Name: Verwendung von Veränderungen in der Blattübertragung zur Untersuchung der Chloroplastenbewegung in Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Chloroplastenbewegung in Arabidopsis thaliana durch Messung von Blattlichttransmission quantifizieren. Diese kostengünstige Methode ermöglicht halbautomatisierte Erfassung dynamischer Veränderungen und ergänzt mikroskopische Studien.

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Die Finanzierung erfolgte durch einen Fiske Award und einen Wellesley College Faculty Award.

1. Blätter für einen Lauf vorbereiten
<ol><li>Stellen Sie 8 A. thaliana-Pflanzen über Nacht in die Dunkelheit (> 6 h funktioniert für die meisten Arten), um sicherzustellen, dass sich die Chloroplasten in ihre dunkle Position bewegen. Alle Replikate beginnen mit vergleichbaren Übertragungswerten.</li>
	<li>Alternativ können Sie 8 komplette Blätter in eine Petrischale mit einem feuchten Filterpapier am Boden legen, die Petrischale verschließen und mit Alufolie umwickeln.</li>
</ol>2. Testen, ob das Übertragungsgerät funktioniert
<ol><li>Schließen Sie das Übertragungsgerät an eine stabile Stromquelle an, und drücken Sie den Netzschalter (ON/OFF-Taste) des Geräts, um das Gerät zurückzusetzen (Abbildung 1A,B).</li>
	<li>Verbinden Sie das iPad mit einer stabilen Stromquelle, drücken Sie die Home-Screen-Taste, um den Bildschirm zu aktivieren, und geben Sie den Passcode ein, um sich anzumelden.</li>
	<li>Drücken Sie das Symbol Einstellungen , drücken Sie das Symbol Display & Helligkeit , drücken Sie die automatische Sperre und wählen Sie Nie , indem Sie diese Option drücken, um sicherzustellen, dass der Bildschirm dauerhaft eingeschaltet bleibt. Andernfalls wird das Programm nicht mehr ausgeführt, wenn der Bildschirm in den Ruhezustand wechselt. Drücken Sie die Taste Home Screen , um zum Hauptbildschirm zurückzukehren.</li>
	<li>Drücken Sie zweimal auf die Schaltfläche Startbildschirm, um zu sehen, welche Anwendungen geöffnet sind, und schließen Sie alle, indem Sie sie nach oben auf dem Bildschirm wischen. Drücken Sie die Taste Home Screen , um zum Hauptbildschirm zurückzukehren.<ol>
<li>Suchen Sie die LeafSensor-App auf dem Hauptbildschirm oder wischen Sie nach links oder rechts. Drücken Sie auf das Symbol der App, um sie zu öffnen (siehe Ergänzende Datei). Ein grüner Bildschirm mit Text und weißen Feldern wird angezeigt, um die Informationen einzugeben.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass das Wort Verbunden im unteren Teil des Bildschirms angezeigt wird, da es anzeigt, dass die App mit dem Übertragungsgerät kommuniziert. Wenn die Meldung "Adafruit NOT Found" angezeigt wird, überprüfen Sie, ob das Gerät angeschlossen ist, und drücken Sie erneut die Starttaste am Gerät.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Füllen Sie die ersten 4 Felder auf der App-Seite aus, um das Experiment zu benennen und die Bedingungen für einen kurzen Testlauf ohne Blätter und mit geöffneten Blattclips einzurichten:<ol>
<li>Benennen Sie das Experiment (verwenden Sie 8 oder weniger Großbuchstaben oder Zahlen), z. B. indem Sie TEST in das Feld Expt Name eingeben.</li>
		<li>Wählen Sie aus, wie viele verschiedene blaue Lichtintensitäten im Experiment verwendet werden sollen, z. B. indem Sie 3 in das Feld # Light Intensities eingeben.</li>
		<li>Wählen Sie die Blaulichtintensitäten für diesen Lauf (wählen Sie eine ganze Zahl zwischen 0 und 3000 und trennen Sie jede Zahl mit einem Komma von der nächsten; siehe Ergänzende Datei , wie Sie diese Zahlen in tatsächliche Blaulichtintensitäten von LEDs umwandeln), z. B. indem Sie 0.100.1000 in das Feld Blue Intensities eingeben.</li>
		<li>Wählen Sie, wie lange jede blaue Lichtintensität auf das Blatt scheinen soll (trennen Sie jede Zahl von der nächsten durch ein Komma), z. B. indem Sie 2,2,2 in das Feld Blaue Dauer (Minuten) eingeben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klicken Sie im mittleren Bereich des Bildschirms auf Experiment starten . Im unteren Teil des Bildschirms erscheinen 8 Bindestriche und die Meldung Experiment wird gestartet.<ol>
<li>Stellen Sie sicher, dass in den ersten zwei Minuten kein Licht von den LEDs emittiert wird, dann wird schwaches blaues Licht emittiert und nach 2 Minuten nimmt die blaue Lichtintensität zu.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass für die Messungen einmal pro Minute intensives rotes Licht von den LEDs emittiert wird. HINWEIS: Während des Experiments werden die Zahlen auf der App-Seite für jeden der acht Sensoren angezeigt, und die Daten werden einmal pro Minute aktualisiert. Stellen Sie sicher, dass die Ausgabezahlen der Fotodioden bei 1000-1023 liegen (wenn der Raum dunkel ist). Ein Update unten links zeigt, wie viele Messungen bisher durchgeführt wurden, z.B. Done 1 von 6 Messungen (eine Messung pro Minute).</li>
		<li>Wenn der Test abgeschlossen ist, überprüfen Sie unten links auf der App-Seite nach dem Erscheinungsbild des abgeschlossenen Tests. Jetzt ist das Instrument bereit für einen Lauf mit Blättern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Drücken Sie zweimal die Home-Screen-Taste, wischen Sie aus der App heraus und öffnen Sie sie erneut. Drücken Sie die ON/OFF-Taste am Gerät, um es zurückzusetzen.</li>
</ol>3. Aufstellen von Blättern in den Blattklammern
HINWEIS: Dieser Schritt muss im Dunkeln mit einer grünen Lichtquelle durchgeführt werden (z. B. einen grünen Filter vor einer Glühbirne platzieren), um eine Chloroplastenbewegung zu vermeiden. Alternativ können Sie sehr wenig weißes Licht und eine längere Dunkelperiode in den Blattclips verwenden. Denken Sie daran, dass ein Teil des Blattclips die LED (größere Öffnung) hält, während der andere Teil den Fototransistor hält (Abbildung 1C).
<ol><li>Wenn die Pflanzen ganz dunkel angepasst sind, wählen Sie 8 Blätter aus, die breit genug sind, um die LEDs abzudecken. Andernfalls entfernen Sie die Blätter aus der Petrischale. Bereiten Sie 8 Streifen Filterpapier etwa die Länge eines Blattclips und mit einem oben ausgestanzten Loch vor, um die LED nicht abzudecken.<ol>
<li>Befeuchten Sie das Filterpapier und legen Sie es auf den Blattclipteil, der die LED hält. Wiederholen Sie dies für jeden der acht Blattclips.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie jedes Blatt auf die Oberseite des nassen Filterpapiers seines Blattclips. Stellen Sie sicher, dass die richtige Blattseite zur LED zeigt (normalerweise werden Experimente mit der adaxialen Blattoberfläche durchgeführt, die der LED zugewandt ist).<ol>
