Name: Hybride De-Novo-Genomassemblierung zur Erzeugung vollständiger Genome von Harnbakterien unter Verwendung von Kurz- und Langzeitsequenzierungstechnologien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Erfahren Sie die hybride De-Novo-Genomassemblierung von Harnbakterien mit Kurz- und Langzeitsequenzierung. Diese Methode ermöglicht vollständige Genome für Studien zur Antibiotikaresistenz.

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Wir danken Dr. Moutusee Jubaida Islam und Dr. Luke Joyce für ihre Beiträge zu diesem Protokoll. Wir möchten auch die University of Texas am Dallas Genome Center für ihr Feedback und ihre Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde von der Welch Foundation, Vergabenummer AT-2030-20200401 an N.J.D., von den National Institutes of Health, Preisnummer R01AI116610 an K.P., und vom Felecia and John Cain Chair in Women's Health, gehalten von P.E.Z.

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Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Das hier beschriebene umfassende Hybridgenom-Assemblierungsprotokoll bietet einen optimierten Ansatz für die erfolgreiche Kultivierung verschiedener Harnmikrobiota und Uropathogene und die vollständige Assemblierung ihrer Genome. Erfolgreiche WGS von Bakteriengenomen beginnt mit der Isolierung verschiedener und manchmal anspruchsvoller Mikroben, um ihre genomische DNA zu extrahieren. Bis heute fehlt den bestehenden Urinkulturprotokollen entweder die notwendige Empfindlichkeit, um viele Harnspezies zu erkennen, oder sie beinhalten langwierige und umfangreiche Ansätze, die längere Zeit und Ressourcen erfordern11. Der beschriebene Modified Enhanced Urine Culture-Ansatz bietet ein vereinfachtes und dennoch umfassendes Protokoll für die erfolgreiche Isolierung von Bakterien, die zu 17 häufigen Harngattungen gehören, einschließlich potenziell pathogener oder nützlicher kommensaler Spezies und sowohl fakultativer als auch obligater aerober oder anaerober Bakterien. Dies wiederum liefert das notwendige Ausgangsmaterial für eine genaue Sequenzierung und Assemblierung bakterieller Genome und für kritische phänotypische Experimente, die zum Verständnis von Harngesundheit und -krankheit beitragen. Darüber hinaus bietet dieser modifizierte Kulturansatz eine genauere klinische Diagnose von lebensfähigen Mikroorganismen, die in Urinproben vorkommen, und ermöglicht deren Biobanking für zukünftige genomische Studien. Dieses Protokoll ist jedoch nicht ohne Einschränkungen. Es kann je nach Organismus lange Inkubationszeiten sowie die Verwendung von Ressourcen wie einer Hypoxiekammer oder kontrollierten Inkubatoren erfordern, die möglicherweise nicht ohne weiteres verfügbar sind. Die Verwendung von anaeroben GasPaks bietet eine alternative Lösung, aber diese sind kostspielig und erzeugen nicht immer eine nachhaltige und kontrollierte Umgebung. Schließlich können Kulturverzerrungen sowie die Probenvielfalt es bestimmten Organismen und Uropathogenen ermöglichen, anspruchsvolle Bakterien zu übertreffen. Trotz dieser Einschränkungen wird durch diesen Ansatz eine Kultur verschiedener Harnbakterien ermöglicht.
Die genomische Sequenzierung hat mit der Weiterentwicklung der Next Generation Sequencing-Technologien an Popularität gewonnen, die sowohl die Ausbeute als auch die Genauigkeit der Sequenzierungsdaten enorm erhöht haben14,15. In Verbindung mit der Entwicklung von Algorithmen zur Datenverarbeitung und De-novo-Assemblierung stehen Anfängern und Fachwissenschaftlern komplette Genomsequenzen gleichermaßen zur Verfügung15,45. Das Wissen über die gesamte Genomorganisation, das durch vollständige Genome bereitgestellt wird, bietet wichtige evolutionäre und biologische Erkenntnisse, einschließlich Genduplikation, Genverlust und horizontaler Gentransfer14. Darüber hinaus sind Gene, die für antimikrobielle Resistenz und Virulenz wichtig sind, oft auf mobilen Elementen lokalisiert, die typischerweise nicht in Entwurfsgenomassemgruppen aufgelöst werden15,16.
Das hierin enthaltene Protokoll folgt einem hybriden Ansatz für die Kombination von Sequenzierungsdaten von Short-Read- und Long-Read-Plattformen, um vollständige Genom-Assemblierungen zu erzeugen. Während es sich auf bakterielle Genome im Urin konzentriert, kann dieses Verfahren an verschiedene Bakterien aus verschiedenen Isolationsquellen angepasst werden. Kritische Schritte in diesem Ansatz umfassen die Anwendung einer adäquaten sterilen Technik und die Verwendung geeigneter Medien- und Kulturbedingungen für die Isolierung reiner Harnbakterien. Darüber hinaus ist die Extraktion intakter, ertragreicher gDNA unerlässlich, um Sequenzierungsdaten frei von kontaminierenden Lesevorgängen zu generieren, die den Montageerfolg beeinträchtigen können. Nachfolgende Bibliotheksvorbereitungsprotokolle sind entscheidend für die Generierung von Qualitätslesevorgängen von ausreichender Länge und Tiefe. Daher ist es von äußerster Wichtigkeit, gDNA bei der Bibliotheksvorbereitung insbesondere für die Long-Read-Sequenzierung sorgfältig zu behandeln, da der größte Vorteil dieser Technologie die Generierung von langen Lesevorgängen ohne theoretische obere Längenbegrenzung ist. Ebenfalls beschrieben sind Abschnitte für die geeignete Qualitätskontrolle (QC) der Sequenzierung von Lesevorgängen, die verrauschte Daten eliminiert und das Montageergebnis verbessert.
Trotz erfolgreicher DNA-Isolierung, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung kann die Art der genomischen Architektur einiger Arten immer noch ein Hindernis für die Erzeugung einer geschlossenen Genomanordnung darstellen45,46. Sich wiederholende Sequenzen erschweren oft die Montageberechnung, und trotz langer gelesener Daten können diese Bereiche mit geringer Zuverlässigkeit oder gar nicht aufgelöst werden. Lange Lesevorgänge müssen also im Durchschnitt länger sein als die größte Wiederholungsregion im Genom oder die Abdeckung muss hoch sein (>100x)19. Einige Genome können unvollständig bleiben und manuelle Ansätze zur Vervollständigung erfordern. Dennoch bestehen hybrid zusammengesetzte unvollständige Genome typischerweise aus weniger Contigs als kurz gelesene Entwurfsgenomen. Das Anpassen der Standardparameter des Baugruppenalgorithmus oder das Befolgen strengerer Cutoffs für die Lese-QC kann hilfreich sein. Alternativ besteht ein vorgeschlagener Ansatz darin, lange Lesevorgänge auf die unvollständigen Regionen auf der Suche nach Beweisen für den wahrscheinlichsten Montagepfad abzubilden und dann den Pfad unter Verwendung von PCR und Sanger-Sequenzierung der amplifizierten Region zu bestätigen. Mapping-Lesevorgänge mit Minimap2 wird vorgeschlagen und Bandage bietet ein nützliches Werkzeug für die Visualisierung von zugeordneten Lesevorgängen entlang zusammengesetzter Contigs, die Beweise für die Contig-Verknüpfungliefern 47.
Eine zusätzliche Herausforderung bei der Generierung vollständiger Genome liegt in der Vertrautheit und dem Komfort mit Befehlszeilenwerkzeugen. Viele bioinformatische Werkzeuge werden entwickelt, um jedem Benutzer Rechenmöglichkeiten zu bieten. Ihre Verwendung hängt jedoch von einem Verständnis der Grundlagen von UNIX und der Programmierung ab. Dieses Protokoll zielt darauf ab, ausreichend detaillierte Anweisungen bereitzustellen, damit Personen ohne vorherige Befehlszeilenerfahrung geschlossene Genomassemblys generieren und kommentieren können.

