Im lebenden Organismus Methoden zur Beurteilung der Funktion und Struktur retinaler Ganglienzellen und Sehnerven bei Großtieren
26. Februar 2022
Hier demonstrieren wir mehrere In-vivo-Tests (Flash Visual Evoked Potential, Muster-Elektroretinogramm und optische Kohärenztomographie) an Ziegen- und Rhesusaffen, um die Struktur und Funktion des Sehnervs und seiner Neuronen zu verstehen.
Tag zusammen. Das ist Yikui Zhang vom Wenzhou Eye Hospital. Dem oberen Nerv fehlen Exxons aus den Orexin-Ganglienzellen und übertragen dann das visuelle Signal an das Gehirn.
Ein größeres Modell der Verletzung des oberen Nervs ist unerlässlich, um die neuartige Behandlung vom Robotermodell auf die Lymphanwendung zu übertragen. Hier beschreiben wir einige in vivo Methoden zur Bewertung der Struktur und Funktion der Orexin-Ganglienzellen im oberen Nerv bei großen Tieren. Durch die schrittweise Präsentation dieser Methode hoffen wir, experimentelle reproduktive Behinderungen zu erhöhen und die Verwendung größerer Modelle der Optikusneurose zu erleichtern.
Rasieren Sie die mit elektronischem Rasierer. Und bereiten Sie es dreimal mit 70% Alkohol vor, um die Haut zu reinigen und die subkutane Vene freizulegen. Führen Sie eine periphere Venenrolle intravenös ein.
Dann tropfen Atropin und Propofol. Intubieren Sie die Ziege mit einem sechs Millimeter langen Trachealschlauch und verbinden Sie ihn mit einem künstlichen Beatmungsgerät. Die Anästhesie wurde mit 3,5% Isofluran in Sauerstoff bei einer konstanten Zwei-Liter-Durchflussrate aufrechterhalten.
Legen Sie den Temperatursensor unter die Zunge der Ziege. Clip die Sauerstoffsättigungsspalte bis zum proximalen Ende des Ziegenohrs. Binden Sie die Blutdruckmanschette an die Basis des Oberschenkels.
Klemm-EKG spaltet die Gliedmaßen in der Richtigen. Dann können wir die Vitalindikatoren der Ziege überwachen. Rasieren Sie die Haare und desinfizieren Sie die Haut dreimal mit Betadin und 70% Alkohol in der Mitte des Frontbeins.
Öffnen Sie den Sterilisatorbeutel mit der Schere und den Nägeln. Machen Sie Hautschnitte, um den Schädel mit einer Schere freizulegen. Stahlschrauben zur Implantation in der Mitte des Stirnbeins.
Rasieren Sie die Haare und desinfizieren Sie die Haut dreimal mit Betadin und 70% Alkohol an einem mittleren Punkt von zwei Ohren im Hinterhauptbein. Machen Sie Hautschnitte. Stahlschrauben zur Implantation an der Mitte von zwei Ohren im Hinterhauptbein.
Die geschliffene Nadelelektrode wird subkutan unter die vordere Schädelschraube eingeführt. Die aktive Elektrode und die Referenzelektrode sind mit einer Frontal- bzw. Okzipitalschraube mit Krokodilklemmen verbunden, um die Elektrodenimppotenz zu reduzieren. Patchen Sie ein Auge.
Tragen Sie topische Anästhesie-Augentropfen auf die Augenoberfläche auf. Die Pupillen auf beiden Seiten werden durch Mydriasis-Augentropfen erweitert. Legen Sie den Kopf der Ziege in einen gasgefüllten Stimulator, der auf ambulantes Licht abzielt.
Legen Sie die schwarze Decke über den Stimulator und den Ziegenkopf für fünf Minuten Anpassung. Augenlidspekulum wird verwendet, um seine Pupille vollständig freizulegen. Überprüfen Sie die Impotenz des Elektrodengewebekontakts.
Stellen Sie sicher, dass die Impotenz jeweils unter 10 Kilometern liegt, um elektromagnetische Störungen durch andere elektrische Geräte im selben Raum zu vermeiden. Überprüfen Sie das Grundrauschen ohne Lichtstimulation. Starten Sie die FVEP-Aufzeichnung.
Beachten Sie, dass die FVEP-Aufzeichnung bei jeder Lichtintensität zweimal durchgeführt wird. Beachten Sie, dass Sie die Hornhaut mit künstlichem Riss befeuchten, wenn sie trocken erscheint. Wiederholen Sie die Schritte für das kontralaterale Auge.
