Anpassung gastrointestinaler Organoide für Pathogeninfektionen und Einzelzellsequenzierung unter Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3)

Dieses Protokoll ermöglicht es uns zu verstehen, wie einzelne Zelltypen im menschlichen Darmepithel auf eine Virusinfektion reagieren. Wir stellen hier drei unabhängige Wege vor, um menschliche Darmorganoide zu säen, um zu untersuchen, wie sich der Infektionsweg auf die Reaktion der Zelle auswirken kann. Wir zeigen auf, wie Proben für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung unter Berücksichtigung der Biosicherheitsvorschriften vorbereitet werden können, die bei der Arbeit mit Pathogenen der Kategorie 3 eingehalten werden müssen.

Diese Methode kann leicht an andere Krankheitserreger und Organoidkulturen angepasst werden. Die wichtigste Überlegung ist, sicherzustellen, dass Ihre Organoidmodelle vollständig mit der gewählten Seeding-Methode differenziert sind und eine Virusinfektion unterstützen können. Entfernen Sie vor der Entnahme der infizierten Organoide die einzelligen Gelperlen von minus 80 Grad Celsius und erwärmen Sie sie auf Raumtemperatur.

Zusätzlich das RT-Reagenz, das Reduktionsmittel B und das RT-Enzym C auf Raumtemperatur ausgleichen und das Template-Switch-Oligo wie in den Anweisungen des Herstellers beschrieben resuspendieren. Um 3D-Organoide zu sammeln, die mit dem BSL-3-Erreger infiziert sind, entfernen Sie anschließend die Zellkulturplatte aus dem Inkubator und legen Sie sie in die Zellkulturhaube. Entfernen Sie dann mit einer P1000-Pipette das Differenzierungsmedium aus jeder Vertiefung der 24-Well-Platte, geben Sie 500 Mikroliter eiskaltes PBS zu jedem Bohrloch hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für drei Minuten.

Als nächstes, um die extrazelluläre Matrixlösung vollständig zu stören, pipettieren Sie 10 Mal auf und ab, um das PBS, die extrazelluläre Matrix und die Organoide zu resuspendieren, dann übertragen Sie die resuspendierten Organoide in ein 15 Milliliter konisches Rohr und legen Sie die Röhrchen auf Eis. Sammeln Sie jeden Infektionszustand in separaten konischen 15-Milliliter-Röhrchen. Reinigen Sie nach dem Wechseln der Handschuhe die Außenseite des Röhrchens und entfernen Sie das Röhrchen aus der Zellkulturhaube.

Drehen Sie die Proben fünf Minuten lang. Bewegen Sie das Röhrchen zurück in die Zellkulturhaube und entfernen Sie das PBS, um eine Resuspension des Organoidpellets vom Boden des Röhrchens zu vermeiden. Als nächstes resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Dissoziationsenzym.

Wechseln Sie dann die Handschuhe, reinigen Sie das Röhrchen und inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Bewegen Sie während der Inkubation die Röhre alle 10 Minuten zurück in die Zellkulturhaube und resuspenieren Sie die Organoide durch Pipettieren auf und ab. Um festzustellen, ob die Organoide in einzelne Zellen dissoziiert sind, legen Sie 10 Mikroliter der Organoidsuspension mit einer P10-Pipette in einen Einweg-Kunststoffzellzähler und versiegeln Sie dann den Probeneingangsanschluss mit durchsichtigem Klebeband.

Reinigen Sie nach dem Wechseln der Handschuhe die Außenseite des Zellzählers und bestätigen Sie mit einem Hellfeldmikroskop, dass eine einzelne Zellsuspension erstellt wurde. Nach Bestätigung der Einzelzellsuspension stoppen Sie den Aufschluss, indem Sie einen Milliliter DMEM F12-Medien mit 10% FBS hinzufügen und 10 Mal nach oben und unten pipettieren. Wechseln Sie dann die Handschuhe, reinigen Sie das Röhrchen und drehen Sie die Probe.

Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig das Medium, das das Dissoziationsenzym enthält, und achten Sie darauf, das Zellpellet am Boden nicht zu stören. Dann resuspendieren Sie die einzelnen Zellen in einem minimalen Volumen von PBS, das 0,1% BSA enthält. Nachdem Sie die Zellsuspension durch einen Filter in ein FACS-Röhrchen geleitet haben, um große Klumpen zu entfernen, legen Sie das Röhrchen auf Eis.