<li>Vermeiden Sie es, die Mittelribs des Blatts auf den LEDs zu platzieren, und platzieren Sie für konsistentere Ergebnisse ähnliche Teile jedes Blatts (z. B. den breitesten Abschnitt des Blatts) über der LED.</li>
		<li>Legen Sie den anderen Blattclipteil mit dem Fototransistor darauf. Verwenden Sie ein Gummiband, um die beiden Blattclipteile bei Bedarf zusammenzuhalten (Abbildung 1C,D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie jeden Blattclip in sein "Boot" und füllen Sie die Reservoirs mit einer Pipette mit Wasser. Stellen Sie sicher, dass das Blatt oder zumindest das Filterpapier das Wasser berührt, um eine Austrocknung der Blätter während des Laufs zu vermeiden (Abbildung 1D).</li>
</ol>4. Durchführung eines Laufs
HINWEIS: Für einen Standard-Erkundungslauf beginnen Sie mit 4 h Dunkelheit (0 μmol Photon m-2 s-1), gefolgt von 7 h niedrigem blauem Licht (2 μmol Photon m-2 s-1), gefolgt von jeweils 60 min mit 5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol Photon m-2 s-1 blauem Licht. Dies wird die Blätter dazu bringen, ihre dunkle Transmission zu zeigen, chloroplastische Bewegung in die maximale Akkumulation zu induzieren und unterschiedliche Grade der Vermeidungsreaktion zu zeigen.
<ol><li>Richten Sie die LeafSensor-App mit den unten beschriebenen Schritten auf dem iPad ein.<ol>
<li>Geben Sie EXPLORA1 in das Feld Expt Name ein.</li>
		<li>Geben Sie 10 in das Feld # Light Intensities ein.</li>
		<li>Geben Sie 0,1,60,160,550,750,950,1150,1350,1950 in das Feld Blue intensities ein.</li>
		<li>Geben Sie 240,420,60,60,60,60,60,60,60,60 in das Feld Blaue Dauer ein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klicken Sie auf Experiment starten. Nach der ersten Minute erscheinen die Ausgabewerte (in der Regel zwischen 990 und 820) auf dem Bildschirm. Wenn die Werte weit entfernt sind, überprüfen Sie, ob die Blätter korrekt in die Blattklammern platziert wurden.</li>
	<li>Wenn der Lauf abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, dass die Meldung Experiment beendet unten links auf dem Bildschirm angezeigt wird. Die Daten werden automatisch gespeichert.<ol>
<li>Stellen Sie den Bildschirm in die aufrechte Position (nicht horizontal). Zwei neue Optionen werden auf dem Bildschirm angezeigt, nämlich Speichern und Dienstprogramme.</li>
		<li>Drücken Sie Dienstprogramme und eine Liste der gespeicherten Dateien wird angezeigt. Wählen Sie die gewünschte Datei aus, in diesem Fall EXPLORA1.</li>
		<li>Suchen Sie unterhalb der Liste der Dateien nach Selected Expt: EXPLORA1. Drücken Sie E-Mail, geben Sie eine E-Mail-Adresse ein, und die Datendatei wird automatisch an die Nachricht angehängt. Drücken Sie Auf Senden. HINWEIS: Wenn es eine lange Verzögerung gibt, bis die Dateien ankommen, starten Sie die App neu und senden Sie die Datei erneut.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn eine Ausführung abgebrochen wurde, aber die Daten bis zu diesem Zeitpunkt von Interesse sind, drücken Sie Speichern , bevor Sie Dienstprogramme auswählen. Bereinigen Sie nach mehreren Läufen den Speicherplatz: Drücken Sie Dienstprogramme, wählen Sie eine Datei nach der anderen aus, wischen Sie neben der Datei nach links und drücken Sie die Entf-Taste , um die Datei zu entfernen.</li>
	<li>Drücken Sie Zurück , um ein weiteres Experiment auszuführen, oder wenn Sie fertig sind, drücken Sie die Home-Screen-Taste, wischen Sie zum Hauptbildschirm, drücken Sie Einstellungen, drücken Sie Display & Helligkeit, drücken Sie Auto-Lock und drücken Sie 2 Minuten.</li>
</ol>5. Datenanalyse
<ol><li>Laden Sie die Datei EXPLORA1 aus der E-Mail herunter, fügen Sie der Datei die Erweiterung .csv hinzu, doppelklicken Sie auf die Datei. Die Daten werden in einer Tabelle sortiert, wobei die Daten für die acht verschiedenen Sensoren in separaten Spalten sortiert sind. Die letzte Spalte zeigt den Zeitpunkt (in Sekunden), zu dem die Daten gesammelt wurden. Löschen Sie die erste Zeile unter den Überschriften (Sensor1-8), wenn sie unsinnige Daten enthält.</li>
	<li>Richten Sie ein Stammdatenblatt ein, das die Ergebnisse für jeden Sensor in einem separaten Blatt enthält und die Ausgabewerte mithilfe der Gleichungen aus der Kalibrierung jedes Blattclips und Sensors in % der Übertragungswerte umwandelt (siehe Ergänzungsdatei).<ol>
<li>Kopieren Sie jeden Datensatz in ein separates Datenblatt (z. B. Spalte A enthält die Uhrzeit; Spalte C enthält die Daten von Sensor1).</li>
		<li>Richten Sie Spalte B so ein, dass die Zeit von Sekunden in Minuten umgewandelt wird. Richten Sie Spalte D so ein, dass sie die Formel zum Umwandeln der Spannung in % der Übertragung mithilfe der Gleichung aus der Kalibrierung enthält.</li>
		<li>Richten Sie für jeden Sensor ein ähnliches Datenblatt ein und denken Sie daran, dass die Formel, die zum Umwandeln der Ausgangsspannung in % der Übertragungswerte verwendet wird, für jeden Sensor unterschiedlich sein kann.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plot % Übertragung (T) gegen die Zeit, min (Abbildung 2).</li>
	<li>Speichern Sie das Datenblatt unter einem neuen Namen, damit das Stammdatenblatt wiederverwendet werden kann.</li>
	<li>Um die Daten weiter zu analysieren (Abbildung 2), berechnen Sie die ΔT(%)-Akkumulation (z. B. Änderung von T bei maximaler Akkumulation im Vergleich zu T bei Dunkelheit), ΔT (%) -Vermeidung (z. B. Änderung von T bei maximaler Vermeidung im Vergleich zu T bei Dunkelheit ) oder dT/dt (%/h) (z. B. Änderung von T während des schnellsten Teils der Akkumulations- oder Vermeidungsreaktion). Weitere Einzelheiten finden Sie unter 8.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Das Gerät ist extrem einfach zu bedienen, aber es ist von entscheidender Bedeutung, jeden Blattclip-Aufbau des Übertragungsgeräts unabhängig voneinander zu kalibrieren, da die Positionierung der LEDs und Fototransistoren von Blattclip zu Blattclip leicht variieren kann. Stellen Sie sicher, dass die LEDs und Fototransistoren stabil eingesetzt sind, und überprüfen Sie die Kalibrierung erneut, wenn die Daten falsch erscheinen. Vermeiden Sie es, Wasser auf das Gerät zu bekommen. Die Blätter in den Blattklammern werden in mit...

