Verwendung von Veränderungen in der Blattübertragung zur Untersuchung der Chloroplastenbewegung in Arabidopsis thaliana

Diese Methode misst Veränderungen in der Lichtdurchlässigkeit von Blättern als Proxy für die Chloroplastenbewegung, die die Lichtabsorption von Blättern je nach Art, Umgebung und Mutationen in unterschiedlichem Maße beeinflusst. Dieses erschwingliche selbstgebaute Gerät ermöglicht es, die dynamischen Veränderungen der Chloroplastenbewegung auf einfache und halbautomatische Weise zu quantifizieren. Die Daten ergänzen Mikroskopiestudien.

Es ist wichtig, die Anweisungen genau zu befolgen und das Instrument sorgfältig zu behandeln. Schließen Sie zunächst das Übertragungsgerät an eine stabile Stromquelle an und drücken Sie den Netzschalter des Geräts, um das Gerät zurückzusetzen. Verbinden Sie als Nächstes das iPad mit einer stabilen Stromquelle.

Drücken Sie die Startbildschirmtaste, um den Bildschirm zu aktivieren, und geben Sie den Passcode ein, um sich anzumelden. Drücken Sie das Einstellungssymbol, gefolgt vom Anzeige- und Helligkeitssymbol. Drücken Sie als Nächstes die automatische Sperre und wählen Sie Nie, um sicherzustellen, dass der Bildschirm dauerhaft eingeschaltet bleibt, damit das Programm ohne Unterbrechung ausgeführt wird.

Drücken Sie dann die Startbildschirmtaste, um zum Hauptbildschirm zurückzukehren. Nachdem Sie alle Anwendungen geschlossen haben, suchen und öffnen Sie die LeafSensor-App und geben Sie die Informationen in den grünen Bildschirm ein, der Text und weiße Felder anzeigt. Stellen Sie sicher, dass das Wort verbunden im unteren Teil des Bildschirms angezeigt wird, was darauf hinweist, dass die App mit dem Übertragungsgerät kommuniziert.

Wenn die Meldung Adafruit NOT Found (Adafruit NICHT gefunden) angezeigt wird, überprüfen Sie, ob das Gerät angeschlossen ist, und drücken Sie erneut die Starttaste am Gerät. Füllen Sie die ersten vier Felder auf der App-Seite aus, um die Bedingungen für einen kurzen Testlauf mit offenen Blattclips ohne Blätter einzurichten. Beginnen Sie mit der Benennung des Experiments in das Feld namens Experimentname, wählen Sie dann aus, wie viele verschiedene Blaulichtintensitäten im Experiment verwendet werden sollen, indem Sie die Zahl in das Feld Mit dem Namen Anzahl der Lichtintensitäten eingeben, geben Sie dann die zu verwendenden Blaulichtintensitäten ein, indem Sie eine ganze Zahl zwischen 0 und 3.000 auswählen, und trennen Sie jede Intensität von der nächsten mit einem Komma in das Feld mit dem Namen Blaue Intensitäten.

Geben Sie die Zeitspanne für jede blaue Lichtintensität in das Feld blaue Dauer ein. Klicken Sie im mittleren Bereich des Bildschirms auf Experiment starten. Im unteren Teil des Bildschirms werden acht Bindestriche mit der Meldung Experiment starten angezeigt.

Lassen Sie das Experiment laufen, bis die ersten Daten angezeigt werden. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass in den ersten zwei Minuten kein Licht von der LED emittiert wird, beobachten Sie die Emission von schwachem blauem Licht für zwei Minuten und dann die Emission von starkem blauem Licht für weitere zwei Minuten. Beobachten Sie auch intensives rotes Licht, das während dieser Sequenz einmal pro Minute kurz von der LED ausgeht.

Suchen Sie nach dem Status Test beendet, der durch die Meldung Experiment beendet unten links auf der App-Seite angezeigt wird, und drücken Sie dann zweimal die Schaltfläche auf dem Startbildschirm. Wischen Sie aus der App heraus und öffnen Sie sie erneut. Setzen Sie das Instrument zurück, indem Sie die Ein-/Aus-Taste drücken, um das Instrument auf einen Lauf mit Blättern vorzubereiten.

Wählen Sie im Dunkeln mit nur sehr niedrigem weißem oder grünem Licht ein breites Blatt aus der dunkel angepassten Pflanze aus, um die LED abzudecken. Bereiten Sie den Filterpapierstreifen von etwa der Länge eines Blattclips vor. Stanzen Sie dann ein Loch an der Oberseite des Filterpapierstreifens, um zu verhindern, dass die LED verdeckt wird.

