Name: Direkte Kraftmessungen der subzellulären Mechanik im Einschluss mit optischen Pinzetten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit optischen Pinzetten direkte Kraftmessungen an Zellkernen embryonaler Zebrafischzellen durchführen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung subzellulärer Mechanik ohne Störung der Membran.

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MK würdigt die finanzielle Unterstützung des spanischen Ministeriums für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit durch den Plan Nacional (PGC2018-097882-A-I00), FEDER (EQC2018-005048-P), Severo Ochoa Programm für Exzellenzzentren in F&E (CEX2019-000910-S; RYC-2016-21062), von der Fundació Privada Cellex, der Fundació Mir-Puig und der Generalitat de Catalunya durch das CERCA- und Forschungsprogramm (2017 SGR 1012), zusätzlich zur Finanzierung durch ERC (MechanoSystems) und HFSP (CDA00023/2018). V.R. würdigt die Unterstützung des spanischen Ministeriums für Wissenschaft und Innovation für die EMBL-Partnerschaft, das Centro de Excelencia Severo Ochoa, den Plan Nacional von MINECO (BFU2017-86296-P, PID2020-117011GB-I00) und die Generalitat de Catalunya (CERCA). V.V. erkennt die Unterstützung des ICFOstepstone PhD-Programms an, das vom Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Finanzhilfevereinbarung 665884 finanziert wird. Wir danken Arnau Farré für die kritische Lektüre des Manuskripts; Maria Marsal für die Hilfe bei der Bildgebung und Montage des 24 hpf Embryos und; Senda Jiménez-Delgado für die Unterstützung bei Zebrafisch-Mikronjektionen.

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

In diesem Protokoll beschreiben wir eine einzigartige Methode, um die mechanischen Eigenschaften des Zellkerns in den lebenden Zellen zu untersuchen. Im Gegensatz zu anderen Techniken der Kraftspektroskopie ermöglichte uns das nicht-invasive optische Trapping, den Beitrag der Zellmembran und des Zytoskeletts von der Zellkernsteifigkeit zu entkoppeln. Wichtig ist, dass die optische Mikromanipulation mit der multimodalen Mikroskopie kompatibel ist, die es dem Experimentator ermöglicht, verschiedene Prozesse zu untersuchen, die an der zellkernden Mechanobiologie beteiligt sind. Als repräsentatives Ergebnis haben wir die DNA-Hoechst-Färbung verwendet, um die Kernverformung beim Einrücken durch Kräfte in der Größenordnung von mehreren hundert picoNewton zu messen.
Mögliche Anwendungen unserer Methode über die in diesem Protokoll beschriebenen Beispiele hinaus Die Möglichkeit, quantitative mechanische Informationen aus Messungen in lebenden Zellen ohne äußere Störungen zu extrahieren, ermöglicht eine Fülle beispielloser Möglichkeiten, die gerade erst erforscht werden. Somit kann das vorgestellte Protokoll unserer optischen Mikromanipulationsplattform mit großer Vielseitigkeit auf komplexere Experimente ausgeweitet werden. Akusto-optische Deflektoren (AOD) können mehrere optische Fallen für synchrone Kraftmessungen über verschiedene Zellstandorte hinweg erzeugen sowie für die aktive Mikrorheologie in einem weiten Frequenzbereich51,61 verwendet werden. Wie bereits erwähnt, kann die Kraftreaktion beim Einrücken die maximale Fangkraft überwinden, was zu einem Entweichen der Perle aus der optischen Falle führt. In diesem Fall kann mit dem AOD eine Kraftrückmeldung konfiguriert werden, um die optische Kraft einzuklemmen. Alles in allem können mit dieser Plattform mehrere mikrorheologische Ansätze, wie die in diesem Protokoll beschriebene Spannungsrelaxation, aber auch aktive Mikrorheologie oder Kriechkonformität experimentell gewonnen und durch neuartige Softwarepakete gründlich analysiert werden61,62,63,64,65 . Darüber hinaus ist die Anwendung von Kräften nicht auf den Zellkern beschränkt, sondern könnte prinzipiell durchgeführt werden, um verschiedene intrazelluläre Strukturen und in komplexen Geweben zu messen, wie es sich gezeigt hat, um fließende rote Blutkörperchen in intakten Blutgefäßen einzufangen66,67 oder Chloroplasten und Mitochondrien einzufangen und zu verformen68 . Die Licht-Impuls-Kalibrierung ist unabhängig von der Form und Größe des eingeschlossenen Objekts und ermöglicht somit direkte Kraftmessungen an jeder Kraftsonde mit beliebiger Form38,39. Die Verwendung von injizierten Mikrosphären ermöglichte es uns, hohe Kräfte auf den Kern mit relativ geringer Laserleistung im Vergleich zur direkten Manipulation zellulärer Strukturen anzuwenden69,70,71. Bei einer ausreichend hohen Brechungsindexdifferenz ist jedoch keine extern angelegte Kraftsonde erforderlich und intrazelluläre Organellen können direkt ohne injizierte Kügelchen manipuliert werden (unveröffentlichte Beobachtungen und Referenz70).