Das Urin-Mikrobiom ist ein aufstrebendes Forschungsgebiet, das ein jahrzehntelanges Missverständnis zerschlagen hat, dass die Harnwege bei gesunden Menschen steril sind. Mitglieder der Harnmikrobiota können dazu dienen, die Harnumgebung auszugleichen und Harnwegsinfektionen (UTI) zu verhindern1,2. Uropathogene Bakterien dringen in die Harnwege ein und nutzen verschiedene Virulenzmechanismen, um die ansässige Mikrobiota zu verdrängen, das Urothel zu besiedeln, Immunreaktionen zu entgehen und Umweltbelastungen entgegenzuwirken3,4. Urin ist ein relativ nährstoffarmes Medium, das durch hohe Osmolarität, begrenzte Stickstoff- und Kohlenhydratverfügbarkeit, geringe Sauerstoffversorgung und niedrigen pH-Wert5,6,7gekennzeichnet ist. Urin gilt auch als antimikrobiell, bestehend aus hohen Konzentrationen von inhibitorischem Harnstoff und antimikrobiellen Peptiden wie dem humanen Cathelicidin LL-378. Die Untersuchung von Mechanismen, die sowohl von ansässigen Bakterien als auch von Uropathogenen zur Besiedlung der Harnwege eingesetzt werden, ist entscheidend für das weitere Verständnis der Gesundheit der Harnwege und die Entwicklung neuer Strategien für die Behandlung mit Harnwegsinfektionen. Da das Versagen antimikrobieller Therapien an vorderster Front immer häufiger auftritt, wird es immer wichtiger, die Verbreitung mobiler genetischer Elemente zu überwachen, die antimikrobielle Resistenzdeterminanten in Populationen von Harnbakterien tragen9,10.
Um Genotypen und Phänotypen von Harnbakterien zu untersuchen, ist ihre erfolgreiche Kultur und anschließende Sequenzierung des gesamten Genoms (WGS) unerlässlich. Kulturabhängige Methoden sind notwendig, um lebensfähige Mikroben in Urinproben nachzuweisen und zu identifizieren11. Bei der klinischen Standard-Urinkultur werden Urin auf 5% Schafblutagar (BAP) und MacConkey-Agar plattiert und bei 35 °C für 24 h aerob inkubiert12. Mit einer Nachweisschwelle von ≥105 KBE/ml13werden jedoch viele Mitglieder der Urinmikrobiota durch diese Methode nicht berichtet. Verbesserte Kultivierungstechniken wie Enhanced Quantitative Urine Culture (EQUC)11 verwenden verschiedene Kombinationen unterschiedlicher Urinvolumina, Inkubationszeiten, Kulturmedien und atmosphärischer Bedingungen, um Mikroben zu identifizieren, die häufig von der Standardurinkultur übersehen werden. In diesem Protokoll wird eine modifizierte Version von EQUC beschrieben, hier als Modifiziertes Enhanced Urine Culture-Protokoll bezeichnet, das die Kultivierung verschiedener Harnbakterien und Uropathogene unter Verwendung selektiver Medien und optimaler atmosphärischer Bedingungen ermöglicht, aber nicht von Natur aus quantitativ ist. Die erfolgreiche Isolierung von Harnbakterien ermöglicht die Extraktion genomischer DNA (gDNA) für nachgeschaltete WGS und Genomassemblierung.
Genom-Assemblierungen, insbesondere komplette Assemblierungen, ermöglichen die Entdeckung genetischer Faktoren, die zur Kolonisierung, Nischenerhaltung und Virulenz sowohl bei ansässigen Mikrobiota als auch bei uropathogenen Bakterien beitragen können. Entwürfe von Genomassemblys enthalten eine Vielzahl von zusammenhängenden Sequenzen (Contigs), die Sequenzierungsfehler enthalten können und keine Orientierungsinformationen enthalten. In einer vollständigen Genomanordnung wurden sowohl die Orientierung als auch die Genauigkeit jedes Basenpaares verifiziert14. Darüber hinaus bietet die Gewinnung vollständiger Genomsequenzen Einblicke in die Genomstruktur, die genetische Vielfalt und die mobilen genetischen Elemente15. Kurze Lektüren allein können das Vorhandensein oder Fehlen wichtiger Gene identifizieren, aber möglicherweise nicht ihren genomischen Kontextbestimmen 16. Mit der Ermöglichung von Long-Read-Sequenzierungstechnologien wie Oxford Nanopore und PacBio erfordert die Erzeugung geschlossener De-novo-Assemblierungen bakterieller Genome keine anstrengenden Methoden wie das manuelle Schließen von De-novo-Assemblierungen durch Multiplex-PCR17,18. Die Kombination von Next Generation Short-Read-Sequencing und Nanopore Long-Read-Sequencing-Technologien ermöglicht die einfache Generierung genauer, vollständiger und geschlossener bakterieller Genom-Assemblierungen zu relativ geringen Kosten19. Die Short-Read-Sequenzierung erzeugt genaue, aber fragmentierte Genomanordnungen, die im Allgemeinen aus durchschnittlich 40-100 Contigs bestehen, während die Nanoporensequenzierung lange Lesevorgänge von etwa 5-100 kb Länge erzeugt, die weniger genau sind, aber als Gerüste dienen können, um Contigs zu verbinden und die genomische Syntenie aufzulösen. Hybride Ansätze, die sowohl Short-Read- als auch Long-Read-Technologien verwenden, können genaue und vollständige Bakteriengenome erzeugen19.
Hier wird ein umfassendes Protokoll für die Isolierung und Identifizierung von Bakterien aus menschlichem Urin, genomische DNA-Extraktion, Sequenzierung und vollständige Genomassemblierung unter Verwendung eines hybriden Assemblierungsansatzes beschrieben. Dieses Protokoll legt besonderen Wert auf die Schritte, die notwendig sind, um Lesevorgänge richtig zu modifizieren, die durch Short-Read- und Long-Read-Sequenzierung für die genaue Montage eines geschlossenen bakteriellen Chromosoms und extrachromosomaler Elemente wie Plasmide erzeugt werden.

