Name: Frei schwebende Immunfärbung von Mausgehirnen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Lernen Sie die Methode der frei schwebenden Immunfärbung für histologische Studien am Mausgehirn. Dieses standardisierte Protokoll ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse in der neuroanatomischen Forschung.

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Die Forscher wurden durch Zuschüsse des NIH unterstützt (K01DK119471 an CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 und R01DK120858 an YX), USDA/CRIS (51000-064-01S an YX) und American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) an LT.

C57BL/6J-Mäuse beiderlei Geschlechts (8-16 Wochen) wurden in der vorliegenden Studie verwendet. Die Pflege aller Tiere und alle Verfahren wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees des Baylor College of Medicine genehmigt.
1. Durchblutung
HINWEIS: Die Schritte 1.1 - 1.6 werden in einem Abzug ausgeführt.
<ol><li>Anästhesie<ol>
<li>Gießen Sie 5 ml Isofluran (siehe Materialtabelle) auf ein Papiertuch, das sich am Boden eines Exsikkators befindet. Führen Sie die Maus auf die durchlöcherte Barriere im Inneren des Exsikkators ein und warten Sie, bis die Anzeichen einer Atmung verschwunden sind. HINWEIS: Ohne Atmung hat die Maus für kurze Zeit noch Herzschlag und wird vor dem Verschwinden des Herzschlags durchblutet.</li>
		<li>Bevor Sie fortfahren, bestätigen Sie, dass es keinen Reflex auf ein Zehendrücken gibt.</li>
		<li>Befestigen Sie die Maus an einem Schaumstoffbrett, indem Sie einen Stift durch jeden Fuß fahren. Stellen Sie sicher, dass die Schaumstoffplatte in eine Schale gelegt wird, um das Verschütten von Flüssigkeit aufzufangen.</li>
	</ol></li>
	<li>Das Herz entblößen<ol>
<li>Machen Sie einen longitudinalen oberflächlichen Schnitt entlang der Mittellinie über thorax und Abdomen und bewegen Sie dann die Haut zur Seite, um die Muskelwand des Thorax und des Abdomens freizulegen. Als nächstes machen Sie einen Schnitt in der Muskelschicht, um die Leber und den Darm freizulegen. Zum Schluss schneiden Sie den Brustkorb mit einer Schere ab, um den Thorax zu öffnen und Herz und Lunge freizulegen. Ziehen Sie mit einer hämostatischen Pinzette den Brustkorb zur Seite, um den Arbeitsbereich zu erweitern.</li>
	</ol></li>
	<li>Entnahme von Terminalblut (optional)<ol>
<li>Führen Sie eine 1-ml-Spritze (siehe Materialtabelle) vorsichtig in den rechten Vorhof des Herzens ein, bis die Spitze vollständig eingebettet ist. Halten Sie die Spritze ruhig und ziehen Sie langsam Blut ab, bis das gewünschte Volumen erreicht ist. HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht über den rechten Vorhof hinauszugehen; Eine Entnahme von 300-400 μL Blut ist pro erwachsener Maus erreichbar. Zusatzstoffe wie ein Gerinnselbeschleuniger oder ein Gerinnungshemmer können je nach Zweck der Blutentnahme verwendet werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Platzierung der Perfusionskanüle<ol>
<li>Für Anfänger ein kleines Loch (<1 mm) in den linken Ventrikel des Herzens mit einer Schere schneiden und eine stumpfe Kanüle (18 G Nadel für junge Mäuse und 21 G Nadel für gealterte Mäuse) durch den linken Ventrikel in die aufsteigende Aorta einführen. Alternativ können Sie für erfahrene Experimentatoren den linken Herzventrikel direkt mit einer stumpfen Kanüle durchdringen und vorsichtig in die aufsteigende Aorta einführen.</li>
		<li>Platzieren Sie Stifte um die Verbindung der Kanüle und des gekoppelten Schlauches auf der Schaumstoffplatte, um Bewegungen während der Durchblutung zu verhindern. Alternativ können Sie eine hämostatische Pinzette verwenden, um die Kanüle an Ort und Stelle zu fixieren. Fahren Sie fort, den rechten Vorhof zu schneiden, um den Abfluss von Blut aus dem Kreislauf zu ermöglichen. HINWEIS: Die Perfusionskanüle und der gekoppelte Schlauch sind mit der Perfusionspumpe verbunden.</li>
	</ol></li>
	<li>Durchblutung mit Kochsalzlösung<ol>
<li>Schalten Sie den Salzdruckschalter ein und ziehen Sie die Maus transkardiell mit 40-60 ml Kochsalzlösung (0,9% NaCl: 25 °C, pH 7,4). Beobachten Sie den Abfluss aus dem rechten Vorhof und die Farbe der Leber genau. HINWEIS: Eine automatisierte Perfusionspumpe (siehe Materialtabelle) wird verwendet, um das Blut innerhalb von 1-2 Minuten zu spülen. Da der Druckbereich der Pumpe 1-300 mmHg beträgt, kann die Drehzahl entsprechend eingestellt werden. Wenn Kochsalzlösung aus der Nase austritt und / oder die Lunge aufgeblasen ist, verringern Sie den Druck und stellen Sie die Kanüle ein. Sobald der Abfluss kein Blut mehr enthält, wird das Gehirn ausreichend mit Kochsalzlösung gespült. In der Zwischenzeit ist die Leber frei von Blut und wird bräunlich-grau in der Farbe.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfusion mit Formalin<ol>
<li>Schalten Sie den Salzdruckschalter aus und schalten Sie den Formalin-Druckschalter ein, um die Maus mit 40 ml 10% neutral gepuffertem Formalin (10% NBF: 25 °C, pH 6,8-7,2, siehe Materialtabelle) zu durchgießen. Beobachten Sie die Gliedmaßen des Tieres auf Anzeichen von Zittern. HINWEIS: Schwanzbewegung kann auch nach Infusion von 10% NBF beobachtet werden. VORSICHT: Da NBF gefährlich ist, wird empfohlen, dass Forscher während des gesamten Verfahrens persönliche Schutzausrüstung (z. B. geeignete Atemschutzmaske, Gesichtsschutz) tragen.</li>
	</ol></li>
	<li>Gehirnisolation9<ol>
<li>Verwenden Sie eine Schere, um den Kopf zu entfernen. Machen Sie einen Mittellinienschnitt entlang des Integuments, um den Schädel freizulegen. Schneiden Sie den Haut- und Muskelaufsatz mit einer Schere ab.</li>
