Name: Herstellung von multifunktionalen Mikrokapseln auf Seidenbasis, die mit DNA-Plasmiden beladen sind, die für RNA, Aptamere und Riboschalter kodieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von multifunktionalen Seiden-Mikrokapseln mit DNA-Plasmiden für Biosensoren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Genaktivierungskinetiken in biokompatiblen Umgebungen.

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Diese Arbeit wurde durch das LRIR 16RH3003J-Stipendium des Air Force Office of Scientific Research sowie durch das Programm Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S&T Priorities (ARAP) des U.S. Office of the Under Secretary of Defense for Research and Engineering unterstützt.
Die Plasmidvektorsequenz für ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) wurde großzügigerweise von Dr. J. Gallivan zur Verfügung gestellt. Seidenraupenkokons von Bombyx mori wurden großzügig von Dr. D.L. Kaplan von der Tufts University, MA, gespendet.

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Die hier dargestellten Ansichten und Meinungen sind die der Autoren und repräsentieren nicht unbedingt die Ansichten des DoD oder seiner Komponenten

Selektiv permeable Hydrogel-Mikrokapseln, die mit verschiedenen Arten von DNA-kodierten Sensordesigns beladen sind, können nach diesem Protokoll hergestellt werden. Eine der Besonderheiten des LbL-Ansatzes ist die Fähigkeit, die Komplexität von Mikrokapseln während der Bottom-up-Assemblierung maßzuschneidern, die in der Regel mit der Adsorption molekularer Spezies an Opfervorlagen beginnt. Durch sorgfältige Anpassung der Konzentrationen der Ausgangskomponenten, der pH-Bedingungen und der Anzahl der Schichten können Mikro...