Licht ist essentiell für die Photosynthese, das Pflanzenwachstum und die Entwicklung. Es ist einer der dynamischsten abiotischen Faktoren, da sich die Lichtintensitäten nicht nur im Laufe einer Saison oder eines Tages ändern, sondern auch schnell und unvorhersehbar je nach Wolkendecke. Auf Blattebene werden die Lichtintensitäten auch durch die Dichte und Beschaffenheit der umgebenden Vegetation und des pflanzeneigenen Blätterdachs beeinflusst. Ein wichtiger Mechanismus, der es Pflanzen ermöglicht, das Abfangen von Licht unter variablen Lichtverhältnissen zu optimieren, ist die Fähigkeit von Chloroplasten, sich als Reaktion auf blaue Lichtreize zu bewegen1,2. Bei schlechten Lichtverhältnissen breiten sich Chloroplasten senkrecht zum Licht (entlang der periclinalen Zellwände) in einer sogenannten Akkumulationsreaktion aus, wodurch der Lichteinfang und damit die Photosynthese maximiert wird. Unter hohen Lichtverhältnissen bewegen sich Chloroplasten in einer sogenannten Vermeidungsreaktion auf die antiklinale Zellwand zu, wodurch das Abfangen von Licht und die Gefahr der Photoinhibition minimiert werden. Bei vielen Arten nehmen Chloroplasten auch eine spezifische dunkle Position ein, die sich von den Akkumulations- und Vermeidungspositionen unterscheidet und oft zwischen diesen beiden liegt3,4. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass die Chloroplastenbewegung nicht nur für die kurzfristige Stresstoleranz der Blätter wichtig ist5,6,7, sondern auch für das Wachstum und den Fortpflanzungserfolg von Pflanzen, insbesondere unter variablen Lichtverhältnissen8,9.
Die Chloroplastenbewegung wird bei bestimmten lebenden Exemplaren (z. B. Algen oder dünnblättrigen Pflanzen wie Elodea) mittels Lichtmikroskopie in Echtzeit beobachtet1. Die Untersuchung der Chloroplastenbewegung in den meisten Blättern erfordert jedoch eine Vorbehandlung, um die Chloroplastenbewegung, die chemische Fixierung und die Vorbereitung von Querschnitten zu induzieren, bevor die Proben unter einem Lichtmikroskop betrachtet werden10. Mit der Einführung der konfokalen Lasermikroskopie wurde es auch möglich, die 3D-Anordnung von Chloroplasten in intakten oder festen Blättern abzubilden4,11,12. Diese bildgebenden Verfahren helfen dem Verständnis der Chloroplastenbewegung erheblich, indem sie wichtige qualitative Informationen liefern. Die Quantifizierung der Chloroplastenpositionierung (z. B. als Prozentsatz der Chloroplasten in den periclinalen oder antiklinalen Positionen in diesen Bildern oder als Prozentsatz der von Chloroplasten bedeckten Fläche pro Gesamtzelloberfläche) ist ebenfalls möglich, aber ziemlich zeitaufwendig, insbesondere wenn sie in den Intervallen durchgeführt wird, die erforderlich sind, um schnelle Positionsänderungen zu erfassen10,8 . Der einfachste Weg, um zu zeigen, ob dunkel angepasste Blätter einer bestimmten Spezies oder Mutanten in der Lage sind, Chloroplastenbewegung in die Vermeidungsreaktion zu versetzen, besteht darin, den größten Teil der Blattfläche abzudecken, um die Chloroplasten im Dunkeln zu halten, während ein Streifen des Blattes hohem Licht ausgesetzt wird. Nach mindestens 20 Minuten hoher Lichteinwirkung haben sich die Chloroplasten im exponierten Bereich in die Vermeidungsposition bewegt, und der freiliegende Streifen ist sichtbar heller als der Rest des Blattes. Dies gilt für wilden Typ A. thaliana, aber nicht für einige der Chloroplasten-Bewegungsmutanten, die später ausführlicher beschrieben werden13. Diese Methode und modifikationen davon (z. B. Umkehrung der exponierten Teile des Blattes, Änderung der Lichtintensitäten) sind nützlich, um eine große Anzahl von Mutanten zu screenen und Nullmutanten zu identifizieren, denen entweder die Fähigkeit fehlt, eine Vermeidungs- oder Akkumulationsreaktion oder beides zu zeigen. Es liefert jedoch keine Informationen über die dynamischen Veränderungen in der Chloroplastenbewegung.