Mögliche Modifikationen unserer Methode zur Erweiterung der Anwendungen Je nach Experiment können unterschiedliche Größen von Mikrokügelchen injiziert werden, aber die relativen Kontrollen müssen durchgeführt werden. Zum Beispiel, um Zellen in späteren Stadien zu untersuchen, können kleinere Perlen injiziert werden. Dadurch wird die maximale Kraft reduziert, die von der optischen Falle ausgeübt werden kann (wie in Referenz55 gezeigt). Größere Perlen können injiziert werden, um höhere Kräfte auszuüben, aber diese können die Embryonalentwicklung je nach Größe oder Stadium des Interesses beeinflussen. In Experimenten, bei denen eine Mikroperleninjektion keine Option ist, können verschiedene Organellen, die Brechungsindizes aufweisen, die Unterschiede zu denen des Zytoplasmas aufweisen, immer noch optisch manipuliert werden, was zu optischen Kräften führt, die durch Lichtimpulsänderungen messbar sind42. Wie bereits erwähnt, wurden diese Methoden von Bambardekar et al. eingesetzt, um Zell-Zell-Verbindungen im Drosophila-Embryo zu verformen70. Ebenso hat der Zellkern einen niedrigeren Brechungsindex als der umgebende Medium44, was eine perlenfreie Einrückung (unveröffentlichte Beobachtungen und Referenz72) ermöglicht, wenn auch mit einer geringeren Fangstärke. So kann der Kern nicht leicht eingeschlossen werden und entkommt der Falle.
Der spinbeschichtete PDMS-Abstandhalter wird mit einer bequemen und schnellen Methode hergestellt, ist aber für Labore ohne Zugang zu einer Mikro-/Nanofabrik oder technischen Labors möglicherweise unerreichbar. Somit kann der Abstandhalter einfach aus Laborband oder Parafilm zusammengesetzt werden (Schritt 4). Das Protokoll kann auch angepasst werden, indem mikrofluidische Kanäle hergestellt werden, die die Lieferung einzelner Zellen in vordefinierte Messtöpfe oder in eine Kammer mit einer definierten Höhe automatisieren, um den Einschlusseffekt innerhalb derselben Probe abzuschätzen. Solche mikrofluidischen Vorrichtungen müssen jedoch so ausgelegt sein, dass sie in den Raum zwischen dem Mikroskopobjektiv und der Sammellinse des optischen Kraftsensors von etwa 2 mm passen (siehe Schritt 3). Beachten Sie, dass der optische Kraftsensor in der entsprechenden Höhe positioniert werden muss, damit keine optischen Aberrationen durch Defokussierung die Photonenimpulsmessung beeinflussen.
Andere Änderungen könnten den Wechsel von biologischen Reportern beinhalten. Wir fanden heraus, dass die Hoechst-Fluoreszenz spektral in den GFP-Kanal blutet und wir daher die Kombination mit mCherry-markiertem Histon als Kernmarker für die gleichzeitige Messung in zwei Fluoreszenzkanälen bevorzugen. Alternativ kann die Kernverformung leicht mit einem auf die innere Kernmembran ausgerichteten Etikett wie Lap2b-GFP verfolgt werden (Abbildung 2).
Die Eindringung auf den Zellkern lag in der Größenordnung von 2-3 Mikrometern, die wir durch Bildanalyse der beugungsbegrenzten Spinnscheiben-Konfokalmikroskopie genau messen konnten. Bei steiferen Kernen oder kleineren Kräften ist die Vertiefung mit diesem Ansatz kaum messbar. Die absolut kraftkalibrierte optische Pinzette kann aber auch für Positionsmessungen der gefangenen Perle in situ mittels BFP-Interferometrie mit Nanometergenauigkeit kalibriert werden51. Mit diesem Ansatz können das Spannungssignal und der optische Kraftsensor durch den Parameter β [nm/V] in die Position der eingeschlossenen Sonde übersetzt werden, während der invariante Parameter α [pN/V] durch die bereits erwähnte Licht-Impuls-Kalibrierung41 Kraftwerte liefert (Details siehe unten).
Fehlerbehebung Wir fanden heraus, dass die folgenden Herausforderungen während des Experiments auftreten konnten:
Es bildet sich keine stabile Falle und die Mikrosphäre entweicht leicht Jeder Schmutz auf dem Mikroskopobjektiv oder ein falsch ausgerichteter Korrekturkragen kann zum Versagen einer stabilen Falle führen. Wenn keine sofortige Lösung gefunden wird, messen Sie die Punktspreizfunktion der Objektivlinse. Wenn sich die interessierende Probe tief in einem optisch dichten Gewebe befindet, kann der Laserfokus schwere optische Aberrationen aufweisen, die zu instabilem Einfangen führen (dieser Effekt ist in isolierten Zellen normalerweise vernachlässigbar, wird aber in dickeren Geweben deutlicher). Bei hoher Steifigkeit könnte die Rückstellkraft des Kerns die Fluchtkraft der Falle übersteigen, so dass die Mikrosphäre verloren geht und die Eindringroutine versagt. Anfangs wird der Kernmembranrand proximal zur optischen Falle kaum eingerückt (Abbildung S2A). In diesem Fall wird der Trapping-Laser nicht mehr durch Kraft und Brownsche Bewegung beeinflusst, was zu einem Kraftabfall auf Null und einer Abnahme des Signalrauschens führt (Abbildung S2B). In diesem Fall kann die Laserleistung erhöht werden, um eine stärkere Falle zu haben, die Amplitude der trapezförmigen Flugbahn, die die Perle in den Kern drückt, kann reduziert werden, oder die Ausgangsposition der eingeschlossenen Mikroperle kann weiter vom Kern entfernt sein.