Das Gebiet der synthetischen Biologie bietet einzigartige Möglichkeiten, Sensorfähigkeiten zu entwickeln, indem natürliche Mechanismen genutzt werden, die von Mikroorganismen entwickelt wurden, um ihre Umwelt und potenzielle Bedrohungen zu überwachen. Wichtig ist, dass diese Sensormechanismen in der Regel mit einer Reaktion verbunden sind, die diese Mikroorganismen vor schädlicher Exposition schützt und die Genexpression reguliert, um negative Auswirkungen zu mildern oder die Aufnahme giftiger Materialien zu verhindern. Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um diese Mikroorganismen so zu verändern, dass sie Ganzzellsensoren herstellen, die diese natürlichen Reaktionen nutzen, sie aber umleiten, um neue Ziele zu erkennen und/oder ein messbares Signal zu erzeugen, das zu Quantifizierungszwecken gemessen werden kann (typischerweise Fluoreszenz)1,2. Gegenwärtig deuten Bedenken hinsichtlich der Verwendung genetisch veränderter Mikroorganismen (GVO), insbesondere bei der Freisetzung in der Umwelt oder im menschlichen Körper, aufgrund des Austritts ganzer Zellen oder eines Teils ihres genetischen Materials, selbst wenn es in einer Polymermatrix eingekapselt ist, darauf hin, dass alternative Wege zur Nutzung dieser Sensoransätze erforderlich sind3.
Ein wirksamer Ansatz, um die Vorteile der mikroorganismenbasierten Sensorik zu nutzen, ohne sich Gedanken über den Einsatz von GVO machen zu müssen, ist die Verwendung von In-vitro-Transkriptions-/Translationssystemen (IVTT). Aus praktischer Sicht bestehen IVTT-Systeme aus einer Mischung, die die meisten Zellbestandteile in einem aktiven Zustand enthält, die auf unterschiedliche Weise aus den Zellen "extrahiert" wurden,z. B. durch Beschallung, Perlenschlagen oder andere 4. Das Endprodukt dieses Prozesses ist ein biochemisches Reaktionsgemisch, das bereits für die Transkription und Translation optimiert ist und zum Testen verschiedener Sensoren in einem "offenen Gefäß"-Format verwendet werden kann, ohne die Einschränkungen, die mit der Verwendung ganzer Zellen verbunden sind (Membrandiffusion, Transformationseffizienz, Zelltoxizität usw.). Wichtig ist, dass verschiedene Sensorkomponenten quantitativ hinzugefügt und ihre Wirkung durch verschiedene optische und spektrometrische Techniken untersucht werden können, wie wir gezeigt haben5. Es wurde festgestellt, dass die Leistung von IVTT-Systemen inkonsistent sein kann. Neuere Studien haben jedoch Ansätze zur Standardisierung ihrer Präparation und Charakterisierung gezeigt, was bei der Untersuchung ihrer Leistung im Sensordesign eine große Hilfe ist6. In jüngster Zeit wurden viele Beispiele für IVTT-Systeme demonstriert, die zur Herstellung papierbasierter Assays durch die Gefriertrocknung ihrer Komponenten in Papiermatrizes verwendet werden, einschließlich der Detektion von Schwermetallionen, Drogen, Quorum-Sensorelementen und anderen 7,8,9. Ein spannender Anwendungsbereich für IVTT-basierte Sensoren ist ihr Einsatz in Sensoranwendungen in verschiedenen Arten von Umgebungen, einschließlich Boden, Wasser und dem menschlichen Körper. Um diese IVTT-Systeme in diesen anspruchsvollen Umgebungen einsetzen zu können, muss ein Kapselungsansatz implementiert werden, um die IVTT-Komponenten einzudämmen und sie vor Verschlechterung zu schützen.
Die gebräuchlichsten Verkapselungsansätze für IVTT-Systeme umfassen die Verwendung von Lipidkapseln, Mizellen, Polymersomen und anderen dicht geschlossenen Mikrobehältern10,11,12. Ein Nachteil dieses Ansatzes ist die Notwendigkeit, entweder passive oder aktive Mechanismen für den Transport von Materialien in und aus den Behältern zu integrieren, um die Kommunikation mit der externen Umgebung zu ermöglichen und Sensorfunktionen bereitzustellen. Um einige dieser Probleme zu überwinden, berichtet die Studie hier über eine Methode, die einen einfachen, aber effektiven Ansatz zur Verkapselung der Kodierungsmaterialien für verschiedene Sensordesigns bietet, die in IVTT-Systemen ausgedrückt werden sollen. Dieser Ansatz basiert auf der Verwendung der Layer-by-Layer (LbL)-Abscheidung eines Biopolymers in Gegenwart der interessierenden Plasmide, um hohle Mikrokapseln mit hoher Porosität herzustellen, die es dem geschützten genetischen Material ermöglichen, mit den verschiedenen Komponenten des IVTT der Wahl zu interagieren. Die Studie zeigte, dass verkapselte Plasmide die Transkription und Translation steuern können, wenn sie innerhalb dieser polymeren Matrix aktiviert werden, wie die Reaktion eines Plasmid-kodierten Aptamers und eines Riboschalters auf ihre entsprechenden Ziele zeigt. Zusätzlich schützt diese LbL-Beschichtung die Plasmide monatelang ohne besondere Lagerbedingungen.