Starten Sie die FVEP-Aufnahme mit unterschiedlichen Lichtintensitäten nacheinander. Für jede Aufnahme werden 64 Spuren gemittelt, um eine Wellenform zu erhalten. Der erste positive und aktive Peak in der FVEP-Wellenform wurde als P1 und N1 bezeichnet. Die sterilisierte Masseelektrode wird im Ohrläppchen positioniert.
Die sterilisierten Aktiv- und Referenzelektroden werden subkutan entlang der Mittellinie bzw. des frontalen bzw. okzipitalen Knochens eingeführt. Augenlidspekulum wird verwendet, um seine Pupille vollständig freizulegen. Patchen Sie ein Auge.
Zeichnen Sie die Muster-VEP-Antworten des anderen Auges bei verschiedenen Ortsfrequenzen nacheinander auf. Mit einer Krokodilklemme an die Masseelektrode anschließen. Zwei sterilisierte Nadelreferenzelektroden werden einen Zentimeter hinter dem seitlichen Canthus auf beiden Seiten unter der Haut platziert.
Augenlidspekulum wird verwendet, um seine Pupille vollständig freizulegen. Zwei desinfizierte ERG-Aufzeichnungselektroden werden nach topischer Anwendung eines künstlichen Risses sowohl mit der Hornhaut zentriert. Vor jedem Auge werden zwei Stimulatoren mit einem Betrachtungsabstand von 50 Zentimetern platziert.
Stellen Sie sicher, dass die Impotenz unter 10 Kilometer liegt. Verfolgen Sie das Grundrauschen ohne Lichtstimulation. Richten Sie das ambulante Licht.
Startmuster-ERG-Aufzeichnung von beiden Augen gleichzeitig bei verschiedenen Raumfrequenzen nacheinander. Schließlich, Rückkehr des Bildschirms, um Muster ERG ohne visuelle Stimulatoren und eine aktive Kontrolle aufzuzeichnen. Der Bandpassfilter ist auf einen Bereich von ein bis 75 Hertz für drei CPD-Muster-ERG eingestellt.
Der Bandpassfilter ist von eins bis 50 Hertz, um die Form zu glätten, ohne ihre Amplitude zu beeinträchtigen. Die ersten positiven und aktiven Peaks in der Wellenform werden als P1 und N1 bezeichnet. Das Muster ERG Amplitude gemessen von N1 bis P1.To Elektrodenimppotenz zu reduzieren, wird eine sterilisierte Nadelreferenz unter der frontalen Haut platziert. Und eine sterilisierte Nadelreferenzelektrode wird einen Zentimeter hinter dem seitlichen Canthus auf einer Seite unter die Haut gelegt.
Eine desinfizierte ERG-Aufzeichnungselektrode wird bei einer topischen Anwendung von künstlichem Riss auf die Hornhaut gelegt. Patchen Sie ein Auge. Ein Display wird bei einem Betrachtungsabstand von 50 Zentimetern platziert.
Augenlidspekulum wird verwendet, um seine Pupille vollständig freizulegen. Dann wird die Ziege auf die Kinnstütze gelegt. Richten Sie die Ziege mit der Kamera aus, um ihren Sehnervenkopf in das konfokale Laser-Ophthalmoskopiebild zu senden, indem Sie ihre Kopfposition ändern.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um die Erkennungsendphase aufzurufen. Warten Sie, bis das Gerät fertig geladen ist. Drücken Sie die gelbe Starttaste, um das formale Imaging zu starten.
Stellen Sie den Joystick so ein, dass das Infrarotbild gleichmäßig ausgeleuchtet wird, um die Bildqualität zu verbessern. Schieben Sie die Kamera nach vorne, bis das aufrechte retinale OCT-Bild auf dem oberen rechten Bildschirm angezeigt wird. Ändern Sie den Joystick so, dass er gleichmäßig in einem horizontalen retinalen OCT-Bild tanzt.
Drücken Sie die Taste am Joystick, um Ihr Bild automatisch aufzunehmen. Halten Sie diesen Joystick gedrückt, um die Bildqualität auf dem Livebildbildschirm aufrechtzuerhalten, bis die Bildausführung abgeschlossen ist. Dann drücken Sie auf Acquire.
Wählen Sie ein qualitativ hochwertiges Anfangsfoto aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Referenz festlegen aus. Drücken Sie die Follow-up-Taste, damit das Programm den aktuellen Scan automatisch an den Baseline-Scan anpasst.