<table><tbody><tr><td>Ausrüstung:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td>G29398A</td><td>Optionale, aber empfohlene</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>--</td><td>Jede Zentrifuge zum Spinnen von Kegeln und Mikrozentrifugenröhrchen (z. B. Modelle 5810R/5424R)</td></tr><tr><td>Elektrophorese</td><td>BioRad Laboratories</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Bildgebungssystem</td><td>BioRad Laboratories</td><td></td><td>ChemiDoc</td></tr><tr><td>Modelle Inkubator</td><td>ThermoFisher Scientific</td> <td>-</td> <td>Alle CO2 Inkubator (z. B. Thermo Forma Modell 3110)</td></tr><tr><td>Magnetisches Gestell</td><td>New England BioLabs</td><td>S15095</td><td>12-Röhrchen-Gestell</td></tr><tr><td>MinION</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Nanotropfen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1002</td><td>Andere Illumina-Modelle sind akzeptabel</td></tr><tr><td>Plate Reader</td><td>BioTek</td> <td>-</td> <td>Synergy H1</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific Q33238</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H2024</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>ThermoFisher Scientific</td> <td>-</td> <td>Jeder Thermocycler für PCR Reaktionen (z. B. ProFlex PCR-System)</td></tr><tr><td><stark>Materialien:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>10X FSME-Puffer</td><td>--</td><td></td><td>1M Tris,1M Borsäure,0,2M EDTA (pH 8,0)</td></tr><tr><td>1429R Primer</td><td>Sigma Aldrich (Custom Oligos)</td><td>--</td><td>GGTTACCTTGTTACGACTT</td></tr><tr><td>1kb Leiter</td><td>VWR</td><td>101228-494</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris-Cl (pH 7,5)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>6x Ladefarbstoff</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0783588</td><td></td></tr><tr><td>8F Primer</td><td>Sigma Aldrich (Custom oligos)</td><td>--</td><td>AGAGTTTGATCCTGGCTCAG</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioRad Laboratories</td><td>63001</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Anaerobe Pouch System - GasPak EZ</td><td>BD Diagnosesysteme</td><td>B260683</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-500</td><td></td></tr><tr><td>Gehirn Herz Infusion Bouillon</td><td>BD Diagnosesysteme</td><td>212304</td><td></td></tr><tr><td>CDC Anaerobe 5% Schafblut Agar</td><td>BD Diagnosesysteme</td><td>L007357</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar Orientation</td><td>BD Diagnosesysteme</td><td>PA-257481.04</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blut & Gewebe</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Trockene anaerobe Indikatorstreifen</td><td>BD Diagnosesysteme</td><td>271051</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 Proof</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>Für die Molekularbiologie</td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP130210</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszellen-Priming-Kit</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-FLP002</td><td></td></tr><tr><td>Flow-Zellen-Waschset</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-WSH003</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Extraktions-Miniprep-Kit</td><td>BioBasic</td><td>BS654</td><td></td></tr><tr><td>Ligatur-Sequenzierungskit</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-LSK109</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Research Products International Corp</td><td>L381005.05</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolysin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9901-5KU</td><td></td></tr><tr><td>Native Barcoding-Erweiterung 1-12</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-NBD104</td><td></td></tr><tr><td>NEB Blunt/TA Ligase Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0367L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext FFPE DNA Repair Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M6630L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Quick Ligation Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B6058S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Endreparatur / dA-Tailing Modul</td><td>New England BioLabs</td><td>E7546L</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA CD Indizes</td><td>Illumina</td><td>20018708</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA Flex Library Prep - (M) Tagmentation</td><td>Illumina</td><td>20018705</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Quick T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>E6056L</td><td></td></tr><tr><td>R9 Durchflusszelle</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>FLO-MIN106D</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Schafblut</td><td>Hämostat Laboratorien</td><td>DS13250</td><td></td></tr><tr><td>TE-Puffer</td> <td>--</td><td>--</td> <td>10 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 8,0)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tryptische Sojabrühe</td><td>BD Diagnosesysteme</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>Software & Software Bioinformatische Werkzeuge:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bandage</td><td>--</td><td>--</td><td>https://rrwick.github.io/Bandage/</td></tr> <tr><td>Zentrum für Genomische Epidemiologie</td><td>--</td><td>--</td><td>http://www.genomicepidemiology.org/</td></tr> <tr><td>CLC Genomics Workbench 12</td><td>QIAGEN-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>CRISPRcasFinder</td><td>--</td><td></td><td>--https://crisprcas.i2bc.paris-saclay.fr/</td></tr><tr><td>FastQC</td><td>--</td><td>--</td><td>https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td></tr> <tr><td>Geneious Prime</td><td>Geneious</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>gVolante (BUSCO)</td><td>--</td><td></td><td>--https://gvolante.riken.jp/</td></tr> <tr><td>Kbase Prokka Wrapper</td><td>--</td><td>-</td><td>-https://kbase.us/applist/apps/ProkkaAnnotation/annotate_contigs/release</td></tr><tr><td>Minimap2</td><td>--</td><td>-- </td><td>https://github.com/lh3/minimap2</td></tr><tr><td>MinKNOW</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>NanoFilt</td><td>--</td><td>--</td><td>https://github.com/wdecoster/nanofilt</td></tr><tr><td>NanoStat</td><td>--</td><td>--https://github.com/wdecoster/nanostat</td><td></td></tr> <tr><td>PHASTER</td><td>--</td><td>--https://phaster.ca/</td><td></td></tr> <tr><td>Prokka</td><td>--</td><td>--</td><td>https://github.com/tseemann/prokka</td></tr><tr><td>QUAST</td><td>--</td><td>--http://quast.sourceforge.net/quast</td><td></td></tr> <tr><td>Trim Galore</td><td>--</td><td></td><td>--https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/</td></tr> <tr><td>Trimmomatic</td><td>--</td><td>---http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td><td></td></tr> <tr><td>Unicycler</td><td>--</td><td>---</td><td>https://github.com/rrwick/Unicycler#necessary-read-length</td></tr></tbody></table>