Die Zelle bewegt sich während der Stimulation Wenn Zellen nicht ausreichend gebunden sind, bewegt die optische Gradientenfalle die Zellen während der intrazellulären Eindringroutine, so dass die Kräfte und die zugrunde liegende Mechanik des Kerns artefaktisch sind. Um eine Verschiebung der gesamten Zelle zu verhindern, empfehlen wir, die Konzentration von Zelladhäsionsmolekülen auf der Oberfläche, z.B. ConA, zu erhöhen.
Anfängliche Momentumkompensation Wenn eine anfängliche Impulskompensationsroutine in der OTs-Plattform nicht verfügbar ist (Schritt 6.5), muss ein künstliches, kraftunabhängiges Basissignal korrigiert werden. Dies ist als Steigung auf der Kraftkurve sichtbar, auch wenn keine Wulst eingeklemmt ist (Abbildung S1E). Um die Korrektur durchzuführen, muss die gleiche Trajektorie ohne Perle außerhalb der Zelle an genau der gleichen Position durchgeführt werden. Verschieben Sie dazu die Zelle mithilfe des Stufensteuerelements von der Trap weg. Als Referenz ändert sich der Kraftversatz um 5 pN über das Sichtfeld bei 200 mW in unserem System; Daher wird es für kurze Trajektorien vernachlässigbar. Alternativ kann ein Piezo-Scan-Tisch verwendet werden, um die Zellen auf der Probe zu bewegen, wobei die Laserposition konstant bleibt.
Kritische Schritte des vorgestellten Protokolls Mikrosphären sollten im rechten 1-Zell-Stadium injiziert werden, um eine maximale Verteilung über den Embryo zu gewährleisten. Perlen sollten nicht fluoreszierend sein, damit kein Licht in die für die Bildgebung verwendeten Fluoreszenzkanäle gelangt. So sind aufgrund ihrer Helligkeit (Anregung: 405 nm; Emission: 445 nm) sogar typische rot fluoreszierende Kügelchen deutlich sichtbar im Blaukanal, der zur Abbildung des Zellkerns nach der Hoechst-Färbung verwendet wird. Eine stabile Befestigung der Zelle am Substrat ist entscheidend, um eine laterale Verschiebung während der Eindringroutine zu verhindern. Bewegt sich die Zelle während der Routine, werden Kräfte unterschätzt. Sollte dies häufig vorkommen, optimieren Sie das Anhangsprotokoll. Für Gewebekulturzellen führen andere Zelladhäsionsproteine wie Fibronektin, Kollagen oder Poly-L-Lysin zu einer zufriedenstellenden Bindung (unveröffentlichte Beobachtungen). Während des Einschlusses sind die Zellen einer plötzlichen und starken mechanischen Belastung ausgesetzt. Dies kann zu Schäden an den Zellen führen und häufig trifft der Experimentator auf geplatzte Zellen, wenn der Vorgang nicht sorgfältig durchgeführt wird. Wenn die Einschlusshöhe zu klein ist, leiden alle Zellen unter Kernumhüllungsbruch oder irreversiblen Schäden. Um diese zu mildern, senken Sie den oberen Deckslip langsamer ab und/ oder vergrößern Sie den Abstand zwischen den Deckblättern.
Einschränkungen der Technik und Vorschläge, um sie zu überwinden Eine klare Einschränkung der Technik ist das Eindringen des Laserlichts in tiefe Gewebeabschnitte, was zu Aberrationen und instabilem Einfangen führt. Somit hängt eine untere Grenze der Eindringtiefe von der Klarheit der Probe, der anzuwendenden Aberrationskorrektur73 und der eingesetzten Laserleistung ab. Es sollte berücksichtigt werden, dass eine höhere Laserleistung zu einer thermischen Anregung der Probe in der Nähe der Mikrosphäre führt. Die Erwärmung der Probe durch den Laserspot mit einer Wellenlänge von 1064 nm wird jedoch minimiert, um eine plausible hitzebedingte Belastung unserer biologischen Proben zu vermeiden74.
Eine weitere Einschränkung ist die maximale Kraft, die gemessen werden kann. Obwohl die direkte Lichtimpulsdetektion Kraftmessungen weit über das lineare Ansprechregime der optischen Falle40,41 hinaus ermöglicht, liegt die maximal aufgebrachte Kraft in der Größenordnung von einigen hundert picoNewton. Begrenzt wird dies durch die Laserleistung und die Folgeschadensschwelle von weichem biologischem Material sowie die Brechungsindexdifferenzen, die normalerweise nicht größer als 0,1 oder 0,344 sind. Mehrere Methoden wurden vorgeschlagen, um die Kraftnachweisgrenze zu erhöhen, z. B. mit strukturiertem Licht75, entspiegelten Mikrokugeln76, Partikeln mit hohem Brechungsindex77 oder hochdotierten Quantenpunkten78.
OTs können für Positionsmessungen im Nanometerbereich durch BFP-Interferometrie verwendet werden, so dass die Position der Perle innerhalb der Falle Δx = β Sx ist, wobei Sx das Spannungssignal des Sensors ist und β [μm/V] on-the-fly nach verschiedenen Protokollen kalibriert werden kann35,54. Für einen optischen Kraftsensor kann nachgewiesen werden, dass sich der Spannungs-Kraft-invariante Umrechnungsfaktor α [pN/V] direkt auf β und die Fallensteifigkeit k [pN/μm] bis α = kβ 37 bezieht. Ein Beispiel ist die Anwendung der hier vorgestellten experimentellen Routinen auf sehr steife Kerne, für die Kräfte bei vernünftigen Laserleistungen (200-500 mW) nicht ausreichen, um Eindringwerte zu induzieren, die groß genug sind. In diesem Fall muss die Perle mit dem Kern in Kontakt gebracht und die Fangsteifigkeit vor der Messung kalibriert werden (Schritt 8.6). Der Einzug d des Kerns als Funktion der Kraft kann indirekt bestimmt werden als:
d = xtrap - F/k
wobei xtrap die Trap-Position ist. Anders als der invariante Lichtimpulsfaktor α [pN/V] muss der Faktor β [μm/V] vor jedem Experiment kalibriert werden, da er von vielen lokalen Variablen abhängt, die die Überfangdynamik bestimmen, wie z. B. der Partikelgröße, der Größe des optischen Trap-Spots und der relativen Brechungsindizes.