		<li>Machen Sie einen Schnitt am Orbitalkamm und legen Sie dann das scharfe Ende der Irisschere in das Foramen magnum. Bewegen Sie die Schere entlang der inneren Oberfläche des Schädels und halten Sie den Aufwärtsdruck aufrecht, um Schäden am Gehirn zu vermeiden. Entfernen Sie die parietalen / frontalen Knochen und Hirnhäute vorsichtig. Schließlich entfernen Sie das Gehirn vorsichtig aus dem geöffneten Schädel.</li>
	</ol></li>
	<li>Nachfixierung<ol>
<li>Legen Sie das Gehirn in ein 15-ml-Röhrchen, das mit 10 ml 5% NBF und 15% Saccharose gefüllt ist, zur Fixierung über Nacht bei 4 ° C. HINWEIS: Um 10 ml 5% NBF und 15% Saccharose herzustellen, kombinieren Sie 5 ml 10% NBF und 5 ml 30% Saccharose (w/v, gelöst in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), siehe Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass das Volumen des fixativen Puffers mindestens 10x größer ist als die Probe selbst. Anfangs schwimmt das Gehirn im Puffer und sinkt nach der Fixierung über Nacht auf den Boden.</li>
	</ol></li>
	<li>Austrocknung<ol>
<li>Übertragen Sie die Gehirnprobe auf ein 15-ml-Röhrchen, das mit 10 ml 30% Saccharose zur Dehydrierung bei 4 ° C gefüllt ist, bis sie sinkt.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Kryosektion (koronale Abschnitte)
<ol><li>Präparat<ol>
<li>Legen Sie Trockeneis auf die Höhenverstellplatte eines gleitenden Mikrotoms und warten Sie, bis weißer Frost sichtbar ist. Verteilen Sie vorsichtig 5 ml 30% Saccharose auf der Platte, um eine Schicht einer festen Basis zu bilden, nachdem die Saccharoselösung vollständig eingefroren ist. Legen Sie alle Gehirnproben (bis zu 5 Gehirnproben in einer Charge) horizontal in einer Linie auf der Saccharose und fügen Sie dann 0,5 ml 30% Saccharose auf den Boden jedes Gehirns hinzu. HINWEIS: Das Gehirn klebt sofort an der gefrorenen Saccharosebasis und friert allmählich von unten nach oben ein. Legen Sie zusätzliche Saccharose um den montierten Teil des Gehirns, um eine stabilere Basis für das Schneiden zu bilden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schnittdarstellung<ol>
<li>Nach 5-10 Minuten Einfrieren, wenn das Gehirn hart und weiß geworden ist, trimmen Sie das Gehirn, bis die gewünschte Schicht / Region erreicht ist. HINWEIS: Stellen Sie die Menge an Trockeneis auf der Platte ein, um die Temperatur zu kontrollieren. Die Temperatur ist zu niedrig, wenn Eiskristalle auf der Oberfläche des Gehirns erscheinen. Die Temperatur ist zu hoch, wenn das Gehirn weich wird und nicht mehr weiß ist.</li>
		<li>Wechseln Sie vom Trim-Modus in den Feed-Modus und schneiden Sie Hirngewebe auf 25 μm Dicke. Bereiten Sie eine 48-Well-Platte vor, die mit 1x PBS gefüllt ist, und markieren Sie fünf Wells für ein Mausgehirn. Verwenden Sie einen Pinsel, um jeden Abschnitt von einer Maus zu sammeln und in eine Vertiefung zu legen. Sammeln Sie den nachfolgenden Abschnitt derselben Maus und legen Sie ihn in die 2. Vertiefung .</li>
		<li>Wiederholen Sie 2.2.2, bis die 5. Vertiefung erreicht ist, platzieren Sie die Abschnitte 6-10 in der 1. bis 5. Vertiefung und so weiter. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang für den Rest des Gehirns gleichzeitig. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Abschnitte einer Maus in anatomischer Reihenfolge in den 5 Vertiefungen gesammelt sind. HINWEIS: Nach diesem Verfahren werden die Gehirnschnitte jeder Maus in 5 Serien aliquotediert, die für bis zu 5 verschiedene histologische Studien verwendet werden können.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lagerung<ol>
<li>Verwenden Sie einen Pinsel, um die Abschnitte von jedem Bohrloch auf ein 1,5 ml Mikroröhrchen zu übertragen, das mit kryoprotektivem Puffer (20% Glycerin, 30% Ethylenglykol und 50% PBS) gefüllt ist, und lagern Sie die Proben bei -20 ° C. HINWEIS: Diese Abschnitte, die in kleinen Röhrchen (1,5 ml) gelagert werden, können Platz im Gefrierschrank sparen, und die Integrität der Abschnitte kann für mehrere Monate erhalten bleiben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Freischwebende WFA-Färbung und Anti-AVP-Immunfärbung
<ol><li>Legen Sie ein Zellsieb in eine Vertiefung einer mit PBS gefüllten 6-Well-Zellkulturplatte und verwenden Sie einen Pinsel, um eine Reihe von Gehirnabschnitten in das Zellsieb zu übertragen. Spülen Sie die Abschnitte in PBS ab, indem Sie das Zellsieb in eine andere mit PBS gefüllte Vertiefung überführen. Spülen Sie 6 x 10 min auf einem Shaker für Abschnitte, die in Kryoprotektorpuffer gelagert sind, und 3 x 10 min für frisch geschnittene Abschnitte. HINWEIS: Alle Waschvorgänge werden in einer 6-Well-Zellkulturplatte mit einem Zellsieb in jedem Bohrloch durchgeführt (siehe Materialtabelle). Jedes Sieb hält die Gehirnabschnitte von Interesse von jeder Maus. Um Reagenzien zu sparen, werden alle unten beschriebenen Inkubationsverfahren in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen durchgeführt. Verwenden Sie zwischen dem Waschen und der Inkubation einen Pinsel, um die Gehirnabschnitte zwischen jedem Zellsieb und jedem Röhrchen zu übertragen. Für das Waschen mit PBS sind 12 ml für jeden Brunnen ausreichend.</li>
	<li>1 ml Biotin-markierte WFA-Lösung (1:1.000) in PBT-Puffer (2,5 ml Triton X-100 gelöst in 1.000 ml PBS) in einem 1,5-ml-Röhrchen herstellen. Übertragen Sie Gehirnabschnitte vom Zellsieb in die Röhre und inkubieren Sie bei Raumtemperatur auf einer Schaukelplattform ~ 50 U / min über Nacht.</li>