hybride de-novo-genomassemblierung zur erzeugung vollständiger genome von harnbakterien unter verwendung von kurz- und langzeitsequenzierungstechnologien

Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies

Vollständige Genomsequenzen liefern wertvolle Daten für das Verständnis der genetischen Vielfalt und der einzigartigen Kolonisationsfaktoren von Urinmikroben. Diese Daten können mobile genetische Elemente wie Plasmide und extrachromosomale Phagen umfassen, die zur Verbreitung antimikrobieller Resistenzen beitragen und die Behandlung von Harnwegsinfektionen (UTI) weiter erschweren. Vollständige, geschlossene Genome bieten nicht nur eine feine Auflösung der Genomstruktur, sondern ermöglichen auch detaillierte vergleichende Genomik- und Evolutionsanalysen. Die Generierung vollständiger Genome de novo ist aufgrund der Einschränkungen der verfügbaren Sequenzierungstechnologie seit langem eine herausfordernde Aufgabe. Paired-End Next Generation Sequencing (NGS) erzeugt qualitativ hochwertige Kurzlesevorgänge, die oft zu genauen, aber fragmentierten Genomanordnungen führen. Im Gegenteil, die Nanoporensequenzierung liefert lange Lesevorgänge von geringerer Qualität, die normalerweise zu fehleranfälligen kompletten Baugruppen führen. Solche Fehler können genomweite Assoziationsstudien behindern oder irreführende Ergebnisse der Variantenanalyse liefern. Daher haben sich hybride Ansätze, die sowohl kurze als auch lange Lesevorgänge kombinieren, als zuverlässige Methoden herausgestellt, um hochgenaue geschlossene Bakteriengenome zu erhalten. Hierin wird eine umfassende Methode für die Kultur verschiedener Harnbakterien, die Speziesidentifizierung durch 16S rRNA-Gensequenzierung, die Extraktion genomischer DNA (gDNA) und die Generierung von kurzen und langen Lesevorgängen durch NGS- bzw. Nanopore-Plattformen beschrieben. Darüber hinaus beschreibt diese Methode eine bioinformatische Pipeline von Qualitätskontroll-, Assemblierungs- und Genvorhersagealgorithmen zur Erzeugung annotierter vollständiger Genomsequenzen. Die Kombination bioinformatischer Werkzeuge ermöglicht die Auswahl hochwertiger Lesedaten für die hybride Genomassemblierung und die nachgelagerte Analyse. Der in diesem Protokoll beschriebene gestraffte Ansatz für die hybride De-novo-Genomanordnung kann für die Verwendung in allen kultivierbaren Bakterien angepasst werden.