<table><tbody><tr><td>(Z)-4-(3,5-difluor-4-hydroxybenzyliden)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluorethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-on (DFHBI-1T)</td><td>Lucerna</td><td>DFHBI-1T</td><td></td></tr><tr><td>5x T4 DNA Ligase Puffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46300-018</td><td></td></tr><tr><td>6x Blue Gel Loading Dye</td><td>New England BioLabs</td><td>B7021S</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten, schwarz zirkulär</td><td>Corning</td><td>3601</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>BioReagenz, für die Molekularbiologie, niedriger EEO</td></tr><tr><td>Ampicillin-Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>Pulver oder Kristalle, BioReagenz, geeignet für Zellkulturen</td></tr><tr><td>BlpI-Restriktionsenzyme</td><td>New England BioLabs</td><td>R0585S</td><td></td></tr><tr><td>Corning Einweg-Vakuumfilter-/Speichersysteme</td><td>FisherScientific</td><td>09-761-1</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid, DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>ACS-Reagenz, &ge; 99.9%</td></tr><tr><td>DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Brokkoli (5.4 kb), BrocApt.</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #66788</td><td></td></tr><tr><td>DyLightTM550 Antikörper-Markierungskit (Invitrogen)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>84530</td><td></td></tr><tr><td>E. coli S30 Extraktsystem für zirkuläre DNA</td><td>Promega</td><td>L1020</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Konische Zentrifugenröhrchen, 15 mL</td><td>FisherScientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Konische Zentrifugenröhrchen, 50 mL</td><td></td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Mikrozentrifugenröhrchen, 1,5 mL</td><td>FisherScientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Flusssäure, HF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695068</td><td>ACS-Reagenz, 48%</td></tr><tr><td>Kanamycinsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>Mischung aus Kanamycin A (Hauptkomponente) und Kanamycin B und C</td></tr><tr><td>KpnI-Restriktionsenzymen</td><td>New England BioLabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>LB Agarplatte ergänzt mit 100 & micro; g/mL Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5667</td><td>vorgegossene Agarplatten mit 100 & Mikro; g/mL Ampicillin</td></tr><tr><td>LB Agarplatte ergänzt mit 50 & Mikro; g/mL Kanamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0543</td><td>vorgegossene Agarplatten mit 50 & Mikro; g/mL Kanamycin</td></tr><tr><td>LB Bouillon (Lennox-Qualität)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumbromid, LiBr</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213225</td><td>ReagentPlus, &ge; 99%</td></tr><tr><td>Max Wirkungsgrad DH5-&Alpha; kompetenter E. coli Stamm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>322415</td><td>wasserfrei, 99,8%</td></tr><tr><td>MilliQ-Wasser</td><td>EMD MilliPore</td><td></td><td>Milli-Q Referenz Wasser Aufreinigungssystem</td></tr><tr><td>MinElute PCR Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&prime;-ethylcarbodiimidhydrochlorid, EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1769</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>1x PBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin, verzweigt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>durchschnittlich Mw ~25.000</td></tr><tr><td>PURExpress In-vitro-Proteinsynthese-Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>E6800S</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td> 27104</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Load 2-Log DNA-Leiter (0.1-10.0 kb)</td><td>New England BioLabs</td><td>N0469S</td><td></td></tr><tr><td>SiO? Siliziumdioxid-Mikrosphären, 4.0 & Mikro; m</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>24331-15</td><td>10%ige wässrige Lösung</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer G2 Dialysekassetten, 3,5 K MWCO, 15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>87724</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcarbonat, Na?CO?</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>222321</td><td>ACS-Reagenz, wasserfrei, &ge; 99,5%, Pulver</td></tr><tr><td>Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysegeräte</td><td>FisherScientific</td><td>08-607-008</td><td>Spectrum G235058</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel-Färbung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase (5 U/&mikro; L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Theophyllin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1633</td><td>wasserfrei, &ge; 99%, Pulver</td></tr><tr><td>Trisacetat-EDTA-Puffer (TAE-Puffer)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6025</td><td>Enthält 40 mM Tris-Acetat und 1 mM EDTA, pH 8,3.</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-freies destilliertes Wasser</td><td>FisherScientific</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep Kit</td><td>ZymoResearch</td><td>D4202</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von multifunktionalen mikrokapseln auf seidenbasis, die mit dna-plasmiden beladen sind, die für rna, aptamere und riboschalter kodieren

Preparation of Multifunctional Silk-Based Microcapsules Loaded with DNA Plasmids Encoding RNA Aptamers and Riboswitches

