Herstellung von multifunktionalen Mikrokapseln auf Seidenbasis, die mit DNA-Plasmiden beladen sind, die für RNA, Aptamere und Riboschalter kodieren

Die Bedeutung dieses Protokolls besteht darin, dass es ein Mittel bietet, um DNA-kodierte Sensoren funktionsfähig zu halten, indem DNA-Plasmid-Templates in semipermeable biokompatible Mikrokapseln immobilisiert werden. Die vorgeschlagene DNA-Immobilisierungstechnik ist vielseitig. Es ermöglicht die Herstellung von multifunktionalen Biosensoren mit unterschiedlichen in vitro Aktivierungsmechanismen.

Wir stellen uns vor, dass diese Mikrokapseln, gekoppelt mit den richtigen Sensorelementen, verwendet werden könnten, um verschiedene biologische Prozesse zu untersuchen, einschließlich der Freisetzung von Signalmolekülen in verschiedenen Umgebungen wie Biofilmen und Organen. Diese Technik kann Einblicke in die biologischen Systeme auf der Mikroskala geben, insbesondere in die Frage, wie die Immobilisierung von DNA und das molekulare Crowding die Kinetik und den Mechanismus der Genaktivierung beeinflussen können. Beginnen Sie mit der Abscheidung der Polyethylenimin-Grundschicht auf den Opfer-Kieselsäure- oder SiO2-Mikropartikeln, indem Sie einen Milliliter Polyethyleniminlösung zu 300 Mikrolitern der Mikropartikel in einem Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzufügen.

Rühren Sie die Mischung auf einem ThermoMixer mit 800 Umdrehungen pro Minute bei Umgebungsbedingungen. Die Mikropartikel werden durch Zentrifugation bei 0,2 g für eine Minute bei Raumtemperatur aufgefangen und der Überstand vorsichtig entfernt. Nach 15 Minuten werden die Mikropartikel viermal mit einem Milliliter DNase- und RNase-freiem deionisiertem Wasser gewaschen, indem eine Minute lang bei Raumtemperatur bei 0,2 g zentrifugiert wird, wobei der Überstand nach jeder Zentrifugation verworfen wird.

Als nächstes wird die Konzentration der DNA-Plasmide mit DNase- und RNase-freiem destilliertem Wasser von 50 auf 200 Nanogramm pro Mikroliter eingestellt und ein Milliliter der vorbereiteten Lösungen verwendet, um die DNA auf den mit Polyethylenimin geprimten Mikropartikeln abzuscheiden. Rühren Sie die Mikropartikelmischung auf einem ThermoMixer bei vier Grad Celsius und 800 U/min 15 Minuten lang vorsichtig und sammeln Sie die Mikropartikel dann durch Zentrifugation bei 0,2 g für eine Minute. Markieren Sie die Röhrchen für DNA-Plasmide, die für Theophyllin-Riboswitch, gekoppelt mit GFPa1, als ThyRS-GFPa1 kodieren, und DNA-Plasmide, die für Brokkoli-Aptamer kodieren, als BrocApt.

Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und waschen Sie die Mikropartikel viermal mit einem Milliliter DNase- und RNase-freiem destilliertem Wasser, wie zuvor gezeigt, und entsorgen Sie den Überstand nach jeder Zentrifugation. Um die Seidenfibroinschicht abzuscheiden, fügen Sie einen Milliliter der rekonstituierten wässrigen Seidenfibroinlösung zu den DNA-absorbierten Mikropartikeln hinzu und rühren Sie die Mischung auf dem ThermoMixer bei 750 U/min 15 Minuten lang bei 10 Grad Celsius vorsichtig um. Sammeln Sie die Mikropartikel durch Zentrifugation und waschen Sie sie dann einmal mit einem Milliliter DNase- und RNase-freiem destilliertem Wasser, wie zuvor beschrieben.

Wiederholen Sie die Zentrifugation und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie 0,5 Milliliter destilliertes DNase- und RNase-Wasser hinzu und mischen Sie die Mikropartikel durch Vortexen. Anschließend werden die Mikropartikel mit 0,5 Millilitern 100%igem Methanol bei 10 Grad Celsius fünf Minuten lang auf einem ThermoMixer behandelt.

Nach dem Sammeln der Mikropartikel durch Zentrifugation behandeln Sie die Partikel mit 100 % Methanol auf dem ThermoMixer bei 750 Umdrehungen pro Minute für 10 Minuten bei 10 Grad Celsius zur Beta-Faltblattbildung. Zentrifugieren Sie die Mischung eine Minute lang bei 0,2 g bei vier Grad Celsius, um Mikropartikel zu sammeln, bevor Sie die Partikel zweimal mit einem Milliliter DNase- und RNase-freiem destilliertem Wasser waschen, wie zuvor gezeigt. Lösen Sie SiO2-Kerne von Mikropartikeln auf, indem Sie 8%ige Flusssäurelösung zu pelletierten Kernschalen-Mikropartikeln hinzufügen.