Dieses Protokoll wurde für die Kultivierung und Sequenzierung von Harnbakterien optimiert, die zu den in Abbildung 1aufgeführten Gattungen gehören. Nicht alle Harnbakterien sind mit dieser Methode kultivierbar. Kulturmedien und -bedingungen sind durch die Gattung in Abbildung 1spezifiziert. Exemplarische Gelelektrophorese-Bewertungen der gDNA-Integrität sind in Abbildung 2dargestellt. Ein Überblick über die Bioinformatik-Pipeline zur Sequenzierung von Leseverarbeitung, Genomassemblierung und Annotation ist in Abbildung 3 beschrieben. In Abbildung 4 wird ein Leitfaden für die rechnerische Verzeichnisstruktur bereitgestellt, um sowohl das Protokollverständnis zu vereinfachen als auch einen Rahmen für eine erfolgreiche Organisation bereitzustellen. Weiterhin sind repräsentative vollständige Genome von zwei Klebsiella spp., K. pneumoniae und K. oxytoca,enthalten, die durch dieses Protokoll erzeugt wurden. Eine Darstellung dieser Anordnungen ist in Abbildung 5 dargestellt und enthält auch ein zusätzliches unvollständiges Beispiel für das Genom von K. pneumoniae. Eine detaillierte Übersicht über jedes vollständig annotierte vollständige Genom ist in Abbildung 6 dargestellt. Schließlich wird in Tabelle 1 eine Zusammenfassung der Sequenzierungsstatistik bereitgestellt, um ein breites Verständnis der rohen und beschnittenen Daten zu bieten, die für die Erzeugung hochwertiger geschlossener Genomassemblys ausreichen. Zusätzlich vervollständigen Schlüsselparameter der beiden repräsentativen Klebsiella spp. Genome sind aufgelistet. Genome und Rohdaten wurden im Rahmen des BioProjekts PRJNA683049 in Genbank hinterlegt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig01.jpg"> Abbildung 1: Modifizierte verstärkte Urinkultur verschiedener Harngattungen. Diagramm für die Agar- und Flüssigbrühe, die zur Kultivierung verschiedener Harngattungen verwendet werden kann. Es wird empfohlen, alle Kultivierungen bei 35 °C gemäß Unterabschnitt 1.1 durchzuführen. Kreise repräsentieren Medien, die für die Kultivierung einer bestimmten Gattung geeignet sind, Farben wurden willkürlich ausgewählt, um einen Medientyp von einem anderen zu unterscheiden. CDC-AN BAP (rot), CDC Anaerobe Schafblut-Agar; 5% Schaf-BAP (orange), Schafblut-Agar; BHI (grün), Gehirnherzinfusion; TSB (gelb), Tryptische Sojabrühe; CHROMagar Orientierung (blau). aGardnerella vaginalis sollte auf HBT Bilayer G. vaginalis Selektives Agar in mikroaerophiler Atmosphäre und unter besonderen Anforderungen an die Brühekultur kultiviert werden44. bLactobacillus iners sollten auf 5% Kaninchen-BAP-Platten und NYCIII-Brühe in mikroaerophiler Atmosphäre kultiviert werden. cLactobacillus spp. kann unter mikroaerophilen Bedingungen auf MRS kultiviert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig02.jpg"> Abbildung 2: Genomische DNA-Extraktion Agarose Gel Bilder. Repräsentative Gelbilder, die die Ergebnisse der gDNA-Extraktion darstellen. (A) Bahn 1: 1 kb Leiter, Spur 2: intakte gDNA für erfolgreiche Extraktion, Spur 3: Verschmieren, die auf fragmentierte gDNA hinweist. (B) Bahn 1: 1 kb Leiter, Bahnen 2 &amp; 3: rRNA-Kontamination gekennzeichnet durch zwei Bänder zwischen 1,5 kb und 3 kb. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig03.jpg"> Abbildung 3: Workflow für die Hybridgenomassemblierung. Schematische Darstellung der Schritte von der Lesequalitätskontrolle über die Vorverarbeitung bis hin zur Montageanmerkung. Durch das Zuschneiden von Lesevorgängen werden mehrdeutige Lesevorgänge mit geringer Qualität entfernt. Q-Score- und Längenparameter werden angezeigt und stellen die Lesevorgänge dar, die beibehalten werden. Die Assemblierung verwendet sowohl kurze als auch lange Lesevorgänge, um eine hybride De-novo-Genomanordnung zu erzeugen. Die Montagequalität wird anhand der Vollständigkeit und Korrektheit mit vorgegebenen Werkzeugen und Parametern bewertet. Die endgültige Genomanordnung wird für alle Gene und spezifischen Orte von Interesse annotiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig4v2.jpg"> Abbildung 4:Strukturhandbuch für Bioinformatik-Verzeichnisse. Ein Schema der empfohlenen Verzeichnis- und Dateiorganisation für die Verarbeitung von kurzen und langen Lesevorgängen, hybrider Assemblierung und Genomannotation und QC. Wichtige Befehlszeilen-Datenverarbeitungsschritte werden neben den entsprechenden Dateien und Verzeichnissen hervorgehoben. Auslösen von Befehlen und Flags (fett), Eingabedateien (blau), Ausgabedateien oder -verzeichnissen (rot), Benutzereingaben wie Dateibenennungskonvention (Magenta). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig4v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig05.jpg"> Abbildung 5: Genom-Assemblierungsgraphen nach Bandage. Repräsentative vollständige Genom-Assemblierungsgraphen von (A) Klebsiella oxytoca KoPF10 und (B) Klebsiella pneumoniae KpPF25 und unvollständige Genomassemblierung von (C) Klebsiella pneumoniae KpPF46. Das vollständige Genom von KoPF10 zeigt ein einziges geschlossenes Chromosom und das vollständige Genom von KpPF25 besteht aus einem geschlossenen Chromosom und fünf geschlossenen Plasmiden. Das unvollständige Chromosom von KpPF46 besteht aus zwei miteinander verbundenen Contigs. Unicycler hybrid de novo assembly erzeugt einen Montagegraphen, der durch Bandage visualisiert wird. Der Montagegraph liefert ein vereinfachtes Schema des Genoms, das geschlossene Chromosomen oder Plasmide durch einen Linker anzeigt, der zwei Enden eines einzelnen Kontinents verbindet. Das Vorhandensein von mehr als einem miteinander verbundenen Contig weist auf eine unvollständige Montage hin. Contig Größe und Tiefe können auch in Bandage vermerkt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig06.jpg"> Abbildung 6: Vollständige Genomkarten von annotierten Hybridbaugruppen. Von Geneious Prime erstellte Montagekarten für das vollständige Genom von (A) K. oxytoca KoPF10 und (B) K. pneumoniae KpPF25, die annotierte Gene zeigen, die durch farbige Pfeile entlang der Plasmidrückgrats gekennzeichnet sind. Chromosomen zeigen der Einfachheit halber nur rRNA- und tRNA-Gene. Genomannotationen wurden mit Prokka durchgeführt, wie in Abschnitt 10 dieses Protokolls angegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Table 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872table1.jpg"> Tabelle 1: Repräsentativer Klebsiella spp.. vollständige Montageeigenschaften. Montageparameter des K. oxytoca-Stammes KoPF10 und des K. pneumoniae-Stammes KpPF25. Zugangsnummern für die hinterlegten Daten zu NCBI werden angegeben. Für beide Sequenzierungstechnologien wird die Anzahl der Lesevorgänge vor und nach dem Trimmen angegeben. N50 wird nur für lange Lesevorgänge bereitgestellt, da kurze Lesevorgänge eine kontrollierte Länge haben. Plasmid Replicon mit PlasmidFinder v2.1 Enteroebacteriaceae Datenbank mit Parametern auf 80% Identität und 60% Länge vorhergesagt. ein MLST, Multilocus Sequence Type. b CDS, Codierung von Sequenzen. c Plasmid-Replicon wurde mit der PlasmidFinder v2.1 Enterobacteriaceae-Datenbank mit Parametern von 80% Identität und 60% Länge vorhergesagt. d Oxford Nanopore Technologies (ONT) hinterlegte Lesedaten. e Illumina hinterlegte gelesene Daten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/Table%201_Sharon_JoVE_Revised.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt einen umfassenden Ansatz für die Kultivierung, Sequenzierung und De-novo-Hybridgenomassemblierung von Harnbakterien. Es bietet ein reproduzierbares Verfahren zur Erzeugung vollständiger, zirkulärer Genomsequenzen, die bei der Untersuchung sowohl chromosomaler als auch extrachromosomaler genetischer Elemente nützlich sind, die zur Kolonisierung im Urin, zur Pathogenese und zur Verbreitung antimikrobieller Resistenzen beitragen.