Die Gewebemorphogenese ist ein komplexer Prozess, bei dem biochemische Signale und physikalische Kräfte räumlich zeitlich koordiniert werden. Im sich entwickelnden Embryo diktieren Gradienten biochemischer Signalfaktoren die Schicksalsspezifikation und gewährleisten eine korrekte Gewebestrukturierung1,2. Gleichzeitig spielen intrinsische und extrinsische Kräfte eine Rolle beim Aufbau der Architektur des Embryos3,4. Der Einfluss der Zellkortexmechanik in diesem Zusammenhang wurde ausführlich untersucht5,6. Die enge Verbindung zwischen mechano-chemischen Prozessen während der Morphogenese beruht auf den Eigenschaften einzelner Zellen, mechanische Kräfte in ihrer Gewebemikroumgebung zu erfassen und darauf zu reagieren. Zellen entschlüsseln dabei mechanische Signale durch das Vorhandensein kraftempfindlicher subzellulärer und molekularer Elemente, die mechanische Informationen in spezifische Signalwege umwandeln, die das Zellverhalten, das Zellschicksal und die Zellmechanik steuern.
Ein Kennzeichen von Entwicklungsprozessen ist, dass sich Zellen als Gruppen organisieren, um mehrzellige Strukturen aufzubauen. Daher ordnen sich einzelne Zellen selten neu an und bewegen sich allein, sondern sind in einem engen Soziotop assoziiert, in dem sie kollektives Verhalten wie suprazelluläre Migration7, (Un-)Jamming-Übergänge8,9 oder Blastozystenverdichtung10 zeigen. Mechanische Kräfte, die innerhalb und zwischen Zellen erzeugt werden, dienen als wichtige Hinweise, um die kollektive Zelldynamik zu bestimmen7,11. Aber selbst wenn sich Zellen alleine bewegen, wie z.B. Vorläuferzellen, die sich zwischen Gewebeblättern oder engen Gewebenischen quetschen, erfahren sie beim Navigieren in einer dreidimensionalen Umgebung umfangreiche anisotrope mechanische Kräfte. Diese mechanischen Belastungen der Zellen haben tiefgreifende Auswirkungen auf das Zellverhalten12,13. Es wurden mehrere Mechanismen untersucht, die auf dem Kern als Hauptelement der Mechanotransduktion zusammenlaufen14,15, als passives oder aktives mechanisches Element während der Migration innerhalb einer dichten 3D-Gewebeumgebung15,16.
Wir haben kürzlich einen Mechanismus vorgeschlagen, der Zellen ausrüstet, um Formverformungen zu messen, wobei der Kern als elastischer intrazellulärer Mechano-Gauge verwendet wird12. Der Kern, der die größte Organelle in einer Zelle ist, erfährt große Verformungen, wenn Zellen polarisieren, wandern oder ihre Form unter mechanischer Dehnung, Enge oder osmotischem Stress ändern16,17,18,19. Wir fanden heraus, dass die Kernhüllendehnung zusammen mit der intrazellulären Positionierung des Kerns den Zellen Informationen über das Ausmaß und die Art der Zelldeformation (wie Zellkompression versus Zellschwellung) liefert. Die Dehnung des Zellkerns ist mit einer Entfaltung der inneren Kernmembran (INM) verbunden, die die kalziumabhängige cPLA2-Lipase-Aktivität (zytosolische Phospholipase A2) am INM fördert, gefolgt von der Freisetzung von Arachidonsäure (AA) und einer schnellen Aktivierung von Myosin II am Zellkortex. Dies führt zu einer erhöhten Zellkontraktilität und amöboiden Zellmigration oberhalb einer Schwelle der kortikalen Kontraktilität6. Die mechanosensitive Reaktion auf Zelldeformation tritt in weniger als einer Minute auf und ist bei Derentriegelung reversibel, was darauf hindeutet, dass der Kern als Dehnungsmessstreifen für die zelluläre Propriozeption fungiert, die das adaptive Zellverhalten unter mechanischen Stressbedingungen reguliert. Es wird gezeigt, dass dieser mechanosensitive Signalweg in Vorläuferstammzellen aus Zebrafischembryonen sowohl in pluripotenten als auch in liniengebundenen Zellen aktiv ist12 und in verschiedenen Spezies und Zelllinien konserviert ist20.
Zusätzlich zu den kernigen Eigenschaften als Zell-Mechanosensor werden Kernarchitektur und -mechanik während der Entwicklung und als Reaktion auf die Zellschicksalspezifikation intrinsisch reguliert21, wodurch die zelluläre Mechano-Empfindlichkeit abgestimmt wird22,23. Die Folge könnte eine Änderung der nuklearen Compliance sein, die morphologische Veränderungen und Übergänge von einem prämigratorischen zu einem migrationären Zustand und umgekehrt ermöglicht8.