Übertragen Sie die gelösten Partikellösungen auf Dialysegeräte und dialysieren Sie sie in einem Becherglas gegen deionisiertes Wasser. Verwenden Sie dann eine Ein-Milliliter-Pipette, um die Suspension der Seidenmikrokapseln von Dialysegeräten in neue Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu füllen. Übertragen Sie 100 Mikroliter der Mikrokapselprobe in eine einzelne Vertiefung mit Glasobjektträgern mit acht Vertiefungen und lassen Sie die Kapseln 20 bis 30 Minuten lang sedimentieren, bevor Sie mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) bildgeben.

Pipettieren Sie 100 Mikroliter der Kapselsuspension in jede Vertiefung eines Glasobjektträgers mit Kammer. Zu jeder Vertiefung fügen Sie nacheinander 300 Mikroliter der Fluorophorlösung mit unterschiedlichen Molekulargewichten vom niedrigsten bis zum höchsten hinzu. Mischen Sie die Mischung, indem Sie auf und ab pipettieren, und lassen Sie die Mischung eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren, bis die Diffusion der Fluorophorlösungen ein Gleichgewicht erreicht hat.

Übertragen Sie den Objektträger später auf ein CLSM, um jede Vertiefung mit einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv bei einer Anregungswellenlänge von 488 Nanometern abzubilden. Identifizieren Sie den interessierenden Bereich, indem Sie die Fokusebene anpassen, und fokussieren Sie sich auf die Kapseln, die in Form von Kreisen mit dem größten Durchmesser erscheinen. Führen Sie eine In-vitro-Transkriptions-/Translationsreaktion durch, indem Sie die zellfreien Komponenten nacheinander zu einer Probe von Mikrokapseln hinzufügen und das Röhrchen vier Stunden lang bei 30 Grad Celsius inkubieren.

Überprüfen Sie die Fluoreszenz auf einem Platten-Reader mit einer Anregungswellenlänge von 488 Nanometern und einer Emission für GFP/FITC-Filter von etwa 510 Nanometern. Zum Schluss bilden Sie die Seidenmikrokapseln auf dem CLSM-System mit Lasern bei 488 und 561 Nanometern ab. In der Studie wurden robuste Seidenfibroin-Mikrokappen mit einer homogenen Größe von etwa 4,5 Mikrometern und einer Schalendicke von etwa 500 Nanometern hergestellt.

Die Permeabilität der hohlen Seidenfibroin-Kapselhüllen wurde nach der Molekulargewichts-Cutoff-Methode analysiert. Eine Erhöhung der Konzentration einer Polyethylenimin-Hauptschicht führt zu einer erhöhten kolloidalen Stabilität von Mikrokapseln mit durchlässigeren Schalen, während die Eliminierung der Hauptschicht zu einer Aggregation von Kapseln mit weniger durchlässigen Schalenmembranen führt. Die GFPa1-Expressionskinetik während der ThyRS-Aktivierung zeigte eine höhere GFPa1-Genaktivierung von DNA-Plasmiden, die in Seidenmikrokapseln geladen wurden, als von nicht verkapselter DNA.

In der repräsentativen Analyse sind CLSM-Bilder von Seidenfibroinkapseln, die mit 32 DNA-Kopien pro Kapsel beladen sind, vor und nach der Inkubation im in vitro Transkriptions- und Translationssystem dargestellt. Die Querschnittsintensitätsprofile der Seidenfibroinkapseln zeigten die Expression von GFPa1. Die Transkriptionskinetik von 20 geschichteten Seidenmikrokapseln, die mit 30 DNA-Kopien pro Kapsel beladen waren, wurde mit der nicht verkapselten Kontroll-DNA verglichen.

Das höhere Ausgangssignal von Seidenmikrokapseln als von nicht verkapselten DNA-Proben mit äquivalenten Konzentrationen bestätigte die Wirksamkeit von Seidenmikrokapseln. Nach diesem Protokoll können mehrere hochauflösende Mikroskopietechniken angewendet werden, um die DNA-Verschränkung im immobilisierten Zustand und den entkoppelten Genaktivierungsprozess in vitro abzubilden. Diese Technik kann angewendet werden, um die Dynamik auf molekularer Ebene in minimalen künstlichen Zellen zu beantworten.

Insbesondere können die Mikrokapseln, wenn sie mit den richtigen Genelementen gekoppelt sind, zur Untersuchung der Zell-zu-Zell-Kommunikation verwendet werden.