Direkte Kraftmessungen der subzellulären Mechanik im Einschluss mit optischen Pinzetten

Dieses Protokoll seziert die individuellen mechanischen Eigenschaften des Zellkerns, die ihn zu einem mechanischen Maß für Zellpolarisation, Differenzierung und Migration machen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie mechanische Eigenschaften messen und Kräfte auf subzelluläre Kompartimente ausüben kann, ohne dass die Membran oder das kortikale Zytoskelett extern gestört wird. Das Protokoll kann leicht angepasst werden, um Perlen in anderen Zellen anderer Organismen zu manipulieren, um die Kernmechanik in verschiedenen Zelllinien oder Tiermodellen zu untersuchen.

Die Ausrichtung des Direktkraftsensors ist entscheidend, um das gesamte Licht zu erfassen, das die optischen Fallen erzeugt und verlässt. Dies gewährleistet genaue Lichtimpulsmessungen im viskoelastischen Medium einer Zelle. Beginnen Sie mit der Einzelzellvorbereitung, indem Sie die Embryonen im Kugelstadium vier Stunden nach der Befruchtung mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff in eine Glasschale mit E3-Medien geben.

Wählen Sie dann die Embryonen aus, die positiv auf die Perlen eingestellt sind, und exprimieren Sie das fluoreszierende Protein im Falle einer mRNA-Injektion. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Embryonen manuell zu entkrümmen und übertragen Sie etwa 10 bis 15 decurionierte Embryonen mit Hilfe einer Glaspasteurpipette in einen 1,5 Milliliter Reaktionsbehälter. Entfernen Sie das E3-Medium aus dem Röhrchen und fügen Sie 500 Mikroliter vorgewärmtes kohlendioxidunabhängiges Gewebekulturmedium hinzu.

Schütteln Sie die Röhre vorsichtig, um die Bildung von Blasen zu vermeiden, und stellen Sie sicher, dass der Inhalt der Röhre trüb wird, da sich die Zellen dissoziieren, ohne dass große Brocken für das Auge sichtbar sind. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 mal G für drei Minuten. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und sammeln Sie das Pellet, um mit der Zellfärbung fortzufahren.

Um den Zellkern zu markieren, resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie 500 Mikroliter der frisch hergestellten DNA-Hoechst-Färbelösung in das Röhrchen geben. Inkubieren Sie die gefärbten Zellen für sieben Minuten im Dunkeln. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen wie zuvor beschrieben und resuspenieren Sie das Pellet entweder in 50 Mikroliter DMEM für Proben in Suspension oder 20 Mikroliter DMEM für Zellen im Eingeschlossenen.

Für die Vorbereitung des optischen Drumherums oder der OT-Kammer für die Experimente mit den Zellen in Suspension schneiden Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband mit einem etwa 10 x 10 Millimeter großen quadratischen Loch in der Mitte. Ziehen Sie eine der Schutzschichten des Klebebandes ab und legen Sie die unbedeckte Seite des Bandes in die Mitte einer 1,5 H Glasbodenschale. Drücken Sie das Band vorsichtig an, damit die gesamte Oberfläche des Bandes am Glas haftet, während Sie Luftblasen vermeiden und die verbleibende Schutzschicht des Bandes abziehen.

Inkubieren Sie die Oberfläche mit 100 Mikrolitern Concanavalin A bei 0,5 Milligramm pro Milliliter für 30 Minuten. Entfernen Sie dann den Tropfen Concanavalin A und spülen Sie die Oberfläche mit DMEM ab. 30 Mikroliter der Lösung, die die Zellen enthält, auf die Hohlraumoberfläche geben.

Verschließen Sie dann die Kammer sehr vorsichtig mit einem 22 mal 22 Millimeter großen Deckglas. Verwenden Sie bei Bedarf ein Skalpell oder eine Pinzette. Als nächstes fahren Sie mit dem Start der optischen Pinzette fort, indem Sie den Laser mindestens 30 Minuten vor dem Experiment mit beträchtlich hoher Leistung einschalten, um die Ausgangsleistungsstabilität zu optimieren.

Wenn Sie fertig sind, schalten Sie das Elektronikmodul der optischen Mikromanipulations- und Kraftmesseinheiten ein. Bevor Sie den optischen Kraftsensor ausrichten, legen Sie einen Wassertropfen auf das 60X 1.2 Wasserimmersionsobjektiv und stellen Sie die Kammer mit den Zellen auf die Bühne. Konzentrieren Sie sich auf die untere Oberfläche der Kammer, in der die Zellproben platziert werden.

Nachdem Sie einen Tropfen Tauchöl auf den Abdeckglasträger gegeben haben, der die Probe bedeckt, senken Sie die Auffanglinse der Kraftsensoreinheit ab, bis sie den Öltröpfchen berührt. Nach dem Standardverfahren für die Ausrichtung des optischen Kraftsensors betrachten Sie das Bild der Probenebene auf der Hilfskamera, das zur Positionierung der OTs verwendet werden soll, und senken Sie dann den optischen Kraftsensor ab, bis sein Feldstopp auf der Probenebene konjugiert erscheint. Um mit dem Bertrand-Objektiv nach Luftblasen zu suchen, beobachten Sie den Bildweg durch die Hilfskamera.