	<li>Spülen Sie die Gehirnschnitte mit PBS für 3 x 10 min, wie in 3.1 beschrieben.</li>
	<li>1 ml Streptavidin-Dylight 488 (1:500)-Lösung in PBT in einem 1,5-ml-Röhrchen zubereiten. Gehirnabschnitte in die Röhre übertragen und bei Raumtemperatur 2 h auf einer Schaukelplattform mit ~50 U/min inkubieren. HINWEIS: Decken Sie die Platte mit Folie ab, um Lichteinwirkung von diesem Schritt nach vorne zu vermeiden.</li>
	<li>Spülen Sie die Gehirnschnitte mit PBS für 3 x 10 min. Inkubieren Sie die Gehirnschnitte in blockierendem Puffer (3% normales Eselserum verdünnt in PBT) für 2 h bei Raumtemperatur. HINWEIS: Die Wahl des blockierenden Serums wird durch die Spezies bestimmt, aus der der sekundäre Antikörper erzeugt wird. z.B. wenn der sekundäre Antikörper von Ziege stammt, sollte normales Ziegenserum verwendet werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Gehirnabschnitte in primären Antikörpern (Kaninchen-Anti-AVP, 1:500) bei Raumtemperatur auf einer Schaukelplattform bei ~ 50 U / min über Nacht. HINWEIS: Bereiten Sie sowohl primäre als auch sekundäre Antikörper im Blockierungspuffer vor. Die Konzentration, die Dauer der Inkubation und die Temperatur der Inkubation müssen in Pilotstudien optimiert werden.</li>
	<li>Spülen Sie die Gehirnschnitte mit PBS für 3 x 10 min. Inkubieren Sie die Hirnschnitte in sekundären Antikörpern (Alexa Flour 594 Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L), 1:500) bei Raumtemperatur für 2 h auf einer Schaukelplattform bei ~50 U/min. Spülen Sie die Gehirnschnitte mit PBS für 3 x 10 min.</li>
</ol>4. Montage
<ol><li>Füllen Sie zwei Petrischalen (Durchmesser 150 mm) mit je 100 ml 1x PBS. Übertragen Sie alle Gehirnabschnitte von einem Sieb in die erste Schale und richten Sie die Gehirnabschnitte in neuroanatomischer Reihenfolge von kaudal bis rostral aus. HINWEIS: Um zu vermeiden, dass Abschnitte von verschiedenen Tieren vermischt werden, montieren Sie eine Reihe von Gehirnabschnitten von jeweils einem Tier.</li>
	<li>Nachdem alle Gehirnabschnitte in der ersten Schüssel ausgerichtet sind, tauchen Sie einen Schieber in die zweite Schüssel mit einem leicht geneigten Ende mit einem Ständer ein (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2). Verwenden Sie einen feinen Pinsel, um einen Gehirnabschnitt direkt unter der Luftpufferschnittstelle vorsichtig auf den geneigten Schlitten zu legen. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang mit einem anderen Gehirnabschnitt und montieren Sie ihn Seite an Seite mit dem ersten Abschnitt.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Transferpipette, um den Puffer langsam und vorsichtig zu entfernen, um sein Niveau zu senken, bis beide Gehirnabschnitte vollständig über der Luft-Puffer-Schnittstelle liegen. HINWEIS: Achten Sie darauf, die Störung der Pufferoberfläche zu minimieren, da sonst die Gehirnabschnitte wegschweben können. Wenn sie trocken ist, haftet diese Reihe von Gehirnabschnitten fest an der Rutsche. Passen Sie bei Bedarf die Abschnitte auf dem Objektträger vorsichtig an, um sicherzustellen, dass keine Falten oder Falten im Gewebe vorhanden sind, wenn die Abschnitte noch nass sind.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der untere Teil der Folie erreicht ist. Wiederholen Sie den Vorgang so lange, bis alle Abschnitte auf dem/den Dia(s) montiert sind.</li>
</ol>5. Coverlipping
<ol><li>Nachdem alle Abschnitte getrocknet sind (1-24 h bei Raumtemperatur), legen Sie 80-100 μL Anti-Fading-Montagemedium mit DAPI (siehe Materialtabelle) auf den Objektträger und tragen Sie vorsichtig einen Glasdeckglas auf, um die Proben abzudecken. HINWEIS: Tragen Sie den Glasdeckglas vorsichtig und langsam auf, um Blasen zu vermeiden.</li>
	<li>Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerkasten (siehe Materialtabelle) und lagern Sie sie bei 4 °C. HINWEIS: Bilden Sie alle Abschnitte innerhalb von 1-3 Tagen ab, um ein Verblassen der Fluoreszenz und die Entwicklung von Autofluoreszenz zu vermeiden.</li>
</ol>6. Bildgebung
<ol><li>Schalten Sie den Scanner und den Computer ein (siehe Materialtabelle). Positionieren Sie die Dias im Diahalter mit der Ladevorrichtung und setzen Sie die Halterung in den Scanner ein. HINWEIS: Der Scanner ermöglicht das scannen mehrerer Kanäle (z. B. 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), grüne und rote Kanäle) gleichzeitig. Der Scanner scannt Dias nur mit einer 20-fachen Vergrößerung, und ein herkömmliches Fluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle) kann verwendet werden, wenn eine höhere Vergrößerung (z. B. 40-fach) erforderlich ist.</li>
	<li>Öffnen Sie die Software für den Scanner (siehe Tabelle der Materialien). Wählen Sie den entsprechenden Speicherort und das entsprechende Scanprofil aus.</li>
	<li>Starten Sie den Vorschauscan, indem Sie auf die Schaltfläche Vorschauscan starten klicken. Öffnen Sie nach dem Vorschauscan den Gewebeerkennungsassistenten und kreisen Sie die Bereiche ein, die für die Bildgebung von Interesse sind.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Scan starten, nachdem Sie die Regionen für die Bildgebung ausgewählt haben. Warten Sie, bis das Gerät den Scanvorgang abgeschlossen hat. Überprüfen Sie die Ergebnisdatei und exportieren Sie die Bilder. HINWEIS: Wenn das Profil für das Dia ungeeignet ist, passen Sie es an, indem Sie die Belichtungszeit oder Lichtstärke neu fokussieren und ändern, um das Profil an das Gewebe anzupassen. Weitere technische Details finden Sie in den Anweisungen für den Scanner (Tabelle der Materialien).</li>
</ol>