Es wurden mehrere Techniken zur Messung der Zellkernmechanik angewandt, wie z. B. Rasterkraftmikroskopie24,25, Mikropipettenaspiration26,27, mikrofluidische Technologie28 und Mikronadeln29. Viele dieser Techniken sind jedoch invasiv in dem Sinne, dass die gesamte Zelle deformiert werden muss, was die Messung der mechanischen Eigenschaften und kraftabhängigen Reaktionen des Kerns selbst einschränkt. Um die gleichzeitige Verformung der Zelloberfläche und ihres mechanosensitiven Zellkortex30 zu umgehen, wurden isolierte Kerne in verschiedenen Kontexten untersucht31,32. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass die nukleare Isolation mit einer Veränderung der mechanischen Kerneigenschaften und ihrer Regulation verbunden ist (Referenz24 und eigene unveröffentlichte Beobachtungen).
Optische Pinzetten (OTs) sind eine vielseitige Technologie, die eine Fülle von Experimenten in der Zellmekanalobiologie ermöglicht hat und maßgeblich zu unserem Verständnis beigetragen hat, wie molekulare Maschinen chemische in mechanische Energie umwandeln33,34. Optische Pinzetten verwenden einen eng fokussierten Laserstrahl, um optische Kräfte auf dielektrische Partikel auszuüben, deren Brechungsindex höher ist als der des umgebenden Mediums33. Solche Kräfte können in der Größenordnung von Hunderten von Pico-Newton liegen und zu einer effektiven Eingrenzung des Teilchens innerhalb des Laserfallenfokus führen, was eine Manipulation des gefangenen Teilchens in drei Dimensionen ermöglicht. Die Verwendung von Licht hat einen wichtigen Vorteil, da die Messung nicht-invasiv in lebenden Zellen durchgeführt werden kann. Optische Manipulationen beschränken sich weiter auf den Fallenfokus des Laserstrahls. Daher kann die Manipulation ohne Stimulation der umgebenden Zellmembranen durchgeführt werden und stört nicht den Aktinkortex oder mechanosensitive Prozesse an der Plasmamembran, wie z.B. die kraftabhängige Aktivierung von Ionenkanälen.
Die Schwierigkeit des optischen Pinzettenansatzes besteht darin, die auf die Mikrosphäre ausgeübten Kräfte mit klassischen Ansätzen genau zu bestimmen, die auf der kalibrierten indirekten Kraft basierend auf dem Äquipartitionstheorem oder der Verwendung definierter Stokes-Widerstandskräfte zur Messung einer laserleistungsabhängigen Fluchtkraft beruhen35. Während diese Methoden in einem In-vitro-Experiment einfach umzusetzen sind, können sie in der Regel nicht in eine zelluläre Umgebung übersetzt werden. Es wurden mehrere Strategien in das Feld eingeführt, die auf einer direkten Kraftkalibrierung beruhen, die aus den ersten Prinzipien der Impulserhaltung abgeleitet wurde36,37. Im Gegensatz zu anderen Kraftspektroskopie-Ansätzen werden Kraftmessungen aus einem lokalen Austausch des Lichtimpulses mit dem beliebig geformten gefangenen Teilchen abgeleitet38,39. In unserem Versuchsaufbau werden Änderungen des Lichtimpulses, die durch optische Kräfte entstehen, direkt gemessen, ohne dass eine In-situ-Trap-Kalibrierung erforderlich ist40,41,42,43. So werden die Messungen in einer viskosen Umgebung wie dem Inneren der Zelle oder sogar innerhalb eines Gewebes möglich und Kräfte können leicht bis auf die pN-Ebene quantifiziert werden.
In diesem Protokoll beschreiben wir einen Assay zur mechanischen Manipulation intrazellulärer Organellen oder Strukturen und zur quantitativen Beurteilung ihrer mechanischen Eigenschaften durch einen optischen Pinzettenaufbau. Dieser Aufbau ist in ein rotierendes Scheibenfluoreszenzmikroskop integriert, das eine parallele Abbildung des zellulären Verhaltens oder der intrazellulären Dynamik ermöglicht. Der Assay ermöglicht die Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften bestimmter zellulärer Kompartimente, wie z.B. des Zellkerns, und untersucht gleichzeitig die mögliche Mechanoresponse und Aktivierung molekularer Signalwege als Folge der Verformung selbst. Darüber hinaus ermöglicht das optische Einfangen von injizierten Mikrokügelchen in Zellen eine Erhöhung der Eindringkraft dank eines deutlich höheren Brechungsindex der Polystyrolperle (n = 1,59) im Vergleich zum intrinsischen Brechungskontrast44 des Kerns (n ~ 1,35) gegenüber Zytoplasma (n ~ 1,38). Die vorgestellte Strategie kann leicht an die Untersuchung anderer intrazellulärer Strukturen und Organellen sowie an andere Ansätze angepasst werden, die aktive Mikrorheologie, die Verwendung mehrerer optischer Fallen zur gleichzeitigen Untersuchung der gleichen / unterschiedlichen subzellulären Strukturen und Messungen zur Zellmechanobiologie im lebenden Embryo umfassen.