Um die Anzahl der Zellen pro Mikroliter zu bestimmen, fügen Sie als Nächstes 10 Mikroliter der Zellsuspension in eine Einweg-Plastikzellzählkammer hinzu. Verschließen Sie dann den Probeneingangsanschluss mit durchsichtigem Klebeband, bevor Sie die Probe aus der Zellkulturhaube entfernen. Wechseln Sie die Handschuhe, reinigen Sie die Zellzählkammer und zählen Sie dann die Anzahl der Zellen mit einem Hellfeldmikroskop.

Bereiten Sie als Nächstes in der Zellkulturhaube eine Mastermischung aus RT-Reagenz, Template-Switch-Oligo, Reduktionsmittel B und RT-Enzym C in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen gemäß den Anweisungen des Herstellers vor, abhängig von der Anzahl der Proben im Experiment. Für jede Probe aliquot 33,4 Mikroliter Mastermischung in ein PCR-Röhrchen geben, dann die Zellen und Wasser entsprechend der Zielzellzahl in die Mastermischung geben. Nachdem Sie die Handschuhe gewechselt haben, bewegen Sie den Einzelzellcontroller in die Zellkulturhaube und bereiten Sie den Chip vor.

Als nächstes fügen Sie den Einzelzellenchip in den Chiphalter ein und füllen Sie die unbenutzten Bahnen mit 50% Glycerin. Fügen Sie die Mastermischung, die Perlen und das Trennfett gemäß den Anweisungen des Herstellers zu den Bahnen hinzu, die Proben enthalten, und bedecken Sie den Chip mit einer Dichtung. Nachdem Sie den Chip in den Controller geladen haben, starten Sie das Programm.

Entfernen Sie nach Abschluss des Programms den Chip und die Dichtung und übertragen Sie dann mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter der Emulsionen in saubere PCR-Röhrchen. Stellen Sie sicher, dass jede Emulsion eine gleichmäßige weiße Farbe hat, die anzeigt, dass eine vollständige Emulsion stattgefunden hat. Nachdem Sie die Handschuhe gewechselt und die Röhrchen gereinigt haben, übertragen Sie die PCR-Röhrchen auf eine PCR-Maschine und starten Sie das Programm.

Am Ende des PCR-Laufs werden die meisten behüllten Viren inaktiviert. Die repräsentativen Hellfeldbilder an den Tagen eins, drei, fünf und sieben nachspaltenden Organoiden sind hier zu sehen. Im Durchschnitt werden die Organoide einmal pro Woche gespalten, wenn die Zentren dunkel werden.

Durch die Veränderung der Medienbedingungen, die Entfernung von Wnt-3a und die Reduzierung von R-Spondin und Noggin kann die zelluläre Komplexität im menschlichen Darm nachgeahmt werden. Normalerweise erfordert die zelluläre Differenzierung in Richtung Paneth-Zellen, Kelchzellen und Enterozyten vier Tage Differenzierungsmedien. Die Analyse von Einzelzellsequenzierungsdaten von SARS-CoV-2-infizierten menschlichen Dickdarm- und Ileum-abgeleiteten Organoiden zeigte, dass nur eine Subpopulation menschlicher Darmepithelzellen die Infektion von SARS-CoV-2 nach 12 und 24 Stunden unterstützte.

Die Analyse der angeborenen Immunantworten in SARS-CoV-2-infizierten Darmorganoiden zeigte, dass SARS-CoV-2 eine entzündungsfördernde Signalkaskade in infizierten Zellen induzierte, während nicht infizierte Umstehende eine Interferon-vermittelte Immunantwort zeigten. Darüber hinaus zeigte die Einzelzell-RNA-Sequenzierung, dass infizierte Zellen aufgrund einer virusvermittelten Blockade des Signalwegs keine Interferone wahrnehmen konnten. Die Organoide müssen gut differenziert und gesund sein.

Dies kann kontrolliert werden, indem das Niveau der Zelldifferenzierungsmarker durch qPCR vor der Infektion bestimmt wird. Wenn die Zellen nicht gut differenziert sind, unterstützen sie keine Virusinfektion und führen zu uninformativen Ergebnissen. Diese Technik ermöglicht es uns, die Schleimhaut sowohl von der Luminal- als auch von der Gewebeseite zu infizieren.

Dies ist sehr wichtig, da es uns ermöglicht, Mechanismen zu entschlüsseln, die von Schleimhautoberflächen verwendet werden, um eine schmutzige Umgebung auf der einen Seite und eine sterile auf der anderen Seite zu tolerieren.