Im Gegensatz dazu ermöglicht die hier beschriebene Methode die Quantifizierung der Chloroplastenbewegung in intakten Blättern unter Verwendung von Änderungen der Lichtdurchlässigkeit durch ein Blatt als Proxy für die gesamte Chloroplastenbewegung: Unter Bedingungen, unter denen Chloroplasten in der Akkumulationsreaktion in den Mesophyllzellen ausgebreitet werden, wird weniger Licht durch das Blatt übertragen, als wenn viele Chloroplasten in einer Vermeidungsreaktion sind. positionieren sich entlang der antiklinalen Zellwände. Daher können Änderungen in der Übertragung als Proxy für die gesamte Chloroplastenbewegung in Blättern verwendet werden14. Die Details des Instruments sind an anderer Stelle beschrieben (siehe Ergänzende Datei), aber im Grunde verwendet das Instrument blaues Licht, um die Chloroplastenbewegung auszulösen und misst, wie viel rotes Licht in festgelegten Intervallen durch dieses Blatt übertragen wird. In jüngerer Zeit wurde eine Modifikation dieses Systems beschrieben, das einen modifizierten 96-Well-Mikroplattenleser, eine blaue LED, einen Computer und einen temperaturgesteuerten Inkubator15 verwendet.
Die Möglichkeit, eine Kombination von Methoden zu verwenden, einschließlich der optischen Beurteilung von Blättern für das Screening, gefolgt von der Messung dynamischer Transmissionsänderungen und der Verwendung von Mikroskopie, hat unser Verständnis sowohl der zugrunde liegenden Mechanismen als auch der physiologischen / ökologischen Bedeutung der Chloroplastenbewegung erheblich erleichtert. Zum Beispiel führte es zur Entdeckung und Charakterisierung verschiedener Mutanten, die in bestimmten Aspekten ihrer Bewegungen beeinträchtigt sind. Zum Beispiel fehlt A. thaliana phot 1 Mutanten die Fähigkeit, ihre Chloroplasten bei schwachem Licht anzusammeln, während Phot 2 Mutanten nicht in der Lage sind, eine Vermeidungsreaktion durchzuführen. Diese Phänotypen sind auf eine Beeinträchtigung von zwei jeweiligen Blaulichtrezeptoren zurückzuführen16,17,18. Im Gegensatz dazu fehlt den Chup1-Mutanten die Fähigkeit, geeignete Aktinfilamente um die Chloroplasten herum zu bilden, die unerlässlich sind, um die Chloroplasten in die gewünschte Position innerhalb einer Zelle zu bringen11,19. Zusätzlich zu Mutantenstudien haben Forscher die Auswirkungen verschiedener Inhibitoren auf die Chloroplastenbewegung bewertet, um die mechanistischen Aspekte des Prozesses aufzuklären. Zum Beispiel wurden Chemikalien wie H2O2 und verschiedene Antioxidantien verwendet, um die Auswirkungen dieses Signalmoleküls auf die Chloroplastenbewegung zu untersuchen20. Verschiedene Inhibitoren wurden verwendet, um die Rolle von Calcium bei der Chloroplastenbewegung aufzuklären21. Diese Methoden helfen nicht nur, die Mechanismen der Chloroplastenbewegung aufzudecken, sondern können auch verwendet werden, um die Chloroplastenbewegung in verschiedenen Arten oder Mutanten, die unter verschiedenen Bedingungen angebaut werden, zu vergleichen, um den ökologischen und evolutionären Kontext dieses Verhaltens zu verstehen. So hat sich beispielsweise gezeigt, dass das Ausmaß der Auswirkungen verschiedener Mutationen im Chloroplasten-Bewegungsweg von den Wachstumsbedingungen abhängt7,9 und dass sonnenangepasste Pflanzen ihre Chloroplasten nicht viel zu bewegen scheinen. Im Gegensatz dazu ist Bewegung bei Schattenpflanzen sehr wichtig10,22,23.
Dieses Methodenpapier, das sich auf die Modellpflanze A. thaliana konzentriert, beschreibt die Verwendung eines Übertragungsgeräts, das eine aktualisierte Version eines zuvor entwickelten Instruments ist9. Obwohl dieses Instrument nicht im Handel erhältlich ist, können Personen mit einem grundlegenden Verständnis der Elektronik oder der Hilfe von Ingenieur- oder Physikkollegen und Studenten das Instrument aus erschwinglichen Teilen und nach den detaillierten Anweisungen bauen (siehe Ergänzende Datei). Die Open-Source-Plattform, die zum Aufbau des Instruments verwendet wurde, verfügt über umfangreiche Webunterstützung und ein Community-Forum, das Hilfe bei Problemen bietet24.
Das Protokoll konzentriert sich darauf, wie das Instrument verwendet werden kann, um Änderungen in der Blattübertragung in einem Standard-Erkundungslauf zu bestimmen, der ein Blatt einer Vielzahl von Lichtbedingungen aussetzt und die Dunkel-, Akkumulations- und Vermeidungsreaktionen von A. thaliana erfasst. Diese Läufe können je nach Ziel des Experiments modifiziert und bei den meisten Pflanzenarten verwendet werden. Das Papier liefert Beispiele für Übertragungsdaten von A. thaliana Wildtype und mehreren Mutanten und zeigt, wie die Daten weiter analysiert werden können.