<ol><li>Must, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Disease+burden+associated+with+overweight+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">The Disease burden associated with overweight and obesity.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).</li>
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<li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+serotonin+2C+receptors+in+dopamine+neurons+inhibits+binge-like+eating+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biololgical+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice.</a> Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Dieses Protokoll bietet eine etablierte Methode für neuroanatomische Studien des Mausgehirns, einschließlich Perfusion, Gewebeschnitt, frei schwebende Immunfärbung, Gewebemontage und Bildgebung. Einige wichtige Details, die für konsistente und zuverlässige Ergebnisse unerlässlich sind, müssen jedoch optimiert werden.
Die Qualität der Perfusion ist entscheidend für eine erfolgreiche Färbung. Die Färbeergebnisse können beeinträchtigt werden, wenn Blut im Gehirn verbleibt, da Blutkörperchen (z. B...

Die Prävalenz von Fettleibigkeit und damit verbundenen Komorbiditäten hat epidemische Ausmaße erreicht, was zu einer enormen sozioökonomischen Belastung führt1,2. Verschiedene Mausmodelle wurden entwickelt, um die biologischen Prozesse, die für Fettleibigkeit verantwortlich sind, besser zu verstehen3,4. Da in diesen Tiermodellen zentrale Mechanismen für die Regulation der Energiehomöostase wichtig sind, sind neuroanatomische Untersuchungen von Mausgehirnen zu einer notwendigen Technik auf diesem Gebiet geworden. Die Qualität, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit von Hirnhistologietechniken variieren jedoch aus verschiedenen Gründen (z. B. Antikörper, Gewebe, Behandlungen, Spezies, Forschungsziele) erheblich zwischen Labors und sogar Forschern innerhalb desselben Labors. Daher ist es notwendig, ein allgemeines Protokoll für histologische Studien des Mausgehirns festzulegen, einschließlich Perfusion, Hirnschnitt, frei schwebende Immunfärbung, Gewebemontage und Bildgebung. In der Zwischenzeit können Anfänger dieses Protokoll schnell erlernen, beherrschen und anpassen, um ihre individuellen Bedürfnisse zu erfüllen.
Die immunhistochemische Färbung ist eine etablierte Methode, die umfassend verwendet wurde, um spezifische Zelltypen, mRNAs und Proteine in einer Vielzahl von Geweben (z. B. Gehirn und periphere Gewebe) zu visualisieren5,6. Genauer gesagt kann ein Antigen von Interesse durch einen spezifischen primären Antikörper und einen entsprechenden sekundären Antikörper markiert werden, der mit einem Enzym (z. B. chromogener Immunhistochemie) oder einem fluoreszierenden Farbstoff (Fluoresceinisothiocyanat) verbunden ist6. Als Beispiel für den Nutzen dieser Techniken wurden β-Endorphin [ein Peptid, das von Pro-Opiomelanocortin (POMC) kodiert wird] und c-fos (ein Marker für neuronale Aktivität) im Bogenkern gefärbt. Es wurde gezeigt, dass die Deletion von Tryptophanhydroxylase 2 (ein enzymintegrante Serotoninsynthese) im dorsalen Raphe-Kern die c-fos-Expression in POMC-Neuronen im bogenförmigen Kern verringert7. Zusätzlich wurde die Verteilung der Vitamin-D-Rezeptor-mRNA im Mausgehirn mittels In-situ-Hybridisierung (RNAscope)8 kartiert. Dieser Beitrag stellt eine zuverlässige und effiziente Methode mit einem Schritt-für-Schritt-Workflow für die frei schwebende Immunfärbung vor, die darauf abzielt, die Qualität und Reproduzierbarkeit histologischer Studien des Mausgehirns zu verbessern.