Wenn Schmutz oder Luftblasen sichtbar sind, reinigen Sie die Linse und die Kammer mit staubfreiem Linsengewebe, bevor Sie den Vorgang wie beschrieben wiederholen und mehr Tauchöl hinzufügen. Mit den seitlichen Schrauben, die auf der Halterung des optischen Kraftsensors angebracht sind, zentrieren Sie den Feldanschlag in das Sichtfeld. Öffnen Sie aus Gründen der Genauigkeit den Feldstopp fast, um das auf der Hilfskamera sichtbare Sichtfeld einzunehmen.

Nachdem Sie die Probe in das Mikroskop gelegt und den optischen Kraftsensor ausgerichtet haben, verwenden Sie die rotierende Halbwellenplatte, um die anfängliche Fallenleistung auf 200 Milliwatt einzustellen, wenn die Steifigkeit des untersuchten Kerns oder der interzellulären Struktur nicht bekannt ist. Wenn Sie fertig sind, verwenden Sie den Software-Controller für Mikroskoptische, um durch transmittierte Hellfeldmikroskopie nach einer Zelle mit ein oder zwei Perlen zu suchen. Schreiben Sie in das Numerische Blatt die Verschiebung und die Uhrzeit jedes nachfolgenden Leitkurvenschritts.

Alternativ können Sie die Tabelle S1 aus dem Ergänzungsmaterial laden. Für ein Stress-/Entspannungsexperiment programmieren Sie die aufzubringenden Trapezbelastungen. Aktivieren Sie in der OT-Software die optischen Fallen.

Um eine Mikrosphäre einzufangen, stellen Sie die Bildebenen mit einem Mikroskoptisch-Software-Controller leicht über der Perle ein. Klicken Sie auf die Polystyrol-Mikroperle im kalibrierten Hilfskamera-Bildgebungsfenster. Ein erfolgreicher Einschluss der Perle durch die optische Falle reduziert die Bewegung der Perle stark.

Klicken und ziehen Sie die Perle über das Zytoplasma und platzieren Sie sie in einem Abstand von etwa zwei Mikrometern von der Kernhülle. Stellen Sie sicher, dass die Flugbahn so eingestellt ist, dass der Perleneinzug senkrecht zur Kernmembran steht. Wenn das Setup fertig ist, gehen Sie zur Imaging-Software und klicken Sie auf die Aufnahmetaste, um die Bildaufnahme zu starten.

Öffnen Sie das Echtzeit-Force-Reading-Fenster, klicken Sie auf Daten und speichern Sie im Echtzeit-Force-Reading-Fenster, um zu speichern. Starten Sie die Trap-Position und die Kraftmessdaten. Initiieren Sie die zuvor geladene Leitkurve, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Perle klicken und Startleitkurve auswählen.

Warten Sie, bis die Trajektorie fertig ist und sich das System stabilisiert hat, bevor Sie die Aufzeichnung der Fangkraftmessdaten abschließen. Stoppen Sie die Bildaufnahme und zeichnen Sie die Ergebnisse in der Nachbearbeitungssoftware auf. In der repräsentativen Analyse wird eine isolierte Zebrafisch-Vorläuferstammzelle mit einer einzigen Mikrosphäre in der Nähe des Zellkerns dargestellt.

Die Verteilung der Polystyrol-Mikrosphäre fünf Stunden nach der Injektion in einen Embryo wurde überwacht. Hellfeld- und Fluoreszenzbild zeigt, dass die Perlen über das Embryonengewebe verteilt sind. Die maximale Projektion des konfokalen fluoreszierenden Z-Stacks und eine maximale Projektion eines Sub-Stacks in derselben Region bestätigen, dass ein großer Teil der tiefen Zellen ein bis zwei Kügelchen enthielt.

24 Stunden nach der Befruchtung wurden die Kügelchen über den gesamten Körper des Embryos verteilt. Die Brightfield-Mikroaufnahmen der Suspensionszellen auf den eingeschlossenen Zellen mit einer oder zwei injizierten Kügelchen wurden erhalten. Darüber hinaus erleichterten mehrere fluoreszierende Markierungen die Untersuchung verschiedener Aspekte der Zellen, wie internukleäre Membran, Plasmamembran, DNA und transgene Linie.

Repräsentative Schnappschüsse beschrieben Hoechst-markierte Kerne fünf Sekunden vor/während und fünf Sekunden nach dem Einrücken mit einer optisch gefangenen Mikrosphäre. Intensitätsprofile entlang des Eindringsegments für drei verschiedene Rahmen und Trajektorien der distalen und proximalen Grenzen des Kerns während eines Eindringexperiments von suspendierten und eingeschlossenen Zellen wurden untersucht. Die eingeschlossene Flugbahn und die Kraft, die von der optisch eingeschlossenen Mikrosphäre während eines wiederholten Kerneindringexperiments erfahren wurden, wurden gemessen.

Die Kernmechanik in den Zellen in Suspension und unter Einschluss bestätigte, dass der Einschluss zu einer Erweiterung der projizierten Fläche und einer unbedeutenden Änderung der Kernsteifigkeit führte. Wenn Perlen in den Embryo im Einzelzellstadium injiziert werden, werden sie sich höchstwahrscheinlich in den späteren Stadien gleichmäßig verteilen. Denken Sie daran, dass die Perle stabil eingeschlossen werden muss.

Wenn die Perle der optischen Falle entkommt, definieren Sie die Flugbahn neu oder erhöhen Sie die Laserleistung. Diese Experimente können leicht an mehreren Mikrokügelchen in einer Zelle durchgeführt und auf aktive mikrorheologische Messungen ausgeweitet werden.