Wir stellen ein Protokoll für die Herstellung von DNA-beladenen Seidenfibroin-Mikrokapseln über die Layer-by-Layer (LbL) Assemblierungsmethode auf sphärischen Opferkernen vor. Nach Adsorption einer Hauptschicht und DNA-Plasmiden wurde die Bildung robuster Mikrokapseln durch die Induktion von β-Blättern in der Seidensekundärstruktur während der akuten Dehydratisierung einer einzelnen Seidenschicht erleichtert. Daher erfolgte die Schichtung über mehrfache Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen. Nach der Adsorption von mehrschichtigen Hüllen können die Kern-Schale-Strukturen mit Goldnanopartikeln (AuNPs) und/oder Antikörpern (IgG) weiter funktionalisiert werden, um sie für die Fernerkundung und/oder den gezielten Transport zu verwenden. Die Einstellung mehrerer Schlüsselparameter während der sequentiellen Abscheidung von wichtigen Makromolekülen auf Siliziumdioxidkernen, wie z. B. das Vorhandensein eines Polymerprimers, die Konzentration von DNA und Seidenprotein sowie eine Reihe von adsorbierten Schichten, führte zu biokompatiblen, DNA-beladenen Mikrokapseln mit variabler Permeabilität und DNA-Beladung. Nach der Auflösung von Siliziumdioxidkernen zeigte das Protokoll die Bildung von hohlen und robusten Mikrokapseln mit DNA-Plasmiden, die an der Innenfläche der Kapselmembran immobilisiert waren. Durch die Schaffung einer selektiv permeablen biokompatiblen Membran zwischen den DNA-Plasmiden und der äußeren Umgebung blieb die DNA während der Langzeitlagerung erhalten und spielte eine wichtige Rolle bei der verbesserten Output-Antwort von räumlich begrenzten Plasmiden. Die Aktivität von DNA-Templates und ihre Zugänglichkeit wurden während in vitro Transkriptions- und Translationsreaktionen (zellfreie Systeme) getestet. DNA-Plasmide, die für RNA-Light-up-Aptamere und Riboschalter kodieren, wurden erfolgreich mit entsprechenden Analyten aktiviert, wie bei der Lokalisierung von fluoreszenzmarkierten RNA-Transkripten oder GFPa1-Proteinen in den Schalenmembranen sichtbar wurde.

Hier befasst sich die Studie mit der Funktionalität von DNA-Templates, die nach der Verkapselung in Seidenproteinkapseln für verschiedene Sensordesigns (zwei Arten von RNA-regulierten Transkriptions-/Translationselementen) kodieren. Mikrokapseln wurden durch Schicht-für-Schicht-Montage (LbL) der Schlüsselkomponenten hergestellt: Eine Hauptschicht, DNA-Plasmide, die für Sensordesigns kodieren, und Seidenfibroin-Biopolymer (Abbildung 2). Die schichtweise Abscheidung von Makromolekülen ermöglic...

Das Protokoll beschreibt die Bildung robuster und biokompatibler DNA-beladener Mikrokapseln als gemultiplexte In-vitro-Biosensoren , die in der Lage sind, mehrere Liganden zu verfolgen.

Herstellung von multifunktionalen Mikrokapseln auf Seidenbasis, die mit DNA-Plasmiden beladen sind, die für RNA, Aptamere und Riboschalter kodieren

We introduce a protocol for the preparation of DNA-laden silk fibroin microcapsules via the Layer-by-Layer (LbL) assembly method on sacrificial spherical ...