Legen Sie ein angefeuchtetes Filterpapier auf den Blattclipteil, der die LED hält. Entfernen Sie den dunkel angepassten Blattclip aus der Petrischale und legen Sie das Blatt dann auf die Oberseite des nassen Filterpapiers seines Blattclips, um sicherzustellen, dass die adaxiale Blattoberfläche der LED zugewandt ist. Platzieren Sie dann den anderen Blattclipteil mit einem Fototransistor auf der Oberseite.

Verwenden Sie bei Bedarf ein Gummiband, um zwei Blattclipteile zusammenzuhalten. Legen Sie den Blattclip in das jeweilige Boot und füllen Sie mit einer Pipette die Behälter mit Wasser, um sicherzustellen, dass das Blatt oder zumindest das Filterpapier das Wasser berührt, um eine Austrocknung der Blätter während des Laufs zu vermeiden. Richten Sie die LeafSensor-App auf dem iPad ein und geben Sie EXPLORA1 in das Feld Experimentname ein.

Geben Sie 10 in das Feld Mit dem Namen Anzahl der Lichtintensitäten ein. Geben Sie dann die Zahlen in das Feld blaue Intensitäten und blaue Dauer ein. Klicken Sie auf Experiment starten.

Beobachten Sie nach der ersten Minute die angezeigten Ausgabewerte. Wenn die Werte weit entfernt sind, überprüfen Sie, ob die Blätter korrekt in die Blattklammern platziert wurden. Wenn der Lauf abgeschlossen ist, werden die Daten automatisch gespeichert.

Nach dem Drehen des Bildschirms in der aufrechten Position werden zwei Optionen, Speichern und Dienstprogramme, auf dem Bildschirm angezeigt. Drücken Sie Dienstprogramme und wählen Sie dann aus der Liste der gespeicherten Dateien die EXPLORA1-Datei aus. Unterhalb der Liste der Dateien wird nun EXPLORA1 im ausgewählten Experiment angezeigt.

Drücken Sie als Nächstes E-Mail. Geben Sie eine E-Mail-Adresse ein und die EXPLORA1-Datei wird automatisch an die Nachricht angehängt und drücken Sie dann Senden. Die prozentualen Übertragungsdaten wurden gegen die Zeit aufgetragen, was zeigt, dass die Übertragung von Arabidopsis thaliana bei niedrigen Lichtintensitäten abnahm, während eine Vermeidungsreaktion induziert wurde, wenn die Lichtintensitäten weiter zunahmen.

Die durchschnittlichen prozentualen Übertragungswerte der Wildtyp- und mutierten Arabidopsis thaliana-Blätter während 19-stündiger Läufe werden angezeigt. Wenn die Blätter sowohl bei Wildtyp- als auch bei Phot2-Mutanten geringem blauem Licht ausgesetzt waren, folgte auf die anfängliche schnelle Abnahme der Übertragung eine langsame Abnahme, was darauf hindeutet, dass sich die Chloroplasten in die Akkumulationsreaktion bewegten. Im Vergleich zum Wildtyp zeigte phot1 eine reduzierte Akkumulationsreaktion.

Wenn die Blaulichtintensität nach 11 Stunden schrittweise erhöht wird, erhöht sich die prozentuale Transmission und die Chloroplasten bewegen sich in die Vermeidungsreaktion. Die Grad der Änderung der prozentualen Transmission relativ zum Dunkelwert, auch Delta T genannt, waren abhängig von den exakten Blaulichtintensitäten. Die negativen Werte zeigen an, dass die Blätter eine Akkumulationsreaktion zeigten, während positive Werte eine Vermeidungsreaktion anzeigten.

Die Geschwindigkeit der Änderung der Übertragung wird als die Steigung der Transmissionsänderung berechnet, wenn das Licht erhöht wird. Im repräsentativen Beispiel änderte sich die Übertragungsgeschwindigkeit während der ersten Reaktionen, wenn die Vermeidung ausgelöst wurde, da die Blaulichtintensität erhöht wurde. Wenn Sie die Übertragungsänderungen in einer nicht charakterisierten Mutante oder Spezies untersuchen, bestätigen Sie, wie die Übertragungswerte und Chloroplastenpositionen mit einer Mikroskopiestudie korrelieren.