<table><tbody><tr><td>#1.5 22 mm Deckgläser</td><td>Ted Pella</td><td>260148</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 22x60 mm Deckgläser</td><td>Ted Pella</td><td>260152</td><td></td></tr><tr><td>#1.5H Glasbodenschalen</td><td>Willco</td><td>GWST-5040</td><td></td></tr><tr><td>10 μm Kügelchen</td><td>Supelco</td><td>72986</td><td></td></tr><tr><td>1 mm Glaskapillaren</td><td>Harvard Apparat</td><td>30-0020 GC100F-15</td><td></td></tr><tr><td>1 μm Polystyrol Mikrokügelchen</td><td>Sigma</td><td>89904</td><td></td></tr><tr><td>1 μm rot fluoreszierende Kügelchen</td><td>ThermoFisher</td><td>F8816</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Aqcuisition Kameras sCMOS</td><td>Andor</td><td>Sona-4BV11-UNI</td><td></td></tr><tr><td>Zusatzkamera (Abbildung 3, AUX)</td><td>Kriebelmücke, FLIR</td><td>BFS-U3-200S6M-C</td><td></td></tr><tr><td>Calbryte 520</td><td>AAT Bioquest</td><td>520 AM</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5453000011</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D2906</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Hoechst</td><td>ThermoFisher</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>Doppeltes Klebeband</td><td>Biesse Adesivi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E3</td><td>5 mM NaCl. 0,17 mM KCl. 0,33 mM CaCl2. 0,33 mM MgSO4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti2</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>GPI-GFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2A-mCh</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bilderfassungssoftware</td><td>Fusion-Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil</td><td>Cargille</td><td>Typ B: 16484</td><td></td></tr><tr><td>IR-Schutzbrille</td><td>Thorlabs</td><td>LG1</td><td></td></tr><tr><td>Lap2b-eGFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microloader Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>GELoader</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>MicroManager 2.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromiter</td><td>slide ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 Divisionen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma</td><td>M3616</td><td></td></tr><tr><td>Motorisierter Tisch</td><td>ASI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nadelabzieher</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modell P-97</td><td></td></tr><tr><td>Plattform für optische Pinzetten</td><td>Impetux Optics</td><td>Sensocell</td><td></td></tr><tr><td>OTs-Software (LightAce)</td><td>Impetux Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Sigma</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Härter</td><td>Sigma</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Nachbearbeitungssoftware (Matlab)</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAse freies Wasser</td><td>Thermofisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Siegroitischer Kurzpassspiegel (Abbildung 3, IR-F)</td><td>Semrock</td><td>FF01-950/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>Spin-Coater</td><td>Spezialbeschichtungssysteme</td><td>Spincoat G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Spinning-Disk-Mikroskop</td><td>Andor</td><td>DragonFly 502</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica M80</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dreieckiges Mikrospritzgießwerkzeug</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU1</td><td></td></tr><tr><td>Universalofen</td><td>Memmert</td><td>UNB 200</td><td></td></tr><tr><td>Wasserimmersionsobjektiv</td><td>Nikon</td><td>MRD07602</td><td></td></tr></tbody></table>

direkte kraftmessungen der subzellulären mechanik im einschluss mit optischen pinzetten

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

Während der Entwicklung eines mehrzelligen Organismus teilt sich eine einzelne befruchtete Zelle und führt zu mehreren Geweben mit unterschiedlichen Funktionen. Die Gewebemorphogenese geht Hand in Hand mit molekularen und strukturellen Veränderungen auf Einzelzellebene, die zu Variationen subzellulärer mechanischer Eigenschaften führen. Infolgedessen widerstehen selbst innerhalb derselben Zelle verschiedene Organellen und Kompartimente unterschiedlich mechanischen Belastungen; und Mechanotransduktionswege können ihre mechanischen Eigenschaften aktiv regulieren. Die Fähigkeit einer Zelle, sich an die Mikroumgebung der Gewebenische anzupassen, ist daher zum Teil auf die Fähigkeit zurückzuführen, mechanische Belastungen zu erkennen und darauf zu reagieren. Wir haben kürzlich ein neues Mechanosensationsparadigma vorgeschlagen, bei dem die Kernverformung und -positionierung es einer Zelle ermöglicht, die physikalische 3D-Umgebung zu messen und der Zelle ein Gefühl der Propriozeption zu verleihen, um Veränderungen in der Zellform zu entschlüsseln. In diesem Artikel beschreiben wir eine neue Methode zur Messung der Kräfte und Materialeigenschaften, die den Zellkern in lebenden Zellen formen, beispielhaft für adhärente Zellen und mechanisch begrenzte Zellen. Die Messungen können nicht-invasiv mit optischen Fallen im Inneren von Zellen durchgeführt werden, und die Kräfte sind durch kalibrierfreie Detektion des Lichtimpulses direkt zugänglich. Dies ermöglicht die Messung der Mechanik des Zellkerns unabhängig von Zelloberflächenverformungen und die Dissektion exterozeptiver und interozeptiver Mechanotransduktionswege. Wichtig ist, dass das Trapping-Experiment mit optischer Mikroskopie kombiniert werden kann, um die zelluläre Reaktion und subzelluläre Dynamik unter Verwendung von Fluoreszenzbildgebung des Zytoskeletts, der Calciumionen oder der Kernmorphologie zu untersuchen. Die vorgestellte Methode ist einfach anzuwenden, kompatibel mit kommerziellen Lösungen für Kraftmessungen und kann leicht erweitert werden, um die Mechanik anderer subzellulärer Kompartimente, z. B. Mitochondrien, Stressfasern und Endosomen, zu untersuchen.

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die intrazellulären mechanischen Eigenschaften isolierter embryonaler Zebrafischzellen im dreidimensionalen Einschluss mit direkter Kraftmessung durch eine optische Falle zu untersuchen.