Hybride De-Novo-Genomassemblierung zur Erzeugung vollständiger Genome von Harnbakterien unter Verwendung von Kurz- und Langzeitsequenzierungstechnologien

Complete genome sequences provide valuable data for the understanding of genetic diversity and unique colonization factors of urinary microbes. These data ...

Dieses umfassende Protokoll weist an, wie man enge Genome verschiedener Harnbakterien generiert und ermöglicht es Lesern ohne Programmiererfahrung, terminalbasierte Genomassemblierungs- und Analysepipelines erfolgreich zu implementieren. Vollständige Genom-Assemblierungen ermöglichen die Entdeckung von Genen, die zur Kolonisierung und Virulenz zwischen kommensalen und uropathogenen Bakterien beitragen. Enge Genome geben Einblick in die Genomarchitektur und mobile genetische Elemente.Die hybride Genom-Assemblierungsmethode kann auf alle kultivierbaren Bakterien angewendet werden, die aus anderen anatomischen Stellen oder Umweltnischen isoliert wurden, um ähnliche Einblicke in den Genomgehalt und die Architektur zu erhalten. Befolgen Sie das Protokoll und die Herstelleranleitung, um einen doppelsträngigen DNA-Pool vorzubereiten, und fahren Sie mit der Reinigung fort, indem Sie dem DNA-Pool das 2,5-fache Volumen paramagnetischer Perlen hinzufügen und dann das Röhrchen vorsichtig streichen, um den Inhalt zu mischen. Drehen Sie die Probe kurz bei 2.000 mal G herunter und legen Sie die Probe für fünf Minuten bei Raumtemperatur auf einen Rotator, dann pelletieren Sie die Perlen auf dem Magneten.Als nächstes waschen Sie das Pellet zweimal mit 250 Mikrolitern frisch zubereitetem 70% Ethanol in nukleasefreiem Wasser, ohne das Pellet zu stören. Lassen Sie das Rohr während des Waschens auf dem Magneten. Nach jeder Wäsche Ethanol absaugen, dann die Probe kurz bei 2.000 mal G herunterdrehen, bevor sie zum Magneten zurückgebracht wird.Restethanol pipettieren und das Pellet 30 Sekunden trocknen lassen. Nach dem Trocknen resuspendieren Sie das Pellet in 60 bis 70 Mikroliter nukleasefreiem Wasser und inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für zwei Minuten, dann pelletieren Sie die Probe auf dem Magneten, bis die Elute klar ist. Die Elute in ein sauberes 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen geben.Quantifizieren Sie den konzentrierten doppelsträngigen DNA-Pool mit einem Fluorometer und bereiten Sie dann ein Aliquot von 700 Nanogramm der Probe in einem Endvolumen von 65 Mikrolitern vor, um mit dem Adapterligationsschritt fortzufahren und den Rest des Pools bei vier Grad Celsius für einen zweiten Durchlauf nach Abschluss des ersten Laufs zu halten. Fahren Sie mit der Adapterligatur gemäß den Anweisungen des Herstellers fort. Um mit der Sequenzierung fortzufahren, mischen Sie die Priming-Puffer und primen Sie die Flusszelle.Bereiten Sie die DNA-Bibliothekslösung vor und laden Sie die Probe dropweise auf den Ladeanschluss. Starten Sie den Sequenzierungslauf. Öffnen Sie die Betriebssoftware für die Sequenzierung und klicken Sie auf die Schaltfläche Start, dann geben Sie einen Namen für das Experiment ein.Gehen Sie zu Weiter zur Kit-Auswahl, um das entsprechende Bibliotheksvorbereitungskit und Barcode-Erweiterungspaket auszuwählen, und klicken Sie dann auf Weiter, um optionen auszuführen. Wenn Sie eine ausreichende Bibliothek für einen zweiten Durchlauf vorbereiten möchten, passen Sie die Laufzeitlänge von standardmäßig 72 Stunden auf 48 Stunden an, und drücken Sie weiter auf Basecalling. Überprüfen Sie die Basecalling-Option in config fast basecalling.Setzen Sie barcoding auf aktiviert, damit die Ausgabe-FASTQ von den Barcode-Sequenzen abgeschnitten und in separate Verzeichnisse basierend auf Barcodes de-multiplexiert wird. Klicken Sie auf Weiter zur Ausgabe. Wählen Sie als Nächstes aus, wo die Ausgabesequenzierungsdaten gespeichert werden sollen.Erwarten Sie etwa 30 bis 50 Gigabyte Daten, wenn Sie nur die FASTQ-Ausgabe speichern, und mehr als 500 Gigabyte Daten, wenn Sie die FAST5-Ausgabe speichern. Wenn Sie nach der Sequenzierung mit der manuellen Filterung fortfahren möchten, deaktivieren Sie die Filteroption Qscore seven in der Leselänge ungefiltert. Andernfalls lassen Sie die Option aktiviert.Gehen Sie zur Registerkarte Setup weiter ausführen, um alle Einstellungen zu überprüfen. Wenn die Einstellungen korrekt sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Start. Andernfalls klicken Sie auf Zurück, um die erforderlichen Anpassungen vorzunehmen.Erstellen Sie im Long-Reads-Verzeichnis neue Verzeichnisse für jeden Barcode, der im Lauf verwendet wird. Kopieren Sie alle fastq-Dateien, die jedem Barcode entsprechen, in den entsprechenden Ordner. Kombinieren Sie alle fastq-Dateien für jeden Barcode aus jedem Lauf.Sobald die Dateien kombiniert sind, öffnen Sie das Terminal und navigieren Sie mit dem Befehl cd zu den Barcode-Verzeichnissen innerhalb des langen Leseverzeichnisses. Um alle fastq-Dateien pro Barcode in einer einzigen fastq-Datei zu verketten, führen Sie den Befehl aus und wiederholen Sie den Vorgang für jeden Barcode. Verwenden Sie NanoStat, um die