<table><tbody><tr><td>Aluminiumfolie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dunkle angepasste Blätter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iPad mit installiertem LeafSensor app (siehe Ergänzende Infos)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Jede</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Jedes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Übertragungsgerät (siehe Ergänzende Informationen)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung von veränderungen in der blattübertragung zur untersuchung der chloroplastenbewegung in arabidopsis thaliana

Using Changes in Leaf Transmission to Investigate Chloroplast Movement in Arabidopsis thaliana

Es hat sich gezeigt, dass die Chloroplastenbewegung in Blättern dazu beiträgt, die Photoinhibition zu minimieren und das Wachstum unter bestimmten Bedingungen zu erhöhen. Viel über die Chloroplastenbewegung kann gelernt werden, indem man die Chloroplastenpositionierung in Blättern mit z.B. konfokaler Fluoreszenzmikroskopie untersucht, aber der Zugang zu dieser Art von Mikroskopie ist begrenzt. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die die Änderungen der Blattübertragung als Proxy für die Chloroplastenbewegung verwendet. Wenn Chloroplasten verteilt werden, um das Abfangen von Licht zu maximieren, ist die Übertragung gering. Wenn sich Chloroplasten in Richtung der antiklinalen Zellwände bewegen, um Licht zu vermeiden, ist die Transmission höher. Dieses Protokoll beschreibt, wie ein einfaches, selbstgebautes Instrument verwendet wird, um Blätter unterschiedlichen Blaulichtintensitäten auszusetzen und die dynamischen Änderungen der Blattübertragung zu quantifizieren. Dieser Ansatz ermöglicht es den Forschern, die Chloroplastenbewegung in verschiedenen Spezies und Mutanten quantitativ zu beschreiben, die Auswirkungen von Chemikalien und Umweltfaktoren darauf zu untersuchen oder nach neuen Mutanten zu suchen, z. B. um fehlende Komponenten in dem Prozess zu identifizieren, der von der Lichtwahrnehmung zur Bewegung von Chloroplasten führt.