Direkte Kraftmessungen der subzellulären Mechanik im Einschluss mit optischen Pinzetten

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

Dieses Protokoll seziert die individuellen mechanischen Eigenschaften des Zellkerns, die ihn zu einem mechanischen Maß für Zellpolarisation, Differenzierung und Migration machen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie mechanische Eigenschaften messen und Kräfte auf subzelluläre Kompartimente ausüben kann, ohne dass die Membran oder das kortikale Zytoskelett extern gestört wird. Das Protokoll kann leicht angepasst werden, um Perlen in anderen Zellen anderer Organismen zu manipulieren, um die Kernmechanik in verschiedenen Zelllinien oder Tiermodellen zu untersuchen.Die Ausrichtung des Direktkraftsensors ist entscheidend, um das gesamte Licht zu erfassen, das die optischen Fallen erzeugt und verlässt. Dies gewährleistet genaue Lichtimpulsmessungen im viskoelastischen Medium einer Zelle. Beginnen Sie mit der Einzelzellvorbereitung, indem Sie die Embryonen im Kugelstadium vier Stunden nach der Befruchtung mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff in eine Glasschale mit E3-Medien geben.Wählen Sie dann die Embryonen aus, die positiv auf die Perlen eingestellt sind, und exprimieren Sie das fluoreszierende Protein im Falle einer mRNA-Injektion. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Embryonen manuell zu entkrümmen und übertragen Sie etwa 10 bis 15 decurionierte Embryonen mit Hilfe einer Glaspasteurpipette in einen 1,5 Milliliter Reaktionsbehälter. Entfernen Sie das E3-Medium aus dem Röhrchen und fügen Sie 500 Mikroliter vorgewärmtes kohlendioxidunabhängiges Gewebekulturmedium hinzu.Schütteln Sie die Röhre vorsichtig, um die Bildung von Blasen zu vermeiden, und stellen Sie sicher, dass der Inhalt der Röhre trüb wird, da sich die Zellen dissoziieren, ohne dass große Brocken für das Auge sichtbar sind. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 mal G für drei Minuten. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und sammeln Sie das Pellet, um mit der Zellfärbung fortzufahren.Um den Zellkern zu markieren, resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie 500 Mikroliter der frisch hergestellten DNA-Hoechst-Färbelösung in das Röhrchen geben. Inkubieren Sie die gefärbten Zellen für sieben Minuten im Dunkeln. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen wie zuvor beschrieben und resuspenieren Sie das Pellet entweder in 50 Mikroliter DMEM für Proben in Suspension oder 20 Mikroliter DMEM für Zellen im Eingeschlossenen.Für die Vorbereitung des optischen Drumherums oder der OT-Kammer für die Experimente mit den Zellen in Suspension schneiden Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband mit einem etwa 10 x 10 Millimeter großen quadratischen Loch in der Mitte. Ziehen Sie eine der Schutzschichten des Klebebandes ab und legen Sie die unbedeckte Seite des Bandes in die Mitte einer 1,5 H Glasbodenschale. Drücken Sie das Band vorsichtig an, damit die gesamte Oberfläche des Bandes am Glas haftet, während Sie Luftblasen vermeiden und die verbleibende Schutzschicht des Bandes abziehen.Inkubieren Sie die Oberfläche mit 100 Mikrolitern Concanavalin A bei 0,5 Milligramm pro Milliliter für 30 Minuten. Entfernen Sie dann den Tropfen Concanavalin A und spülen Sie die Oberfläche mit DMEM ab. 30 Mikroliter der Lösung, die die Zellen enthält, auf die Hohlraumoberfläche geben.Verschließen Sie dann die Kammer sehr vorsichtig mit einem 22 mal 22 Millimeter großen Deckglas. Verwenden Sie bei Bedarf ein Skalpell oder eine Pinzette. Als nächstes fahren Sie mit dem Start der optischen Pinzette fort, indem Sie den Laser mindestens 30 Minuten vor dem Experiment mit beträchtlich hoher Leistung einschalten, um die Ausgangsleistungsstabilität zu optimieren.Wenn Sie fertig sind, schalten Sie das Elektronikmodul der optischen Mikromanipulations- und Kraftmesseinheiten ein. Bevor Sie den optischen Kraftsensor ausrichten, legen Sie einen Wassertropfen auf das 60X 1.2 Wasserimmersionsobjektiv und stellen Sie die Kammer mit den Zellen auf die Bühne. Konzentrieren Sie sich auf die untere Oberfläche der Kammer, in der die Zellproben platziert werden.Nachdem Sie einen Tropfen Tauchöl auf den Abdeckglasträger gegeben haben, der die Probe bedeckt, senken Sie die Auffanglinse der Kraftsensoreinheit ab, bis sie den Öltröpfchen berührt. Nach dem Standardverfahren für die Ausrichtung des optischen Kraftsensors betrachten Sie das Bild der Probenebene auf der Hilfskamera, das zur Positionierung der OTs verwendet werden soll, und senken Sie dann den optischen Kraftsensor ab, bis sein Feldstopp auf der Probenebene konjugiert erscheint. Um mit dem Bertrand-Objektiv nach Luftblasen zu suchen, beobachten Sie den Bildweg durch die Hilfskamera.Wenn Schmutz oder Luftblasen sichtbar sind, reinigen Sie die Linse und die Kammer mit staubfreiem Linsengewebe, bevor Sie den Vorgang wie beschrieben wiederholen und mehr Tauchöl hinzufügen. Mit den