Lesequalität der Probe zu bewerten, indem Sie den Befehl ausführen, und zeichnen Sie dann die Ergebnisse auf, indem Sie die Ausgabe zur späteren Bezugnahme in eine Text- oder Word-Datei kopieren.Nachdem die Ergebnisse gespeichert wurden, verwenden Sie NanoFilt, um MinION-Lesevorgänge zu filtern, indem Sie Lesevorgänge mit Q kleiner als sieben und einer Länge von weniger als 200 verwerfen, indem Sie den Befehl ausführen. Führen Sie in der generierten zugeschnittenen Datei NanoStat mit dem Befehl aus. Zeichnen Sie die Ergebnisse auf, indem Sie die Ausgabe in eine Text- oder Word-Datei kopieren und mit den vorherigen Ergebnissen vergleichen, um sicherzustellen, dass die Filterung erfolgreich war.Wiederholen Sie die Schritte für jeden Barcode, der im Sequenzierungslauf verwendet wird. Um eine hybride Genomassemblierung zu generieren, organisieren Sie die kurz gelesenen Dateien und die lang gelesenen Dateien in einem einzigen Verzeichnis mit dem Namen trimmed_reads. Das Verzeichnis enthält also ein zuvor generiertes fastq.gz-Datei für getrimmte lange Lesevorgänge und zwei fastq. gz-Dateien als R1 und R2 für getrimmte kurze Lesevorgänge. Navigieren Sie zu dem Verzeichnis trimmed_reads, in dem die gelesenen Dateien mit dem Befehl cd im Terminal gespeichert sind.Sobald Sie sich im richtigen Verzeichnis befinden, zippen Sie die beiden kurz gelesenen Dateien, um sie im fastq zu speichern. gz-Formatierung durch Ausführen des Befehls. Wiederholen Sie den Schritt für R1 und R2. Stellen Sie sicher, dass sich alle gelesenen Dateien im fastq befinden.gz-Formatieren und überprüfen Sie, ob alle Dateien mit demselben Isolat übereinstimmen. Starten Sie die Hybridassembly mit Unicycler, indem Sie den Befehl ausführen. Wenn der Lauf abgeschlossen ist, überprüfen Sie den Einradfahrer.Protokolldatei, um sicherzustellen, dass keine Fehler auftreten. Notieren Sie die Anzahl, Größe und den vollständigen oder unvollständigen Status des generierten Kontexts. Wenn unvollständige Kontexte im Unicycler-Protokoll identifiziert werden, führen Sie Unicycler im Fettdruckmodus erneut aus, indem Sie dem Befehl das Flag hinzufügen.Öffnen Sie Bandage und klicken Sie auf Datei, wählen Sie dann Lastdiagramm und wählen Sie die Baugruppe aus. gfa-Datei, die zuvor auf dem von Unicycler generierten unicycler_output_directory gespeichert wurde. Sobald die Datei geladen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Diagramm zeichnen auf der linken Symbolleiste und bewerten Sie, ob die Baugruppe abgeschlossen ist, indem Sie untersuchen, wie die Contigs verbunden und organisiert sind.Navigieren Sie innerhalb des Terminals mit dem Befehl cd zu dem Ordner, in dem die Unicycler-Ausgabe gespeichert ist. Führen Sie dann das quast-Protokoll aus, indem Sie den Befehl ausführen. Überprüfen Sie die von quast generierten Berichte im Ausgabeverzeichnis quast_output_directory.Navigieren Sie innerhalb des Terminals zu dem Ordner, in dem die Unicycler-Ausgabe mit dem Befehl cd gespeichert ist, und führen Sie dann prokka aus, indem Sie den Befehl ausführen. Überprüfen Sie die Anmerkungen, indem Sie die tsv-Tabelle öffnen und die generierte gff-Datei in die Sequenzanalysesoftware hochladen. Visualisieren und analysieren Sie die Anmerkungen in der Software.In den repräsentativen Gelbildern werden genomische DNA- oder gDNA-Extraktionsergebnisse dargestellt. Eine erfolgreiche Extraktion und Trennung von intakter gDNA kann beobachtet werden. Eine erfolglose Extraktion, die eine fragmentierte gDNA- und RNA-Kontamination zeigt, wird ebenfalls dargestellt.Die Genom-Assemblierungsgraphen von Bakterien wurden durch Unicycler Hybrid de novo Assembly erzeugt und durch Bandage visualisiert. Das vollständige Genom von Klebsiella oxytoca KoPF10 zeigte ein einzelnes geschlossenes Chromosom und das vollständige Genom von Klebsiella pneumoniae KpPF25 bestand aus einem geschlossenen Chromosom und fünf geschlossenen Plasmiden. Das unvollständige Chromosom von Klebsiella pneumoniae KpPF46 bestand aus zwei miteinander verbundenen Contigs.Die von Geneious Prime generierten Montagekarten für das vollständige Genom von Klebsiella oxytoca KoPF10 und Klebsiella pneumoniae KpPF25 zeigen annotierte Gene, die durch farbige Pfeile entlang des Plasmidrückgrats gekennzeichnet sind. Um sicherzustellen, dass das Laden der Durchflusszellen erfolgreich ist, filtern Sie lange Lesevorgänge mit den empfohlenen Einstellungen und stellen Sie sicher, dass sich alle Dateien im fastq befinden. gz-Format.Führen Sie den richtigen Unicycler-Befehl mit Dateien aus, die zum selben Beispiel gehören.

hybrid-de-novo-genome-assembly-for-generation-complete-genomes

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Wir beschreiben eine Methode zur Genanalyse in Chlamydia auf chemische Mutagenese und Sequenzierung des gesamten Genoms basiert durchzuführen. Außerdem wird ein System zum Austausch DNA in infizierten Zellen beschrieben, die für die genetische Kartierung verwendet werden. Diese Methode ist breit anwendbar zu mikrobiellen Systemen fehlt Transformation Systeme und molekulargenetische Werkzeuge.