Die verschiedenen Teile der Übertragungsvorrichtung sind in Abbildung 1 dargestellt. Der Mikrocontroller ist die Steuereinheit des Geräts und steuert die Lichtverhältnisse, denen die blätter, in schwarzen Blattklammern befestigt, ausgesetzt sind, und speichert die empfangenen Lichtübertragungsdaten (Abbildung 1A,B). Eine Nahaufnahme der Steuereinheit des Instruments zeigt die ON/OFF-Taste, die SD-Karte für die Datenspeicherfähigkeit, das Bluetoo...

Viele Pflanzenarten verändern die Positionierung von Chloroplasten, um die Lichtabsorption zu optimieren. Dieses Protokoll beschreibt, wie man ein einfaches, selbst gebautes Instrument verwendet, um die Chloroplastenbewegung in Arabidopsis thaliana-Blättern zu untersuchen, wobei Veränderungen in der Lichtübertragung durch ein Blatt als Proxy verwendet werden.

Verwendung von Veränderungen in der Blattübertragung zur Untersuchung der Chloroplastenbewegung in Arabidopsis thaliana

Chloroplast movement in leaves has been shown to help minimize photoinhibition and increase growth under certain conditions. Much can be learned about ...

Diese Methode misst Veränderungen in der Lichtdurchlässigkeit von Blättern als Proxy für die Chloroplastenbewegung, die die Lichtabsorption von Blättern je nach Art, Umgebung und Mutationen in unterschiedlichem Maße beeinflusst. Dieses erschwingliche selbstgebaute Gerät ermöglicht es, die dynamischen Veränderungen der Chloroplastenbewegung auf einfache und halbautomatische Weise zu quantifizieren. Die Daten ergänzen Mikroskopiestudien.Es ist wichtig, die Anweisungen genau zu befolgen und das Instrument sorgfältig zu behandeln. Schließen Sie zunächst das Übertragungsgerät an eine stabile Stromquelle an und drücken Sie den Netzschalter des Geräts, um das Gerät zurückzusetzen. Verbinden Sie als Nächstes das iPad mit einer stabilen Stromquelle.Drücken Sie die Startbildschirmtaste, um den Bildschirm zu aktivieren, und geben Sie den Passcode ein, um sich anzumelden. Drücken Sie das Einstellungssymbol, gefolgt vom Anzeige- und Helligkeitssymbol. Drücken Sie als Nächstes die automatische Sperre und wählen Sie Nie, um sicherzustellen, dass der Bildschirm dauerhaft eingeschaltet bleibt, damit das Programm ohne Unterbrechung ausgeführt wird.Drücken Sie dann die Startbildschirmtaste, um zum Hauptbildschirm zurückzukehren. Nachdem Sie alle Anwendungen geschlossen haben, suchen und öffnen Sie die LeafSensor-App und geben Sie die Informationen in den grünen Bildschirm ein, der Text und weiße Felder anzeigt. Stellen Sie sicher, dass das Wort verbunden im unteren Teil des Bildschirms angezeigt wird, was darauf hinweist, dass die App mit dem Übertragungsgerät kommuniziert.Wenn die Meldung Adafruit NOT Found (Adafruit NICHT gefunden) angezeigt wird, überprüfen Sie, ob das Gerät angeschlossen ist, und drücken Sie erneut die Starttaste am Gerät. Füllen Sie die ersten vier Felder auf der App-Seite aus, um die Bedingungen für einen kurzen Testlauf mit offenen Blattclips ohne Blätter einzurichten. Beginnen Sie mit der Benennung des Experiments in das Feld namens Experimentname, wählen Sie dann aus, wie viele verschiedene Blaulichtintensitäten im Experiment verwendet werden sollen, indem Sie die Zahl in das Feld Mit dem Namen Anzahl der Lichtintensitäten eingeben, geben Sie dann die zu verwendenden Blaulichtintensitäten ein, indem Sie eine ganze Zahl zwischen 0 und 3.000 auswählen, und trennen Sie jede Intensität von der nächsten mit einem Komma in das Feld mit dem Namen Blaue Intensitäten.Geben Sie die Zeitspanne für jede blaue Lichtintensität in das Feld blaue Dauer ein. Klicken Sie im mittleren Bereich des Bildschirms auf Experiment starten. Im unteren Teil des Bildschirms werden acht Bindestriche mit der Meldung Experiment starten angezeigt.Lassen Sie das Experiment laufen, bis die ersten Daten angezeigt werden. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass in den ersten zwei Minuten kein Licht von der LED emittiert wird, beobachten Sie die Emission von schwachem blauem Licht für zwei Minuten und dann die Emission von starkem blauem Licht für weitere zwei Minuten. Beobachten Sie auch intensives rotes Licht, das während dieser Sequenz einmal pro Minute kurz von der LED ausgeht.Suchen Sie nach dem Status Test beendet, der durch die Meldung Experiment beendet unten links auf der App-Seite angezeigt wird, und drücken Sie dann zweimal die Schaltfläche auf dem Startbildschirm. Wischen Sie aus der App heraus und öffnen Sie sie erneut. Setzen Sie das Instrument zurück, indem Sie die Ein-/Aus-Taste drücken, um das Instrument auf einen Lauf mit Blättern vorzubereiten.Wählen Sie im Dunkeln mit nur sehr niedrigem weißem oder grünem Licht ein breites Blatt aus der dunkel angepassten Pflanze aus, um die LED abzudecken. Bereiten Sie den Filterpapierstreifen von etwa der Länge eines Blattclips vor. Stanzen Sie dann ein Loch an der Oberseite des Filterpapierstreifens, um zu verhindern, dass die LED verdeckt wird.Legen Sie ein angefeuchtetes Filterpapier auf den Blattclipteil, der die LED hält. Entfernen Sie den dunkel angepassten Blattclip aus der Petrischale und legen Sie das Blatt dann auf die Oberseite des nassen Filterpapiers seines Blattclips, um sicherzustellen, dass die adaxiale Blattoberfläche der LED zugewandt ist. Platzieren Sie dann den anderen Blattclipteil mit einem Fototransistor auf der Oberseite.Verwenden Sie bei Bedarf ein Gummiband, um zwei Blattclipteile zusammenzuhalten. Legen Sie den Blattclip in das jeweilige Boot und füllen Sie mit einer Pipette die Behälter mit Wasser, um sicherzustellen, dass das Blatt oder zumindest das Filterpapier das Wasser berührt, um eine Austrocknung der Blätter während des Laufs zu vermeiden. Richten Sie die LeafSensor-App auf dem iPad ein und geben Sie EXPLORA1 in das Feld Experimentname ein.Geben Sie 10 in das Feld Mit dem Namen Anzahl der Lichtintensitäten ein. Geben Sie dann die Zahlen in das Feld blaue Intensitäten und blaue Dauer ein. Klicken Sie auf Experiment starten.Beobachten Sie nach der ersten Minute die angezeigten Ausgabewerte. Wenn die Werte weit entfernt sind, überprüfen Sie, ob die Blätter korrekt in die Blattklammern platziert wurden. Wenn der Lauf abgeschlossen ist, werden die Daten automatisch gespeichert.Nach dem Drehen des Bildschirms in der aufrechten Position werden zwei Optionen, Speichern und Dienstprogramme, auf dem Bildschirm angezeigt. Drücken Sie Dienstprogramme und wählen Sie dann aus der Liste der gespeicherten Dateien die EXPLORA1-Datei aus. Unterhalb der Liste der Dateien wird nun EXPLORA1 im ausgewählten Experiment angezeigt.Drücken Sie als Nächstes E-Mail. Geben Sie eine E-Mail-Adresse ein und die EXPLORA1-Datei wird automatisch an die Nachricht angehängt und drücken Sie dann Senden. Die prozentualen Übertragungsdaten wurden gegen die Zeit aufgetragen, was zeigt, dass die Übertragung von Arabidopsis thaliana bei niedrigen Lichtintensitäten abnahm, während eine Vermeidungsreaktion induziert wurde, wenn die Lichtintensitäten weiter zunahmen.Die durchschnittlichen prozentualen Übertragungswerte der Wildtyp- und mutierten Arabidopsis thaliana-Blätter während 19-stündiger Läufe werden angezeigt. Wenn die Blätter sowohl bei Wildtyp- als auch bei Phot2-Mutanten geringem blauem Licht ausgesetzt waren, folgte auf die anfängliche schnelle Abnahme der Übertragung eine langsame Abnahme, was darauf hindeutet, dass sich die Chloroplasten in die Akkumulationsreaktion bewegten. Im Vergleich zum Wildtyp zeigte phot1 eine reduzierte Akkumulationsreaktion.Wenn die Blaulichtintensität nach 11 Stunden schrittweise erhöht wird, erhöht sich die prozentuale Transmission und die Chloroplasten bewegen sich in die Vermeidungsreaktion. Die Grad der Änderung der prozentualen Transmission relativ zum Dunkelwert, auch Delta T genannt, waren abhängig von den exakten Blaulichtintensitäten. Die negativen Werte zeigen an, dass die Blätter eine Akkumulationsreaktion zeigten, während positive Werte eine Vermeidungsreaktion anzeigten.Die Geschwindigkeit der Änderung der Übertragung wird als die Steigung der Transmissionsänderung berechnet, wenn das Licht erhöht wird. Im repräsentativen Beispiel änderte sich die Übertragungsgeschwindigkeit während der ersten Reaktionen, wenn die Vermeidung ausgelöst wurde, da die Blaulichtintensität erhöht wurde. Wenn Sie die Übertragungsänderungen in einer nicht charakterisierten Mutante oder Spezies untersuchen, bestätigen Sie, wie die Übertragungswerte und Chloroplastenpositionen mit einer Mikroskopiestudie korrelieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Die molekulare Basis der räumlich-spezifische Phytochrom Reaktionen wird untersucht mit Hilfe von transgenen Pflanzen, die Gewebe-und Organ-spezifische Phytochrom Mängel aufweisen. Die Isolierung von spezifischen Zellen mit induzierter Phytochrom-Chromophor Abreicherung durch Fluorescence-Activated Cell Sorting gefolgt von Microarray-Analysen wird genutzt, um Gene in räumlich-spezifische Phytochrom Reaktionen beteiligt sind.

