Frei schwebende Immunfärbung von Mausgehirnen

Die immunhistochemische Färbung von Mäusegehirnen ist eine häufig verwendete Technik in der neurowissenschaftlichen Forschung. Die Qualität, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse der Hirnhistologie kann jedoch zwischen verschiedenen Forschern und Labors variieren. Wir präsentieren eine etablierte Methodik für histologische Studien von Mausgehirnen, die sich als reproduzierbar, zuverlässig und effizient erwiesen hat.

Um das Verfahren zu demonstrieren, wird Dr. Chunmei Wang, ein Assistenzprofessor aus meinem Labor, helfen Nachdem er die erfolgreiche Anästhesie bei einer acht bis 16 Wochen alten C57 black/ 6J-Maus bestätigt hat, fixieren Sie die Maus auf einem Schaumstoffbrett und machen Sie einen longitudinalen oberflächlichen Schnitt entlang der Mittellinie über Thorax und Bauch, dann bewegen Sie die Haut zur Seite, um die Muskelwand des Brustkorbs und des Abdomens freizulegen. Als nächstes machen Sie einen Schnitt in der Muskelschicht, um die Leber und den Darm freizulegen. Schneiden Sie dann mit einer Schere den Brustkorb ab, um den Thorax zu öffnen und Herz und Lunge freizulegen.

Ziehen Sie den Brustkorb mit einer hämostatischen Pinzette zur Seite, um den Arbeitsbereich zu erweitern. Nächster. um eine Perfusionskanüle zu platzieren, dringen Sie mit einer stumpfen Kanüle direkt in den linken Herzventrikel ein und führen Sie sie vorsichtig in die aufsteigende Aorta ein. Legen Sie Stifte um die Verbindung der Kanüle und des gekoppelten Schlauches auf die Schaumstoffplatte, um die Kanüle während der Durchblutung an Ort und Stelle zu fixieren, und schneiden Sie den rechten Vorhof ab, um den Abfluss von Blut aus dem Kreislauf zu ermöglichen.

Für die Durchblutung mit Kochsalzlösung den Salzdruckschalter einschalten und die Maus transkardiell mit 40 bis 60 Milliliter Kochsalzlösung durchtränken. Beobachten Sie den Abfluss aus dem rechten Vorhof und die Farbe der Leber genau. Als nächstes, um mit Formalin zu perfundieren, schalten Sie den Salzdruckschalter aus und schalten Sie den Formalin-Druckschalter ein, um die Maus mit 40 Millilitern 10% neutral-gepuffertem Formalin zu perfundieren.

Beobachten Sie die Gliedmaßen des Tieres auf Anzeichen von Zittern. Verwenden Sie zur Gehirnisolierung eine Schere, um den Kopf zu entfernen, und machen Sie einen Mittellinienschnitt entlang des Integuments, um den Schädel freizulegen, und schneiden Sie dann die Haut und den Muskelansatz ab. Als nächstes machen Sie einen Schnitt am Orbitalkamm und legen Sie das scharfe Ende der Irisschere in das Foramen magnum.

Bewegen Sie die Schere entlang der inneren Oberfläche des Schädels und halten Sie den Aufwärtsdruck aufrecht, um Schäden am Gehirn zu vermeiden. Entfernen Sie dann vorsichtig die parietalen und frontalen Knochen und Hirnhäute, bevor Sie das Gehirn aus dem offenen Schädel entfernen. Trockeneis auf die Höhenverstellplatte eines gleitenden Mikrotoms legen und warten, bis weißer Frost sichtbar ist, dann verteilen Sie vorsichtig fünf Milliliter 30% Saccharose auf der Platte, um eine feste Grundschicht zu bilden, nachdem die Saccharose gefroren ist.

Als nächstes platzieren Sie alle Gehirnproben horizontal in einer Linie auf der Saccharosebasis mit 500 Mikrolitern 30% Saccharose. Nach fünf bis 10 Minuten einfrieren, wenn das Gehirn hart und weiß geworden ist, trimmen Sie das Gehirn, bis die gewünschte Schicht oder Region erreicht ist, und wechseln Sie dann vom Trimmmodus in den Feed-Modus und schneiden Sie Hirngewebe, um 25 Mikrometer dicke Abschnitte zu erzeugen. Bereiten Sie als Nächstes eine mit PBS gefüllte 48-Well-Platte vor und markieren Sie fünf Vertiefungen für ein Mausgehirn.