Die Bedeutung dieses Protokolls besteht darin, dass es ein Mittel bietet, um DNA-kodierte Sensoren funktionsfähig zu halten, indem DNA-Plasmid-Templates in semipermeable biokompatible Mikrokapseln immobilisiert werden. Die vorgeschlagene DNA-Immobilisierungstechnik ist vielseitig. Es ermöglicht die Herstellung von multifunktionalen Biosensoren mit unterschiedlichen in vitro Aktivierungsmechanismen.Wir stellen uns vor, dass diese Mikrokapseln, gekoppelt mit den richtigen Sensorelementen, verwendet werden könnten, um verschiedene biologische Prozesse zu untersuchen, einschließlich der Freisetzung von Signalmolekülen in verschiedenen Umgebungen wie Biofilmen und Organen. Diese Technik kann Einblicke in die biologischen Systeme auf der Mikroskala geben, insbesondere in die Frage, wie die Immobilisierung von DNA und das molekulare Crowding die Kinetik und den Mechanismus der Genaktivierung beeinflussen können. Beginnen Sie mit der Abscheidung der Polyethylenimin-Grundschicht auf den Opfer-Kieselsäure- oder SiO2-Mikropartikeln, indem Sie einen Milliliter Polyethyleniminlösung zu 300 Mikrolitern der Mikropartikel in einem Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzufügen.Rühren Sie die Mischung auf einem ThermoMixer mit 800 Umdrehungen pro Minute bei Umgebungsbedingungen. Die Mikropartikel werden durch Zentrifugation bei 0,2 g für eine Minute bei Raumtemperatur aufgefangen und der Überstand vorsichtig entfernt. Nach 15 Minuten werden die Mikropartikel viermal mit einem Milliliter DNase- und RNase-freiem deionisiertem Wasser gewaschen, indem eine Minute lang bei Raumtemperatur bei 0,2 g zentrifugiert wird, wobei der Überstand nach jeder Zentrifugation verworfen wird.Als nächstes wird die Konzentration der DNA-Plasmide mit DNase- und RNase-freiem destilliertem Wasser von 50 auf 200 Nanogramm pro Mikroliter eingestellt und ein Milliliter der vorbereiteten Lösungen verwendet, um die DNA auf den mit Polyethylenimin geprimten Mikropartikeln abzuscheiden. Rühren Sie die Mikropartikelmischung auf einem ThermoMixer bei vier Grad Celsius und 800 U/min 15 Minuten lang vorsichtig und sammeln Sie die Mikropartikel dann durch Zentrifugation bei 0,2 g für eine Minute. Markieren Sie die Röhrchen für DNA-Plasmide, die für Theophyllin-Riboswitch, gekoppelt mit GFPa1, als ThyRS-GFPa1 kodieren, und DNA-Plasmide, die für Brokkoli-Aptamer kodieren, als BrocApt.Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und waschen Sie die Mikropartikel viermal mit einem Milliliter DNase- und RNase-freiem destilliertem Wasser, wie zuvor gezeigt, und entsorgen Sie den Überstand nach jeder Zentrifugation. Um die Seidenfibroinschicht abzuscheiden, fügen Sie einen Milliliter der rekonstituierten wässrigen Seidenfibroinlösung zu den DNA-absorbierten Mikropartikeln hinzu und rühren Sie die Mischung auf dem ThermoMixer bei 750 U/min 15 Minuten lang bei 10 Grad Celsius vorsichtig um. Sammeln Sie die Mikropartikel durch Zentrifugation und waschen Sie sie dann einmal mit einem Milliliter DNase- und RNase-freiem destilliertem Wasser, wie zuvor beschrieben.Wiederholen Sie die Zentrifugation und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie 0,5 Milliliter destilliertes DNase- und RNase-Wasser hinzu und mischen Sie die Mikropartikel durch Vortexen. Anschließend werden die Mikropartikel mit 0,5 Millilitern 100%igem Methanol bei 10 Grad Celsius fünf Minuten lang auf einem ThermoMixer behandelt.Nach dem Sammeln der Mikropartikel durch Zentrifugation behandeln Sie die Partikel mit 100 % Methanol auf dem ThermoMixer bei 750 Umdrehungen pro Minute für 10 Minuten bei 10 Grad Celsius zur Beta-Faltblattbildung. Zentrifugieren Sie die Mischung eine Minute lang bei 0,2 g bei vier Grad Celsius, um Mikropartikel zu sammeln, bevor Sie die Partikel zweimal mit einem Milliliter DNase- und RNase-freiem destilliertem Wasser waschen, wie zuvor gezeigt. Lösen Sie SiO2-Kerne von Mikropartikeln auf, indem Sie 8%ige Flusssäurelösung zu pelletierten Kernschalen-Mikropartikeln hinzufügen.