bei vier Grad. Bild durch konfokale Mikroskopie unter Verwendung von Bildgebungsparametern, die in Abschnitt vier des schriftlichen Protokolls beschrieben sind. Um das Dissektionsprotokoll zu validieren, bilden wir zunächst Beine durch Phasenkontrastmikroskopie bei geringer Vergrößerung ab.Hier ist ein Beispiel auf Panel A für eine gute Dissektion auf der linken Seite und eine schlechte Dissektion auf der rechten Seite, bei der Muskelfasern gestört wurden. Panel C zeigt ein konfokales Bild einer guten Sezierung, bei der der Muskel nicht gestört wurde. Im Gegensatz dazu zeigt Panel D ein während der Dissektion geschädigtes Bein, bei dem Muskelfasern fehlen, wie der Pfeil anzeigt.Hier haben wir ein abgebildetes Bein mit Anti-Meerrettichperoxidase gefärbt, um neuronale Prozesse zu erkennen, hier in grün, Anti-Scheiben groß, was die postynaptische Glutamatrezeptor-Clusterung erleichtert, rot dargestellt, und Phalloidin, um den Muskel zu markieren, blau dargestellt. Bei einer Aufnahme mit 20-facher Vergrößerung mit einem durchgelassenen Lichtkanal ist es leicht, den sezierten Bereich zu sehen. Beachten Sie, dass Antikörper teilweise in unbestimmte Bereiche eindringen und durch die Kutikula gesehen werden können, wie durch den weißen Pfeil angezeigt.Jedes der Bein-Motoneuronen macht stereotype Projektionen, wenn es Muskeln innerviert. Unsere Arbeit konzentriert sich auf Motoneuronen, die den Musculus tibia levator innervieren, der hier als geboxte Region dargestellt und durch den weißen Pfeil angezeigt wird. Bei einer höheren Vergrößerung von 60X mit 2-fachem Zoom oben rechts können wir Boutons, die in Grün dargestellt sind, und die umgebende DLG, die in Rot dargestellt sind, effektiv abbilden.Das Weitere Vergrößern des Zooms oder das Stufen zu einem 100-fachen Objektiv ermöglicht die Quantifizierung der Boutongröße und -morphologie, wie unten rechts gezeigt. Mit dieser Dissektionstechnik in Kombination mit Immunzytochemie fanden wir heraus, dass es in einem Sod1-Mutantenmodell von ALS, das hier in gealterten H71Y-Beinen gezeigt wird, im Vergleich zu Wildtypkontrollen, wie durch die Pfeile angezeigt, eine H-abhängige Boutonschwellung gibt. Boutongrößen werden im Bienenschwarmdiagramm rechts quantifiziert.Wir fanden ferner eine Reduktion des aktiven Zonenmarkers Bruchpilot, rot dargestellt, in schwach gefärbten HRP-Axonen, grün dargestellt, von H71Y-Mutanten. Um die Neurodegeneration zu untersuchen, werden ubiquitinierte Proteinaggregate häufig durch den Antikörper FK2 nachgewiesen und hier als FK2-positive Puncta in den Axonen und Muskeln von gealterten Sod-H71-Fliegen auf der rechten Seite gezeigt, die durch die Pfeile angezeigt werden. Schließlich können Mitochondrien durch Immunzytochemie unter Verwendung eines monoklonalen Anti-ATP5a-Antikörpers visualisiert werden, wie hier rot im Musculus tibia levator gezeigt.Wir fanden heraus, dass Mitochondrien bei H71Y-Mutanten mit zunehmendem Alter vergrößert werden. Einmal gemeistert, ermöglicht Ihnen die sezierte Beinvorbereitung und die damit verbundene Antikörperfärbung, molekulare Veränderungen an der adulten neuromuskulären Verbindung für Ihre bevorzugte Mutante zu verschiedenen Zeitpunkten zu analysieren.

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