<table><tbody><tr><td>Alexa Mehl 594 Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 30 % Saccharose</td><td>VWR</td><td>470302</td><td>30 g Saccharose in 100 mL PBS zerlegt</td></tr><tr><td>; Neutral gepuffertes Formalin</td><td>VWR</td><td>16004-128</td><td>10%, 25 &Grad; C, pH 6,8-7,2</td></tr><tr><td>1 mL Sub-Q Spritze</td><td>BD</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>48-Well-Zellkulturplatte</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturplatte</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Antifading-Einbettmedien mit DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Autoklavierbarer Kunststoff-Exsikkator</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>5315-0150</td><td></td></tr><tr><td>AVP-Antikörper</td><td>Phoenix Pharmaceuticals</td><td>H-065-07</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Kryoprotektivan-Puffer</td><td>Benutzerpräferenz</td><td>Nicht zutreffend</td><td>20 % Glycerin, 30 % Ethylenglykol und 50 % PBS</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Covetrus</td><td>11695-6777-2</td><td></td></tr><tr><td>Leica DFC310FX Mikroskop</td><td>Leica</td><td>Nicht zutreffend</td><td></td></tr><tr><td>Objektträgerboxen (50 Plätze)</td><td>VWR</td><td>Nicht zutreffend</td><td></td></tr><tr><td>PBT</td><td>Benutzerpräferenz</td><td>Nicht zutreffend</td><td>2,5 mL Triton X-100 aufgelöst in 1000 mL PBS</td></tr><tr><td>Perfusion zwei automatisierte Perfusionssysteme</td><td>Leica</td><td>39471005</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 20x</td><td>VWR</td><td>VWRVE703-1L</td><td>25 &deg; C, pH 7,3-7,5, 1x Zusammensetzung:137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 9,8 mM Phosphatpuffer</td></tr><tr><td>Gleitmikrotom Microm HM450</td><td>ThermoFisher</td><td>Microm HM450</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>RICCA Chemikalie</td><td>7220-32</td><td>0,9%, 25 &deg; C, pH 7,4</td></tr><tr><td>Streptavidin Protein, DyLight 488</td><td>ThermoFisher</td><td>#21832</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>089k01921</td><td></td></tr><tr><td>WFA Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1516</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Z1 Scanner</td><td>Zeiss</td><td>Nicht zutreffend</td><td></td></tr><tr><td>Zen 3.1 Software</td><td></td><td></td><td>Scanner Software</td></tr></tbody></table>

frei schwebende immunfärbung von mausgehirnen

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Die immunhistochemische Färbung von Mäusegehirnen ist eine Routinetechnik, die häufig in den Neurowissenschaften verwendet wird, um zentrale Mechanismen zu untersuchen, die der Regulation des Energiestoffwechsels und anderer neurobiologischer Prozesse zugrunde liegen. Die Qualität, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse der Hirnhistologie kann jedoch zwischen den Labors variieren. Für jedes Färbeexperiment ist es notwendig, die Schlüsselverfahren basierend auf Unterschieden in Spezies, Geweben, Zielproteinen und den Arbeitsbedingungen der Reagenzien zu optimieren. Dieses Papier demonstriert einen zuverlässigen Workflow im Detail, einschließlich intraaortaler Perfusion, Hirnschnitt, frei schwebender Immunfärbung, Gewebemontage und Bildgebung, die von Forschern auf diesem Gebiet leicht verfolgt werden können.
Diskutiert wird auch, wie diese Verfahren modifiziert werden können, um den individuellen Bedürfnissen der Forscher gerecht zu werden. Um die Zuverlässigkeit und Effizienz dieses Protokolls zu veranschaulichen, wurden perineuronale Netze mit Biotin-markiertem Wisteria florbunda agglutinin (WFA) und Arginin-Vasopressin (AVP) mit einem Anti-AVP-Antikörper im Mausgehirn gefärbt. Schließlich wurden die kritischen Details für das gesamte Verfahren und die Vorteile dieses Protokolls im Vergleich zu denen anderer Protokolle angesprochen. Zusammengenommen stellt dieser Artikel ein optimiertes Protokoll für die frei schwebende Immunfärbung von Mausgehirngewebe vor. Die Einhaltung dieses Protokolls erleichtert diesen Prozess sowohl für Nachwuchs- als auch für Senior-Wissenschaftler, um die Qualität, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit von Immunostaining-Studien zu verbessern.

