Absolute Quantifizierung von Inositolpyrophosphaten durch Kapillarelektrophorese Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie

Dies liefert qualitativ hochwertige Ergebnisse für den Inositolphosphatstoffwechsel in allen bisher getesteten Organismen. Es wird auch Einblicke in neue zelluläre Biosynthesewege geben, die uns derzeit bekannt sind. Die Analyse des Inositolphosphatstoffwechsels durch CE-ESI-MS ist schneller, hochempfindlich und in der Lage, Strukturinformationen für Inositolphosphat-Baugruppen zu liefern.

Um zu beginnen, richten Sie ein Kapillarelektrophorese-Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie- oder CE-ESI-MS-System ein, das aus einem kommerziellen CE-System und einem Triple-Quadrupol-Tandem-Massenspektrometer besteht, das mit einer Agilent Jet Stream ESI-Quelle ausgestattet ist. Verbinden Sie anschließend den Mantelstrom-1:100-Splitter und den Ausgang der isokratischen Flüssigkeitschromatographie-Pumpe und stellen Sie sicher, dass sich das CE-Systemeinlassgefäß auf derselben Höhe wie die Sprühgerätespitze des Massenanalysators befindet. Verwenden Sie dann die MassHunter Workstation-Version oder eine ähnliche MS-Software, um das gesamte System und die Datenerfassung und -analyse zu steuern.

Nach der Vorbereitung des CE-Laufpuffers und der Mantelflüssigkeit installieren Sie die Mantelflüssigkeit durch Spülen mit fünf Milliliter pro Minute für fünf Minuten. Stellen Sie dann den Durchfluss auf einen Milliliter pro Minute und den Pumpendruck auf 180 bar ein. Stellen Sie sicher, dass der recycelte Schlauch wieder mit der Hüllenflüssigkeitsflasche verbunden ist, um das Lösungsmittel wiederzuverwenden.

Als nächstes schneiden Sie mit einem Kapillarsäulenschneider mit einer rotierenden Diamanttrennscheibe beide Enden einer CE-MS-Kapillare mit einem UV-Detektionsfenster ordnungsgemäß ab. Entfernen Sie dann zwei bis drei Zentimeter Polyimidbeschichtung an beiden Enden mit einem Feuerzeug und reinigen Sie die Kapillaroberfläche mit Isopropanol. Um die Kapillare zu installieren, passen Sie die Kapillare an die CE-MS-Kassette an.

Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Kassette wechseln und legen Sie die Kassette in das CE-Gerät ein. Um die Kapillare zu aktivieren, spülen Sie zuerst die Kapillare mit einem molaren Natriumhydroxid, gefolgt von Wasser für 10 Minuten und dann CE-Laufpuffer für 15 Minuten. Als nächstes führen Sie die Kapillare in das CE-MS-Sprühgerät ein.

Stellen Sie mit einer Lupe und der Einstellschraube im Sprühgerät den Kapillarauslass präzise ein, so dass das Kapillarende ca. 0,1 Millimeter aus der Sprühspitze herausragt. Überprüfen Sie die Stabilität des ESI-Sprühgeräts im Vollscan-Modus. Die Schwankung der Gesamtionenelektropherogramme sollte innerhalb von 5% liegenDann führen Sie einen Testlauf mit Inositolphosphatstandards durch.

Nach der Herstellung der internen Standardmischung mischen Sie 10 Mikroliter der Probe mit 0,5 Mikrolitern der internen Standardmischung und einem CE-Probenfläschchen. Wenn Sie das Nachschubsystem verwenden, klicken Sie auf die Schaltfläche Flasche wechseln. Geben Sie die vorbereiteten 250 Milliliter CE-Laufpuffer in die Elektrolytflasche.

Klicken Sie dann auf Clean Tubes und halten Sie die Nachschubnadel in einem Wasserfläschchen. Stellen Sie die ESI- und MS-Parameter ein. Optimieren Sie dann die Quellparameter mit einem Quellenoptimierer mit einer Mischung aus Inositolpolyphosphatstandards und mehreren Reaktionsüberwachungseinstellungen mit MassHunter Optimizer mit allen Standards.