Sammeln Sie mit einem Pinsel einen Abschnitt und legen Sie ihn in einen Brunnen, dann sammeln Sie den nachfolgenden Abschnitt derselben Maus und legen Sie ihn in den zweiten Brunnen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die fünfte Vertiefung erreicht ist, indem Sie die Abschnitte sechs bis 10 in der ersten bis fünften Vertiefung platzieren und so weiter. Legen Sie ein Zellsieb in eine Vertiefung einer mit PBS gefüllten Zellkulturplatte mit sechs Wellen und übertragen Sie mit einem Pinsel eine Reihe von Gehirnabschnitten in das Zellsieb.

Spülen Sie diese Abschnitte in PBS ab, indem Sie das Zellsieb in eine andere mit PBS gefüllte Vertiefung auf dem Shaker überführen. Übertragen Sie dann die Gehirnabschnitte vom Zellsieb in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, das einen Milliliter Biotin-markiertes WFA enthält, und inkubieren Sie über Nacht auf einer Schaukelplattform mit 50 U / min. Am nächsten Tag spülen Sie die Gehirnabschnitte wie zuvor demonstriert mit PBS ab, übertragen Sie die Abschnitte dann in ein Röhrchen mit einem Milliliter Streptavidin-Daylight 488-Lösung und inkubieren Sie zwei Stunden lang auf einer Schaukelplattform.

Nachdem Sie die Gehirnabschnitte erneut mit PBS gespült haben, inkubieren Sie sie zwei Stunden lang in Blockpuffer, gefolgt von einer Inkubation in primären Antikörpern über Nacht auf einer Schaukelplattform. Am nächsten Tag, nach PBS-Spülungen, inkubieren Sie die Abschnitte in sekundären Antikörpern für zwei Stunden. Füllen Sie zwei Petrischalen mit 100 Milliliter PBS und übertragen Sie alle Gehirnabschnitte von einem Sieb in die erste Schale.

Richten Sie die Gehirnabschnitte in neuroanatomischer Reihenfolge von kaudal bis rostral aus. Tauchen Sie dann einen Schieber in die zweite Schüssel mit einem leicht geneigten Ende mit einem Ständer ein und legen Sie mit einem feinen Pinsel vorsichtig einen Gehirnabschnitt direkt unter der Luftpufferschnittstelle auf den geneigten Schieber. Als nächstes entfernen Sie mit einer Transferpipette langsam und vorsichtig den Puffer, um sein Niveau zu senken, bis der Gehirnabschnitt vollständig über der Luftpufferschnittstelle liegt.

Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der Boden des Objektträgers erreicht ist und alle Abschnitte auf dem Objektträger montiert sind. Schalten Sie für die Bildgebung den Scanner und den Computer ein, positionieren Sie dann die Dias im Diahalter mit der Ladevorrichtung und setzen Sie den Halter in den Scanner ein. Öffnen Sie die Software für den Scanner und wählen Sie den entsprechenden Speicherort und das Scanprofil aus.

Starten Sie den Vorschauscan, indem Sie auf die Schaltfläche Vorschauscan starten klicken. Öffnen Sie nach dem Scan den Gewebeerkennungsassistenten und kreisen Sie die Bereiche ein, die für die Bildgebung von Interesse sind. Nachdem Sie die Bereiche für die Bildgebung ausgewählt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Scan starten und warten Sie, bis das Gerät den Scanvorgang abgeschlossen hat.

Überprüfen Sie die Ergebnisdatei und exportieren Sie die Bilder. Hier sind repräsentative Fluoreszenz-Immunhistochemie-Bilder von koronalen Maus-Hirnschnitten bei Bregma-negativen 0,82 Millimetern gezeigt, die die Verteilung von Glyzinien floribunda agglutinin, Arginin Vasopressin und DAPI zeigen. Glyzinien floribunda Agglutininsignale werden im perifornischen Bereich des vorderen Hypothalamus und des retikulären Kerns beobachtet, während Arginin-Vasopressin-Signale im paraventrikulären Kern beobachtet werden.

Wenn Sie dieses Protokoll zum ersten Mal ausprobieren, empfehlen wir, es unter der Aufsicht eines erfahrenen Forschers durchzuführen. Das Protokoll wird dazu beitragen, optimale und konsistente histologische Ergebnisse zwischen verschiedenen Forschern und Labors zu generieren, und wird als Referenz für Anfänger dienen, die diese Technik erlernen.