Das Flussdiagramm dieses Protokolls ist in Abbildung 1 kurz dargestellt. Das Kryosektionsverfahren dieses Labors ist in Abbildung 2A dargestellt, in der 5 Gehirnproben gleichzeitig geschnitten wurden. Die Montage von Hirnschnitten ist in Abbildung 2B dargestellt, und ein vollständig montierter Objektträger mit Hirnschnitten ist in Abbildung 2C dargestellt. In Abbildung 3 wu...

Dieses Protokoll beschreibt einen effizienten und reproduzierbaren Ansatz für histologische Studien des Mausgehirns, einschließlich Perfusion, Hirnschnitt, frei schwebende Immunfärbung, Gewebemontage und Bildgebung.

Frei schwebende Immunfärbung von Mausgehirnen

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Die immunhistochemische Färbung von Mäusegehirnen ist eine häufig verwendete Technik in der neurowissenschaftlichen Forschung. Die Qualität, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse der Hirnhistologie kann jedoch zwischen verschiedenen Forschern und Labors variieren. Wir präsentieren eine etablierte Methodik für histologische Studien von Mausgehirnen, die sich als reproduzierbar, zuverlässig und effizient erwiesen hat.Um das Verfahren zu demonstrieren, wird Dr. Chunmei Wang, ein Assistenzprofessor aus meinem Labor, helfen Nachdem er die erfolgreiche Anästhesie bei einer acht bis 16 Wochen alten C57 black/ 6J-Maus bestätigt hat, fixieren Sie die Maus auf einem Schaumstoffbrett und machen Sie einen longitudinalen oberflächlichen Schnitt entlang der Mittellinie über Thorax und Bauch, dann bewegen Sie die Haut zur Seite, um die Muskelwand des Brustkorbs und des Abdomens freizulegen. Als nächstes machen Sie einen Schnitt in der Muskelschicht, um die Leber und den Darm freizulegen. Schneiden Sie dann mit einer Schere den Brustkorb ab, um den Thorax zu öffnen und Herz und Lunge freizulegen.Ziehen Sie den Brustkorb mit einer hämostatischen Pinzette zur Seite, um den Arbeitsbereich zu erweitern. Nächster. um eine Perfusionskanüle zu platzieren, dringen Sie mit einer stumpfen Kanüle direkt in den linken Herzventrikel ein und führen Sie sie vorsichtig in die aufsteigende Aorta ein. Legen Sie Stifte um die Verbindung der Kanüle und des gekoppelten Schlauches auf die Schaumstoffplatte, um die Kanüle während der Durchblutung an Ort und Stelle zu fixieren, und schneiden Sie den rechten Vorhof ab, um den Abfluss von Blut aus dem Kreislauf zu ermöglichen.Für die Durchblutung mit Kochsalzlösung den Salzdruckschalter einschalten und die Maus transkardiell mit 40 bis 60 Milliliter Kochsalzlösung durchtränken. Beobachten Sie den Abfluss aus dem rechten Vorhof und die Farbe der Leber genau. Als nächstes, um mit Formalin zu perfundieren, schalten Sie den Salzdruckschalter aus und schalten Sie den Formalin-Druckschalter ein, um die Maus mit 40 Millilitern 10% neutral-gepuffertem Formalin zu perfundieren.Beobachten Sie die Gliedmaßen des Tieres auf Anzeichen von Zittern. Verwenden Sie zur Gehirnisolierung eine Schere, um den Kopf zu entfernen, und machen Sie einen Mittellinienschnitt entlang des Integuments, um den Schädel freizulegen, und schneiden Sie dann die Haut und den Muskelansatz ab. Als nächstes machen Sie einen Schnitt am Orbitalkamm und legen Sie das scharfe Ende der Irisschere in das Foramen magnum.Bewegen Sie die Schere entlang der inneren Oberfläche des Schädels und halten Sie den Aufwärtsdruck aufrecht, um Schäden am Gehirn zu vermeiden. Entfernen Sie dann vorsichtig die parietalen und frontalen Knochen und Hirnhäute, bevor Sie das Gehirn aus dem offenen Schädel entfernen. Trockeneis auf die Höhenverstellplatte eines gleitenden Mikrotoms legen und warten, bis weißer Frost sichtbar ist, dann verteilen Sie vorsichtig fünf Milliliter 30% Saccharose auf der Platte, um eine feste Grundschicht zu bilden, nachdem die Saccharose gefroren ist.Als nächstes platzieren Sie alle Gehirnproben horizontal in einer Linie auf der Saccharosebasis mit 500 Mikrolitern 30% Saccharose. Nach fünf bis 10 Minuten einfrieren, wenn das Gehirn hart und weiß geworden ist, trimmen Sie das Gehirn, bis die gewünschte Schicht oder Region erreicht ist, und wechseln Sie dann vom Trimmmodus in den Feed-Modus und schneiden Sie Hirngewebe, um 25 Mikrometer dicke Abschnitte zu erzeugen. Bereiten Sie als Nächstes eine mit PBS gefüllte 48-Well-Platte vor und