seitlichen Schrauben, die auf der Halterung des optischen Kraftsensors angebracht sind, zentrieren Sie den Feldanschlag in das Sichtfeld. Öffnen Sie aus Gründen der Genauigkeit den Feldstopp fast, um das auf der Hilfskamera sichtbare Sichtfeld einzunehmen.Nachdem Sie die Probe in das Mikroskop gelegt und den optischen Kraftsensor ausgerichtet haben, verwenden Sie die rotierende Halbwellenplatte, um die anfängliche Fallenleistung auf 200 Milliwatt einzustellen, wenn die Steifigkeit des untersuchten Kerns oder der interzellulären Struktur nicht bekannt ist. Wenn Sie fertig sind, verwenden Sie den Software-Controller für Mikroskoptische, um durch transmittierte Hellfeldmikroskopie nach einer Zelle mit ein oder zwei Perlen zu suchen. Schreiben Sie in das Numerische Blatt die Verschiebung und die Uhrzeit jedes nachfolgenden Leitkurvenschritts.Alternativ können Sie die Tabelle S1 aus dem Ergänzungsmaterial laden. Für ein Stress-/Entspannungsexperiment programmieren Sie die aufzubringenden Trapezbelastungen. Aktivieren Sie in der OT-Software die optischen Fallen.Um eine Mikrosphäre einzufangen, stellen Sie die Bildebenen mit einem Mikroskoptisch-Software-Controller leicht über der Perle ein. Klicken Sie auf die Polystyrol-Mikroperle im kalibrierten Hilfskamera-Bildgebungsfenster. Ein erfolgreicher Einschluss der Perle durch die optische Falle reduziert die Bewegung der Perle stark.Klicken und ziehen Sie die Perle über das Zytoplasma und platzieren Sie sie in einem Abstand von etwa zwei Mikrometern von der Kernhülle. Stellen Sie sicher, dass die Flugbahn so eingestellt ist, dass der Perleneinzug senkrecht zur Kernmembran steht. Wenn das Setup fertig ist, gehen Sie zur Imaging-Software und klicken Sie auf die Aufnahmetaste, um die Bildaufnahme zu starten.Öffnen Sie das Echtzeit-Force-Reading-Fenster, klicken Sie auf Daten und speichern Sie im Echtzeit-Force-Reading-Fenster, um zu speichern. Starten Sie die Trap-Position und die Kraftmessdaten. Initiieren Sie die zuvor geladene Leitkurve, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Perle klicken und Startleitkurve auswählen.Warten Sie, bis die Trajektorie fertig ist und sich das System stabilisiert hat, bevor Sie die Aufzeichnung der Fangkraftmessdaten abschließen. Stoppen Sie die Bildaufnahme und zeichnen Sie die Ergebnisse in der Nachbearbeitungssoftware auf. In der repräsentativen Analyse wird eine isolierte Zebrafisch-Vorläuferstammzelle mit einer einzigen Mikrosphäre in der Nähe des Zellkerns dargestellt.Die Verteilung der Polystyrol-Mikrosphäre fünf Stunden nach der Injektion in einen Embryo wurde überwacht. Hellfeld- und Fluoreszenzbild zeigt, dass die Perlen über das Embryonengewebe verteilt sind. Die maximale Projektion des konfokalen fluoreszierenden Z-Stacks und eine maximale Projektion eines Sub-Stacks in derselben Region bestätigen, dass ein großer Teil der tiefen Zellen ein bis zwei Kügelchen enthielt.24 Stunden nach der Befruchtung wurden die Kügelchen über den gesamten Körper des Embryos verteilt. Die Brightfield-Mikroaufnahmen der Suspensionszellen auf den eingeschlossenen Zellen mit einer oder zwei injizierten Kügelchen wurden erhalten. Darüber hinaus erleichterten mehrere fluoreszierende Markierungen die Untersuchung verschiedener Aspekte der Zellen, wie internukleäre Membran, Plasmamembran, DNA und transgene Linie.Repräsentative Schnappschüsse beschrieben Hoechst-markierte Kerne fünf Sekunden vor/während und fünf Sekunden nach dem Einrücken mit einer optisch gefangenen Mikrosphäre. Intensitätsprofile entlang des Eindringsegments für drei verschiedene Rahmen und Trajektorien der distalen und proximalen Grenzen des Kerns während eines Eindringexperiments von suspendierten und eingeschlossenen Zellen wurden untersucht. Die eingeschlossene Flugbahn und die Kraft, die von der optisch eingeschlossenen Mikrosphäre während eines wiederholten Kerneindringexperiments erfahren wurden, wurden gemessen.Die Kernmechanik in den Zellen in Suspension und unter Einschluss bestätigte, dass der Einschluss zu einer Erweiterung der projizierten Fläche und einer unbedeutenden Änderung der Kernsteifigkeit führte. Wenn Perlen in den Embryo im Einzelzellstadium injiziert werden, werden sie sich höchstwahrscheinlich in den späteren Stadien gleichmäßig verteilen. Denken Sie daran, dass die Perle stabil eingeschlossen werden muss.Wenn die Perle der optischen Falle entkommt, definieren Sie die Flugbahn neu oder erhöhen Sie die Laserleistung. Diese Experimente können leicht an mehreren Mikrokügelchen in einer Zelle durchgeführt und auf aktive mikrorheologische Messungen ausgeweitet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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Direkte Messung von Kräften innerhalb rekonstituierter aktiver Mikrotubulibündel

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Hochgeschwindigkeits-Magnetpinzette für nanomechanische Messungen an kraftempfindlichen Elementen

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