Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortierungs-Radioliganden-behandeltes Gewebe (FACS-RTT) zur Bestimmung des zellulären Ursprungs des radioaktiven Signals

Dieses Protokoll ergänzt die In-vivo-Bildgebung. Es ermöglicht die Quantifizierung von Radiotracern auf Zelltyp und zellulärer Ebene, was eine andere Skala ist als die, die in vivo erhalten wurde. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Empfindlichkeit und die zelluläre Auflösung, die durch die Verwendung von Radioliganden und die Zellsortierung gegeben ist.

Schalten Sie die Kamera ein und laden Sie die Betriebssoftware. Klicken Sie auf die Schaltfläche Home XYZ-Bühne, um das Homing durchzuführen. Richten Sie das Experiment ein, das aus einer 10-minütigen Scanerfassung besteht.

Stellen Sie den Schrittmodus auf fein und den Erfassungsmodus auf den Listmodus, um das gesamte Emissionsspektrum aufzuzeichnen. Stellen Sie das Bett auf und stellen Sie sicher, dass das Wärmesystem, der Atemsensor und die Anästhesie funktionsfähig und sicher sind. Platzieren Sie dann ein Phantom an der Stelle, an der der Kopf des Tieres positioniert wird.

Legen Sie den Scanbereich fest, indem Sie die Cursor für die drei Dimensionen mit Hilfe der drei Bilder im unteren Teil des Bildschirms verschieben. Stellen Sie sicher, dass das Scanvolumen des Phantoms und des Tieres gleich ist. Starten Sie den Phantomscan zur anschließenden Kalibrierung mit den zuvor festgelegten Parametern.

Stellen Sie sicher, dass Sie in einer geeigneten Umgebung arbeiten, die für Experimente mit Radioaktivität zugelassen ist. Inkubieren Sie 100 Mikrogramm Tributylinvorstufe in 100 Mikrolitern Essigsäure mit Natriumiodid und fünf Mikroliter 37% Paracetsäure bei 70 Grad Celsius für 20 Minuten in einem Thermocycler, der in einem Handschuhfach positioniert ist. Verdünnen Sie die Reaktion mit 50% Acetonitril in Wasser, um ein Volumen von 500 Mikrolitern zu erreichen.

Injizieren Sie die 500 Mikroliter der verdünnten Reaktion auf eine Umkehrphasensäule. Isolieren Sie die CLINDE mit einem linearen HPLC-Lauf von 5 bis 95% ACN in sieben-millimolärer Phosphorsäure für 10 Minuten. Verdünnen Sie das Isolat in Wasser, um ein Endvolumen von 10 Millilitern zu erreichen, und injizieren Sie dann die verdünnte Reaktion auf eine Konzentrationssäule.

Die CLINDE aus der Säule mit 300 Mikrolitern absolutem Ethanol eluieren und dann das Ethanol verdampfen, indem Sie es in einer Vakuumzentrifuge bei Raumtemperatur für 40 Minuten inkubieren. Verdünnen Sie den Rückstand, der die CLINDE enthält, in 300 Mikroliter Kochsalzlösung, um eine Stammlösung zu erhalten. Nach der Messung der Radioaktivität verdünnen Sie die Stammlösung in Kochsalzlösung, um eine Lösung von 0,037 Megabecquerel in 500 Mikrolitern zu erhalten.

Legen Sie die Kalibrierkurven mit kalten Referenzverbindungen fest und lösen Sie die lineare Regressionsgleichung auf:Y gleich AX plus B, um A- und B-Koeffizienten zu erhalten. X stellt die Masse der kalten Verbindung dar, und Y stellt die Fläche unter den Kurven dar. Überprüfen Sie den Bereich unter der Kurve des Radioliganden und messen Sie die ultraviolette Absorption bei 450 Nanometern basierend auf der Kalibrierkurve und der Fläche unter der Kurve des Radioliganden.

Schätzen Sie die Masse und messen Sie die Aktivität des Radioliganden. Stellen Sie sicher, dass die spezifische Aktivität mehr als 1.000 Gigabecquerel pro Mikromol beträgt. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bild aktualisieren, um die Tierposition zu aktualisieren.

Legen Sie den Scanbereich fest, indem Sie die Cursor mit Hilfe der drei Bilder im unteren Teil des Bildschirms für die drei Dimensionen schieben. Richten Sie das Experiment auf einem 60-minütigen Scan ein, der 60 Frames von einer Minute umfasst. Verwenden Sie alle anderen anfänglich eingerichteten Parameter wieder.