markieren Sie fünf Vertiefungen für ein Mausgehirn.Sammeln Sie mit einem Pinsel einen Abschnitt und legen Sie ihn in einen Brunnen, dann sammeln Sie den nachfolgenden Abschnitt derselben Maus und legen Sie ihn in den zweiten Brunnen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die fünfte Vertiefung erreicht ist, indem Sie die Abschnitte sechs bis 10 in der ersten bis fünften Vertiefung platzieren und so weiter. Legen Sie ein Zellsieb in eine Vertiefung einer mit PBS gefüllten Zellkulturplatte mit sechs Wellen und übertragen Sie mit einem Pinsel eine Reihe von Gehirnabschnitten in das Zellsieb.Spülen Sie diese Abschnitte in PBS ab, indem Sie das Zellsieb in eine andere mit PBS gefüllte Vertiefung auf dem Shaker überführen. Übertragen Sie dann die Gehirnabschnitte vom Zellsieb in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, das einen Milliliter Biotin-markiertes WFA enthält, und inkubieren Sie über Nacht auf einer Schaukelplattform mit 50 U / min. Am nächsten Tag spülen Sie die Gehirnabschnitte wie zuvor demonstriert mit PBS ab, übertragen Sie die Abschnitte dann in ein Röhrchen mit einem Milliliter Streptavidin-Daylight 488-Lösung und inkubieren Sie zwei Stunden lang auf einer Schaukelplattform.Nachdem Sie die Gehirnabschnitte erneut mit PBS gespült haben, inkubieren Sie sie zwei Stunden lang in Blockpuffer, gefolgt von einer Inkubation in primären Antikörpern über Nacht auf einer Schaukelplattform. Am nächsten Tag, nach PBS-Spülungen, inkubieren Sie die Abschnitte in sekundären Antikörpern für zwei Stunden. Füllen Sie zwei Petrischalen mit 100 Milliliter PBS und übertragen Sie alle Gehirnabschnitte von einem Sieb in die erste Schale.Richten Sie die Gehirnabschnitte in neuroanatomischer Reihenfolge von kaudal bis rostral aus. Tauchen Sie dann einen Schieber in die zweite Schüssel mit einem leicht geneigten Ende mit einem Ständer ein und legen Sie mit einem feinen Pinsel vorsichtig einen Gehirnabschnitt direkt unter der Luftpufferschnittstelle auf den geneigten Schieber. Als nächstes entfernen Sie mit einer Transferpipette langsam und vorsichtig den Puffer, um sein Niveau zu senken, bis der Gehirnabschnitt vollständig über der Luftpufferschnittstelle liegt.Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der Boden des Objektträgers erreicht ist und alle Abschnitte auf dem Objektträger montiert sind. Schalten Sie für die Bildgebung den Scanner und den Computer ein, positionieren Sie dann die Dias im Diahalter mit der Ladevorrichtung und setzen Sie den Halter in den Scanner ein. Öffnen Sie die Software für den Scanner und wählen Sie den entsprechenden Speicherort und das Scanprofil aus.Starten Sie den Vorschauscan, indem Sie auf die Schaltfläche Vorschauscan starten klicken. Öffnen Sie nach dem Scan den Gewebeerkennungsassistenten und kreisen Sie die Bereiche ein, die für die Bildgebung von Interesse sind. Nachdem Sie die Bereiche für die Bildgebung ausgewählt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Scan starten und warten Sie, bis das Gerät den Scanvorgang abgeschlossen hat.Überprüfen Sie die Ergebnisdatei und exportieren Sie die Bilder. Hier sind repräsentative Fluoreszenz-Immunhistochemie-Bilder von koronalen Maus-Hirnschnitten bei Bregma-negativen 0,82 Millimetern gezeigt, die die Verteilung von Glyzinien floribunda agglutinin, Arginin Vasopressin und DAPI zeigen. Glyzinien floribunda Agglutininsignale werden im perifornischen Bereich des vorderen Hypothalamus und des retikulären Kerns beobachtet, während Arginin-Vasopressin-Signale im paraventrikulären Kern beobachtet werden.Wenn Sie dieses Protokoll zum ersten Mal ausprobieren, empfehlen wir, es unter der Aufsicht eines erfahrenen Forschers durchzuführen. Das Protokoll wird dazu beitragen, optimale und konsistente histologische Ergebnisse zwischen verschiedenen Forschern und Labors zu generieren, und wird als Referenz für Anfänger dienen, die diese Technik erlernen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Großflächige Immundetektion der Zielproteine ​​in der gesamten Primatengehirn wird durch den Einsatz von neuartigen Gewebe Einbettung und Schneiden Methoden mit dem Einsatz von kreativen Apparat für Batch-Färbung von mehreren frei schwebenden Abschnitte zu einem bestimmten Zeitpunkt in Kombination möglich.