Übertragen Sie die gelösten Partikellösungen auf Dialysegeräte und dialysieren Sie sie in einem Becherglas gegen deionisiertes Wasser. Verwenden Sie dann eine Ein-Milliliter-Pipette, um die Suspension der Seidenmikrokapseln von Dialysegeräten in neue Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu füllen. Übertragen Sie 100 Mikroliter der Mikrokapselprobe in eine einzelne Vertiefung mit Glasobjektträgern mit acht Vertiefungen und lassen Sie die Kapseln 20 bis 30 Minuten lang sedimentieren, bevor Sie mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) bildgeben.Pipettieren Sie 100 Mikroliter der Kapselsuspension in jede Vertiefung eines Glasobjektträgers mit Kammer. Zu jeder Vertiefung fügen Sie nacheinander 300 Mikroliter der Fluorophorlösung mit unterschiedlichen Molekulargewichten vom niedrigsten bis zum höchsten hinzu. Mischen Sie die Mischung, indem Sie auf und ab pipettieren, und lassen Sie die Mischung eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren, bis die Diffusion der Fluorophorlösungen ein Gleichgewicht erreicht hat.Übertragen Sie den Objektträger später auf ein CLSM, um jede Vertiefung mit einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv bei einer Anregungswellenlänge von 488 Nanometern abzubilden. Identifizieren Sie den interessierenden Bereich, indem Sie die Fokusebene anpassen, und fokussieren Sie sich auf die Kapseln, die in Form von Kreisen mit dem größten Durchmesser erscheinen. Führen Sie eine In-vitro-Transkriptions-/Translationsreaktion durch, indem Sie die zellfreien Komponenten nacheinander zu einer Probe von Mikrokapseln hinzufügen und das Röhrchen vier Stunden lang bei 30 Grad Celsius inkubieren.Überprüfen Sie die Fluoreszenz auf einem Platten-Reader mit einer Anregungswellenlänge von 488 Nanometern und einer Emission für GFP/FITC-Filter von etwa 510 Nanometern. Zum Schluss bilden Sie die Seidenmikrokapseln auf dem CLSM-System mit Lasern bei 488 und 561 Nanometern ab. In der Studie wurden robuste Seidenfibroin-Mikrokappen mit einer homogenen Größe von etwa 4,5 Mikrometern und einer Schalendicke von etwa 500 Nanometern hergestellt.Die Permeabilität der hohlen Seidenfibroin-Kapselhüllen wurde nach der Molekulargewichts-Cutoff-Methode analysiert. Eine Erhöhung der Konzentration einer Polyethylenimin-Hauptschicht führt zu einer erhöhten kolloidalen Stabilität von Mikrokapseln mit durchlässigeren Schalen, während die Eliminierung der Hauptschicht zu einer Aggregation von Kapseln mit weniger durchlässigen Schalenmembranen führt. Die GFPa1-Expressionskinetik während der ThyRS-Aktivierung zeigte eine höhere GFPa1-Genaktivierung von DNA-Plasmiden, die in Seidenmikrokapseln geladen wurden, als von nicht verkapselter DNA.In der repräsentativen Analyse sind CLSM-Bilder von Seidenfibroinkapseln, die mit 32 DNA-Kopien pro Kapsel beladen sind, vor und nach der Inkubation im in vitro Transkriptions- und Translationssystem dargestellt. Die Querschnittsintensitätsprofile der Seidenfibroinkapseln zeigten die Expression von GFPa1. Die Transkriptionskinetik von 20 geschichteten Seidenmikrokapseln, die mit 30 DNA-Kopien pro Kapsel beladen waren, wurde mit der nicht verkapselten Kontroll-DNA verglichen.Das höhere Ausgangssignal von Seidenmikrokapseln als von nicht verkapselten DNA-Proben mit äquivalenten Konzentrationen bestätigte die Wirksamkeit von Seidenmikrokapseln. Nach diesem Protokoll können mehrere hochauflösende Mikroskopietechniken angewendet werden, um die DNA-Verschränkung im immobilisierten Zustand und den entkoppelten Genaktivierungsprozess in vitro abzubilden. Diese Technik kann angewendet werden, um die Dynamik auf molekularer Ebene in minimalen künstlichen Zellen zu beantworten.Insbesondere können die Mikrokapseln, wenn sie mit den richtigen Genelementen gekoppelt sind, zur Untersuchung der Zell-zu-Zell-Kommunikation verwendet werden.

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Biologie

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Erfahren Sie die Herstellung von multifunktionalen Seiden-Mikrokapseln mit DNA-Plasmiden für Biosensoren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Genaktivierungskinetiken in biokompatiblen Umgebungen.

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Herstellung von multifunktionalen Mikrokapseln auf Seidenbasis, die mit DNA-Plasmiden beladen sind, die für RNA, Aptamere und Riboschalter kodieren

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