Drücken Sie nach dem Abgleich die Taste am Joystick, um die automatische Echtzeitverfolgung zu aktivieren. Klicken Sie auf die Messschaltfläche, um die Messplattform aufzurufen. Wählen Sie den Radiergummi als Werkzeug und wischen Sie die RFL-Linie, die automatisch von der Maschine beschriftet wird.
Wählen Sie das Linienzeichnungswerkzeug, um die Berandung zwischen IPL und INL manuell zu umreißen. Zwischen der roten und blauen Linie befindet sich der GCC-Komplex. Die netzhautgeschädigte Bildgebung bei Rhesusaffen wird mit der gleichen Ausrüstung und dem gleichen Verfahren wie bei Ziegen durchgeführt.
Abbildung A zeigt repräsentative FVEP bei Ziegen. Abbildung B zeigt ein repräsentatives Muster der ERG-Wellenform bei Ziegen. Abbildung C zeigt repräsentatives Muster FVEP bei Rhesusaffen.
Und Abbildung D zeigt das repräsentative Muster der ERG-Wellenform bei Rhesusaffen. Abbildung zwei zeigt repräsentative retinale OCT-Bilder um den Sehnervenkopf und die Dicke des GCC-Komplexes in verschiedenen peripheren Regionen bei Ziege und Rhesusmakake. Großtiermodelle spielen eine wichtige Rolle in der translationalen Forschung.
In vielen Fällen konnten vielversprechende therapeutische Effekte in Kleintiermodellen nicht auf menschliche Patienten übertragen werden. In dieser Studie haben wir das Videoprotokoll von FVEP, PERG und OCT bei Ziegen und Rhesusaffen vorgestellt. Diese In-vivo-Methode kann in größeren Modellen verschiedener Optikusneurosen wie Glaukom ischämische oder traumatische Optikusneuropathie und Optikusneuritis angewendet werden.
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Übersicht
Diese Studie präsentiert mehrere In-vivo-Tests, darunter das Flash-visuell evozierte Potential, das Muster-Elektroretinogramm und die optische Kohärenztomographie bei Ziegen und Rhesusmakaken. Die Forschung zielt darauf ab, die Struktur und Funktion des Sehnervs und seiner Neuronen zu untersuchen und Erkenntnisse über die Übertragung visueller Signale zu gewinnen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Elektrophysiologie
- Augenheilkunde
Hintergrund
- Die Studie konzentriert sich auf die Funktion der Orexin-Ganglienzellen bei der visuellen Signalübertragung.
- Größere Tiermodelle sind entscheidend, um Behandlungen von robotischen Systemen auf praktische Anwendungen zu übertragen.
- Das Verständnis der Funktion des Sehnervs kann die Erkenntnisse über Sehstörungen verbessern.
- In-vivo-Methoden sind unerlässlich, um neuronale Strukturen und Funktionen zu bewerten.
Zweck der Studie
- Methoden zur Untersuchung der Reaktion des Sehnervs auf visuelle Reize evaluieren.
- Die Reproduzierbarkeit von Experimenten mit größeren Tiermodellen verbessern.
- Die Biomechanik der Optikusneuropathie und deren mögliche Behandlungen verstehen.
Verwendete Methoden
- In-vivo-Tests, einschließlich Flash-visuell evozierter Potentiale (FVEP), Pattern-Elektroretinogramme (PERG) und optische Kohärenztomographie (OCT), wurden durchgeführt.
- Die biologischen Modelle bestanden aus Ziegen und Rhesusmakaken.
- Jede Methode umfasste spezifische Vorbereitungsschritte wie das Management der Anästhesie, chirurgische Vorbereitung und elektrische Überwachung.
- Kritische Schritte bestanden darin, die Elektrodenimpedanz sicherzustellen und strenge Protokolle zur Datenerfassung einzuhalten.
Hauptergebnisse
- Die Studie beschrieb die Ableitung von FVEP- und PERG-Antworten zur Beurteilung der visuellen Signalverarbeitung im Sehnerv.
- Die Ergebnisse zeigten spezifische Peaks (P1 und N1) in den Wellenformen auf, die mit visuellen Reizen korrelierten.
- Die Forschung lieferte Methoden zur Sicherstellung der Datenqualität und Zuverlässigkeit bei den Ableitungen.
- Erkenntnisse über neuronale Reaktionen und mögliche Implikationen für Therapien wurden hervorgehoben.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie zeigt wirksame Methoden zur Beurteilung der Funktion des Sehnervs mithilfe von In-vivo-Tests auf.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Übertragung visueller Signale sowie der Konsequenzen für die Behandlung von Sehnervverletzungen bei.