Batch Immunfärbung für Large-Scale Protein-Nachweis im Whole Affenhirn

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Immunfärbung eines fixierten Maushirngewebeschnitts mit fluoreszenzmarkierten Astrozyten unter Verwendung von Primär- und Sekundärantikörpern und die Aufnahme der Bilder der gefärbten Astrozyten durch konfokale Mikroskopie.

Immunfärbung von fluoreszenzmarkierten Astrozyten in einem Schnitt aus einem Gewebeschnitt aus dem Gehirn einer Maus

Quelle: Schönherr, S., et. al. Kombinierte optogenetische und Gefrierfraktur-Replikat-Immunmarkierung zur Untersuchung der inputspezifischen Anordnung von Glutamatrezeptoren in der Maus-Amygdala. J. Vis. exp. (2016)Dieses Video zeigt die Immunmarkierung von gefrierfrakturierten Nachbildungen von Hirngewebe von Mäusen für die Elektronenmikroskopie. Die gebrochenen und beschichteten Repliken werden verdaut, um Rezeptoren freizulegen. Primäre und goldmarkierte Sekundärantikörper werden...

Immunmarkierung von neuronalen Membranproteinen in einer gefriergebrochenen Probe von Hirngewebe der Maus

Quelle: Baleriola, J., et. al., Nachweis axonal lokalisierter mRNAs in Hirnschnitten mittels hochauflösender In-situ-Hybridisierung.  J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt den Nachweis von mRNA in cholinergen Axonen in fixierten Maus-Hippocampus-Schnitten mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung und Antikörperfärbung. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt die räumliche Lokalisierung von sondenmarkierten mRNAs und Cholinacetyltransferase in cholinergen Neuronen.

Immunfärbung von Neuronen in Hirnschnitten von Mäusen nach Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Dieses Einführungsprotokoll beschreibt die Reagenzien, Geräte und Techniken, die erforderlich sind, um die immunhistochemische Färbung von Nagetiergehirnen durchzuführen, am Beispiel von Markern für Mikroglia und neuronale Elemente.

Primer für die Immunhistochemie auf gefriergeschnitten Rat Brain Tissue: Beispiel Färbung für Mikroglia und Neuronen

Hier beschreiben wir einen quantitativen Ansatz zur Bestimmung der Verteilung der synaptischen Protein im Verhältnis zu einer Marker Protein mit Immunfluoreszenz-Färbung, konfokalen Mikroskopie und Computer-basierte Analyse.

Quantifizierung der heterogenen Verteilung der synaptischen Protein im Gehirn Maus mit Immunfluoreszenz

Konvektionsverstärkte Abgabe (CED) ist eine Methode, die eine effektive Abgabe von Therapeutika in das Gehirn durch direkte Perfusion großer Gewebevolumina ermöglicht. Das Verfahren erfordert den Einsatz von Kathetern und ein optimiertes Injektionsverfahren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik für CED eines Antikörpers in ein Maushirn.

Lieferung von Antikörpern in das Murine Gehirn über Konvektionsverstärkte Lieferung

Dieses Protokoll beschreibt einen schrittweisen Workflow für die immunfluoreszierende Costainierung von IBA1 und TMEM119, zusätzlich zur Analyse der mikrogliaalen Dichte, Verteilung und Morphologie sowie der peripheren myeloischen Zellinfiltration im Gehirngewebe der Maus.

Immunfluoreszenzfärbung mit IBA1 und TMEM119 für Mikroglia-Dichte, Morphologie und periphere Myeloid-Zellinfiltrationsanalyse im Maushirn

Die Free-Floating-Technik ermöglicht es Forschern, histologisch basierte Färbungen einschließlich Immunhistochemie an festen Gewebeschnitten durchzuführen, um biologische Strukturen, Zelltypen sowie Proteinexpression und -lokalisation sichtbar zu machen. Dies ist eine effiziente und zuverlässige histochemische Technik, die für die Untersuchung einer Vielzahl von Geweben wie Gehirn, Herz und Leber nützlich sein kann.

Histologische Färbungen mit frei schwebenden Gewebeschnitten

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kombination von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und Fluoreszenz-Immunhistochemie (IHC) sowohl in frisch gefrorenen als auch in fixierten Maus-Hirnschnitten, mit dem Ziel, Multilabel-FISH und Fluoreszenz-IHC-Signal zu erreichen. IHC zielte auf zytoplasmatische und membrangebundene Proteine ab.

Kombination von Multiplex-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit fluoreszierender Immunhistochemie an frischen, gefrorenen oder fixierten Mäusehirnschnitten

Die Fähigkeit, Stammzellen und ihre Nachkommen mit einem Fluorophor unter Verwendung einer induzierbaren transgenen Linienverfolgungs-Mauslinie dauerhaft zu markieren, ermöglicht eine räumliche und zeitliche Analyse von Aktivierung, Proliferation, Migration und / oder Differenzierung in vivo. Die Abstammungsverfolgung kann neue Informationen über die Verpflichtung der Abstammung, die Reaktion auf Interventionen und die Multipotenz aufdecken.

Abstammungsverfolgung von induzierbaren fluoreszenzmarkierten Stammzellen im erwachsenen Mäusegehirn

Lernen Sie die Methode der frei schwebenden Immunfärbung für histologische Studien am Mausgehirn. Dieses standardisierte Protokoll ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse in der neuroanatomischen Forschung.

Frei schwebende Immunfärbung von Mausgehirnen

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