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana</em

Wir haben eine einfache und reproduzierbare Protokoll Stomata Reaktion auf lebende Bakterien Zugang entwickelt. Diese Methode minimiert Verwundung und Manipulation des Blattes über die Nutzung von epidermalen schält Vergleich bereits berichtet.

Die Beurteilung stomatäre Response to Bakterienzellen Live mit Whole Leaf Imaging

Wir beschreiben die Verwendung von Perfluordecalin als infiltrative Eindeckmedium. Dies ist eine einfache Methode zur Verbesserung der Tiefe der Bildgebung...

Eine einfache Methode zur Bildgebung Arabidopsis Leaves Mit Perfluordecalin als Infiltrative Imaging Medium

Zellspezifische Analyse<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Blätter mit Fluorescence Activated Cell Sorting

Ca2 + Signalweg reguliert verschiedene biologische Prozesse in Pflanzen. Hier präsentieren wir Ansätze zur Überwachung abiotischen Stress induziert räumliche und zeitliche Ca 2 +-Signale in Arabidopsis Zellen und Geweben unter Verwendung der genetisch codierten Ca2 +-Indikatoren Aequorin oder Case12.

Mess räumliche und zeitliche Ca 2 + Signale in Arabidopsis-Pflanzen

Das Ziel des Protokolls ist es, zu demonstrieren, wie fluoreszenzmarkierte Proteindynamik zu Pflanzenzelloberflächen mit variablem Winkel Epifluoreszenzmikroskopie, die blinkende Punkte von GFP-markiertem PATROL1 ein Membrantransportprotein zu überwachen, in der Zelle Kortex der Stomata Komplex in Arabidopsis thaliana.

Echtzeit-Imaging von Plant Cell Oberflächen Dynamics mit variabler Winkel Epifluoreszenzmikroskopie

Wir berichten über eine einfache und vielseitige Methode zur Durchführung von fluoreszierenden live-Imaging von Arabidopsis Thaliana Blätter über einen längeren Zeitraum hinweg. Wir verwenden eine transgene Arabidopsis -Pflanze mit dem Ausdruck einer fluoreszierenden Reporter-gen unter der Kontrolle von einer Immunität im Zusammenhang mit Promoter als Vorbild für die räumlich-zeitliche Verständnis der Pflanze Immunantworten.

Eine vielseitige Methode für die Montage von Arabidopsis verlässt für intravitalen Zeitraffer Aufnahmen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie man den CFDA in verschiedene Standorte der unteren Teile von Arabidopsis zuladen. Wir stellen dann das resultierende Verteilungsmuster von CF in den Triebe vor.

Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis

Wir beschreiben einen neuen technischen Ansatz zur Untersuchung photosynthetischer Reaktionen in  höheren Pflanzen mit gleichzeitigen Messungen von Chlorophyll, Fluoreszenz und Blattreflexion mit einem PAM und einem Spektralradiometer zur Detektion von Signalen aus dem gleichen Blattbereichs in Arabidopsis.

Auswertung photosynthetischer Verhaltensweisen durch gleichzeitige Messungen von Blattreflexion simultanen und Chlorophyllfluoreszenzanalysen

Hier werden mehrere häufig verwendete Methoden vorgestellt, um die Membrantransportereignisse einer Plasmamembranrezeptorkinase zu untersuchen. Dieses Manuskript beschreibt detaillierte Protokolle, einschließlich der Vorbereitung des Pflanzenmaterials, der pharmakologischen Behandlung und der konfokalen Bildgebung.

Bildbasierte Methoden zur Untersuchung von Membrantransportereignissen in stomatalen Zellen

Dieser Prozess verwendet die Konfokalmikroskopie in Verbindung mit einer fluoreszenzmarkierten Kern- und Chromatinmarkerlinie bei Arabidopsis thaliana, um gleichzeitig die Kern- und Chromatindynamik in Arabidopsis-Wurzeln aufzuzeichnen und Veränderungen in dieser Dynamik als Reaktion auf Entwicklungs- und Umweltsignale zu untersuchen.

Quantitative lebende Zellbildgebung der Kernform und der Chromatindynamik während der Entwicklung und Umweltstress in der Wurzel Arabidopsis thaliana

Erfahren Sie, wie Sie Chloroplastenbewegung in Arabidopsis thaliana durch Messung von Blattlichttransmission quantifizieren. Diese kostengünstige Methode ermöglicht halbautomatisierte Erfassung dynamischer Veränderungen und ergänzt mikroskopische Studien.

Verwendung von Veränderungen in der Blattübertragung zur Untersuchung der Chloroplastenbewegung in Arabidopsis thaliana

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