- Die Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung von Großtiermodellen für die Übertragung grundlegender neurowissenschaftlicher Erkenntnisse in klinische Anwendungen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die Beurteilung der Funktion retinaler Ganglienzellen und des Sehnervs bei großen Tieren verbindet präklinische Erkenntnisse mit der Übertragung auf die menschliche klinische Anwendung, indem sie anatomisch und physiologisch relevante Modelle bereitstellt. In-vivo-elektrophysiologische und bildgebende Verfahren ermöglichen eine quantitative Bewertung der Integrität der Sehbahn und unterstützen die mechanistische Risikominderung neuroprotektiver und regenerativer Therapien. Dieser Ansatz erhöht das Vorhersagevertrauen bei der Zielvalidierung für optische Neuropathien wie Glaukom, traumatische Verletzungen und entzündliche Erkrankungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen zur Überlebensfähigkeit retinaler Ganglienzellen und zur axonalen Leitung in krankheitsrelevanten Systemen.
- Operativer Wert: Liefert funktionelle und strukturelle Messgrößen, die die Beteiligung von Signalwegen sowie die biologische Aktivität neuartiger Verbindungen verdeutlichen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Identifizierung von Leitverbindungen, indem die gezielte Modulation mit elektrophysiologischen und strukturellen Ergebnissen in Großtiermodellen korreliert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative, reproduzierbare Messungen visuell evozierter Potentiale und der Netzhautdicke zur Assay-Standardisierung.
- Operativer Wert: Etabliert reproduzierbare Protokolle zur langfristigen Überwachung von Behandlungseffekten über verschiedene Studienkohorten hinweg.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform über verschiedene Arten (Ziege, Rhesusmakake) und Verletzungsmodelle (ischämisch, traumatisch, entzündlich) hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erfasst krankheitsrelevante strukturelle Veränderungen (Dicke des GCC-Komplexes) und funktionelle Defizite (VEP-, PERG-Amplituden), die mit klinischen Endpunkten korrelieren.
- Operationaler Wert: Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem dieselben Parameter über verschiedene Modellsysteme hinweg überwacht werden.
- Risikominderung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem Targetbindung und biologische Wirkung in translationell relevanten Spezies nachgewiesen werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die beschriebenen Methoden sind in die Entdeckungskette von der Zielvalidierung über die Lead-Optimierung bis zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung integriert und liefern funktionelle und strukturelle Biomarker für die Gesundheit des Sehnervs.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung neuroprotektiver Mechanismen durch Quantifizierung der Funktion retinaler Ganglienzellen und der axonalen Integrität.
- Screening: Liefert standardisierte, versuchsfertige Ausgaben (Wellenformamplituden, Latenzen, Dicke der Netzhautschichten) zur Beurteilung von Substanzen.
- Analytik: Ermöglicht statistische Vergleiche von Behandlungseffekten anhand der Messung der Peaks P1/N1 und der Quantifizierung des GCC-Komplexes.
- Translationale Forschung: Verbindet funktionelle Elektrophysiologie- und strukturelle OCT-Daten mit klinischen Sehleistungen bei humanen optischen Neuropathien.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine plattformbasierte, übergreifende Lösung über Spezies und Modelle hinweg für die iterative Prüfung von therapeutischen Sehrettern.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanische Unschären, indem die Zielmodulation mit messbaren Funktionen und Strukturen der Sehbahn verknüpft wird.
- Operativer Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Elektrodenplatzierung, Impedanzkontrolle und Protokolle zur Signalverarbeitung durch Mittelwertbildung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem ineffektive Kandidaten frühzeitig vor kostspieligen klinischen Studien erkannt werden können.
- Portfolio-Beitrag: Fördert die risikoadjustierte Priorisierung durch objektive, translationale Biomarker zur Erhaltung des Sehnervs.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Elektrophysiologie, chirurgischen Vorbereitung und Anästhesie-Management bei großen Tieren.
- Abhängig von elektrophysiologischen Aufzeichnungssystemen, OCT-Bildgebungsplattformen und Stimulationsabgabevorrichtungen.
- Erfordert die Standardisierung der Elektrodenimpedanz (<10 kΩ), die Beurteilung des Basislinienrauschens sowie eine dreifache Signalakkumulation.
- Beinhaltet Anpassungen aufgrund artenspezifischer Anatomie (Schädel- und okulare Parameter von Ziege und Rhesusmakake).
- Eingeschränkt durch die prozedurale Komplexität und die Einhaltung des Tierschutzes, was Durchsatz und Skalierbarkeit beeinträchtigen kann.