Führen Sie als nächstes einen Lauf für die Inositolphosphatextrakte durch und überprüfen Sie die Ergebnisse. Legen Sie eine Reihenfolge fest, wenn mehr Samples vorhanden sind. Lassen Sie die MS nach der Messung in den Standby-Modus und schalten Sie die Flüssigkeitschromatographiepumpe nicht aus.

Ersetzen Sie das CE-ESI-MS-Sprühgerät durch ein LC-ESI-MS-Sprühgerät, wenn keine Mantelflüssigkeit zugeführt wird. Öffnen Sie für die Datenanalyse die Software Quantitative Analysis und erstellen Sie einen Stapel für alle Proben. Als nächstes erstellen Sie eine neue Methode aus den erfassten Daten zur Überwachung mehrerer Reaktionen und legen die Kohlenstoff-13-Inositolphosphate als interne Standards fest.

Überprüfen Sie dann die Multiple Reaction Monitoring Compound, die Retentionszeit, die internen Standards, die Konzentration und den Qualifier. Übergeben Sie die Validierung und beenden, um die Methode auf den aktuellen Batch anzuwenden. Speichern Sie die Methode.

Überprüfen Sie anschließend, ob jeder Peak in der Charge korrekt integriert ist. Andernfalls integrieren Sie den Peak manuell. Exportieren Sie die Ergebnisse in eine Tabelle und quantifizieren Sie die Inositolpyrophosphate, indem Sie die Anolyt-Peak-Reaktion mit der jeweiligen Peak-Reaktion der mit stabilen Isotopen markierten internen Standards mit bekannten Konzentrationen vergleichen.

Schließlich berechnen Sie mit der gemessenen Konzentration im Inositolphosphat, der Extraktlösung und ihrem Volumen die absoluten Mengen und normalisieren die Menge weiter durch Zellzahl oder Proteingehalt. Berechnen Sie die Zellkonzentration basierend auf der Zellzahl und dem durchschnittlichen Zellvolumen von HCT116-Zellen. Die extrahierten Ionenelektropherogramme von Inositolpyrophosphat-Standards in einer Konzentration von zwei Mikromol sind hier dargestellt.

Der Metabolismus von Inositolpyrophosphaten in Säugetieren mit ihren vereinfachten Strukturen wird eingefügt. Ein CE-ESI-MS-Lauf von HCT116-Zellen vom University College London oder UCL ist hier gezeigt. CE-MS wurde verwendet, um die Variation der IP8-Werte zwischen HCT116-Zellen von UCL und denen von NIH zu quantifizieren.

Die HCT116-Zellen von UCL enthalten siebenmal höhere IP8-Werte als die von NIH. Die signifikante Akkumulation von 1,5-IP8 in den HCT116 UCL-Zellen geht einher mit einem deutlichen Anstieg von 1-IP7. Die CE-ESI-MS-Analyse von Natriumfluorid-behandelten HCT116-Zellen aus NIH zeigte eine Erhöhung von 5-IP7 zusammen mit einer Verringerung von IP6 und einem Auftreten von 5-PPIP4.

Obwohl die Werte von 1-IP7 bis zu einem gewissen Grad abnahmen, fehlt es in mit Natriumfluorid behandelten Zellen nicht vollständig, sondern meist unter der Nachweisgrenze. Es ist wichtig, eine stabile CE-ESI-MS-Klasse zu bilden. Wir empfehlen, die Wiederholbarkeit und Empfindlichkeit des Systems vor Messungen zu überprüfen.

Diese Technik ermöglicht die Bereitstellung von Inositolphosphatstoffwechsel, Implantaten und Geweben und bietet auch die Möglichkeit, das biologisch relevante Inositolpyrophosphat genau zu untersuchen.