Vorwärts Genetische Ansätze in<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Die Charakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaft ist ein langjähriges Ziel in der Umweltmikrobiologie. Next-Generation-Sequencing-Methoden ermöglichen nun die Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften in einer noch nie dagewesenen Tiefe mit minimalem Kosten- und Arbeitsaufwand. Wir beschreiben hier unseren Ansatz zur Sequenzierung bakterieller ribosomaler 16S-RNA-Gene mit einem Tischsequenzierer.

Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

Wir beschreiben eine effiziente, robuste und kosteneffektive Methode zur Nukleinsäure von Tupfern zur Charakterisierung von Bakteriengemeinschaften Extraktion unter Verwendung von 16S rRNA-Gen-Amplikons Sequenzierung. Das Verfahren ermöglicht eine gemeinsame Verarbeitungsansatz für mehrere Probenarten und beherbergt eine Reihe von nachgelagerten analytischen Prozessen.

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

Kontamination während der Genom-Sequenzierung von mikroskopisch kleinen Organismen bleibt ein großes Problem. Hier zeigen wir eine Methode um das Genom der Bärtierchen aus einem einzigen Exemplar mit so wenig wie 50 Pg genomic DNA ohne Verstärkung des gesamten Genoms zur Minimierung des Risikos einer Kontamination zu sequenzieren.

Frequenzverschiebungen Eingabe Genom Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von einem einzigen Tardigrade Exemplar

Dieses Protokoll soll verwenden eine Kombination aus Rechenleistung und Bank-Forschung, um neue Sequenzen zu finden, die leicht von einer Co reinigende Sequenz, die nur teilweise bekannt sein kann nicht getrennt werden können.

Neue Sequenz Entdeckung durch subtraktive Genomics

Long-Read Sequenzen erleichtern erheblich die Montage komplexer Genome und Charakterisierung von strukturellen Variation. Wir beschreiben eine Methode um ultra-lange Sequenzen durch Sequenzierung Nanopore-basierte Plattformen zu generieren. Das Konzept nimmt eine optimierte DNA-Extraktion, gefolgt von modifizierten Bibliothek Vorbereitungen, Hunderte von Kilobase liest mit moderaten Abdeckung aus menschlichen Zellen zu generieren.

Ultra-lange lesen Sequenzierung für ganze genomische DNA-Analysen

Zuvor haben wir ein Protokoll für die Sequenzierung des Amplikon-basierten Ganzgenoms Usutu Virus (USUV) auf einer Nanoporensequenzierungsplattform validiert. Hier beschreiben wir die verwendeten Methoden genauer und bestimmen die Fehlerrate der Nanoporen-R10-Durchflusszelle.

Validierung der Nanoporensequenzierung des gesamten Genoms anhand des Usutu-Virus als Beispiel

Wir beschreiben eine Methode zur Generierung von sättigungsverstärkenden Mutationsbibliotheken in gramnegativen Bakterien und der anschließenden Herstellung von DNA-Amplikonbibliotheken für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Als Beispiel konzentrieren wir uns auf den ESKAPE-Erreger Acinetobacter baumannii, aber dieses Protokoll ist für eine Vielzahl von Gram-negativen Organismen zugänglich.

Generieren von Transposon-Einfügungsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz

Dieses Protokoll wurde für die gezielte Tiefensequenzierung von 18 Arzneimittelresistenzregionen bei Mycobacterium tuberculosis unter Verwendung einer Long-Read-Sequenzierungsplattform optimiert, gefolgt von der Analyse mit einer Tuberkulose-spezifischen Bioinformatik-Pipeline, die für Long-Read-Daten ausgelegt ist.

Amplikon-Sequenzierung mit den Long-Read-Sequenzierungstechnologien

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Sequenzierung des gesamten Genoms von bakteriellen sexuell übertragbaren Infektionen aus klinischen Proben mittels Zielanreicherung ermöglicht. Diese neuartige, syndromische Panel-basierte Methode überwindet die Herausforderungen des reichlich vorhandenen menschlichen DNA-Spektrums und der geringen bakteriellen Belastung und erleichtert die genomische Überwachung von Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum und Mycoplasma...

Generierung ganzer bakterieller Genome aus klinischen Proben unter Verwendung eines Target Enrichment-Workflows

Die aktuelle Studie beschreibt einen Workflow für die Nanoporensequenzierung von Plasmiden, wenn die chromosomale Sequenz bereits bekannt oder von Interesse ist. Ein anfänglicher Plasmid-DNA-Anreicherungsschritt sorgt für eine optimale Plasmidsequenztiefe und maximiert die Anzahl der pro Flusszelle sequenzierbaren Proben.

Langlesen-Plasmid-Sequenzierung und -Montage mit Workflows auf Basis von Nanoporensequenzierungen

Erfahren Sie die hybride De-Novo-Genomassemblierung von Harnbakterien mit Kurz- und Langzeitsequenzierung. Diese Methode ermöglicht vollständige Genome für Studien zur Antibiotikaresistenz.

Hybride De-Novo-Genomassemblierung zur Erzeugung vollständiger Genome von Harnbakterien unter Verwendung von Kurz- und Langzeitsequenzierungstechnologien (Video) | JoVE Journal

Hybride De-Novo-Genomassemblierung zur Erzeugung vollständiger Genome von Harnbakterien unter Verwendung von Kurz- und Langzeitsequenzierungstechnologien

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