Injizieren Sie 500 Mikroliter des radioaktiven Radiotracers und spülen Sie dann das Röhrchen mit 300 Mikrolitern sterilem 0,9% Natriumchlorid. Klicken Sie gleichzeitig auf Aufnahme starten, um den Scan zu starten. Öffnen Sie die Scan-Rekonstruktionssoftware und öffnen Sie dann den Datensatz, indem Sie nach der Dateinamen-Parameterdatei suchen, die im Ordner des Scans erstellt wurde.

Wählen Sie das gewünschte Isotop aus. Beachten Sie, dass der Parameter Listenmodus in diesem Schritt die Auswahl mehrerer Isotopen zulässt. Legen Sie die verschiedenen Rekonstruktionsparameter wie die Voxelgröße, die Anzahl der Teilmengen und die Iterationen fest, wie im Manuskript beschrieben.

Wählen Sie das Ausgabeformat als NIFTI und dann SPECT-Rekonstruktion starten aus. Verwenden Sie einen flachen Metallspatel und eine Rasierklinge, um die interessierenden Regionen des Gehirns zu sezieren. Legen Sie das Gewebe in ein Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und wiegen Sie das erhaltene Gewebe.

Geben Sie die Proben in ein Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit einem Milliliter Calcium- und Magnesium-freiem HBSS und zentrifugieren Sie dann bei 300 mal G für zwei Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Fügen Sie 1.900 Mikroliter Enzymmischung hinzu und inkubieren Sie es für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius, während Sie die Röhrchen alle fünf Minuten durch Inversion bewegen. Fügen Sie 30 Mikroliter Enzymmischung zwei hinzu.

Mit einer 1.000 Mikroliter Pipette 30 Mal vorsichtig hin und her rühren. Dann inkubieren Sie die Mischung für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius, während Sie die Röhrchen alle fünf Minuten durch Inversion rühren. Mischen Sie vorsichtig hin und her mit einer 200-Mikroliter-Pipette und dann einer 10-Mikroliter-Pipette, bevor Sie die Mischung für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, um das Gewebe zu dissoziieren.

Filtern Sie die Zellen mit einem 70-Mikrometer-Zellsieb und fügen Sie 10 Milliliter kalzium- und magnesiumfreies HBSS hinzu. Bei 300 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand entfernen, ohne das Pellet zu stören. Für den Myelinabbau suspendieren Sie das Pellet mit 400 Mikrolitern Myelinentfernungspuffer und fügen Sie dann 100 Mikroliter Myelinentfernungsperlen hinzu, bevor Sie für 15 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren.

Fügen Sie fünf Milliliter Myelinentfernungspuffer hinzu und zentrifieren Sie 300 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie 500 Mikroliter Myelinentfernungspuffer hinzu und legen Sie die suspendierten Pellets in die Magnetfeldsäule. Waschen Sie die Säule viermal mit einem Milliliter Myelinentfernungspuffer.

Bei Raumtemperatur bei 300 mal G zentrifugieren und den Überstand entfernen, ohne das Pellet zu stören. Vortex kurz, um die Zellen zu dissoziieren und fünf Mikroliter Fc Block CD32 hinzuzufügen. Fügen Sie 100 Mikroliter der Mischung der primären Antikörper von Interesse hinzu und inkubieren Sie für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.

Zentrifugieren Sie bei 350 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Tupfen Sie die Röhrchen kopfüber auf weiches Papier. Wirbeln Sie die Röhre kurz auf, fügen Sie dann 100 Mikroliter der sekundären Antikörpermischung hinzu und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Fügen Sie einen Milliliter Myelinentfernungspuffer hinzu und wiederholen Sie die Zentrifugation. Entsorgen Sie den Überstand und tupfen Sie die Röhrchen kopfüber auf weiches Papier. Suspendieren Sie die Zellen in 250 Mikrolitern sterilem PBS und fahren Sie direkt mit der Zellsortierung fort.

Der in vivo SPECT-Scan von Wildtyp-Ratten zeigte eine höhere Bindung von CLINDE an der Stelle der Lipopolysaccharid-Injektion als in der kontralateralen Region des Gehirns. Die Ex-vivo-Proben, die fluoreszenzaktiviertes Zellsortierungs-radioligandenbehandeltes Gewebe oder FACS-RTT unterzogen wurden, zeigten das Vorhandensein einer höheren Anzahl von CLINDE-Bindungsstellen nur in Mikroglia, was zeigt, dass der zelluläre Ursprung des CLINDE-Signals auf der ipsilateralen Seite des Gehirns Mikroglia war. Der Anstieg des Translokatorproteins oder der TSPO-Bindung nach 12 Monaten bei TgF344-AD-Ratten war auf Astrozyten beschränkt.

Bei 24 Monate alten Ratten wurde die Zunahme der TSPO-Bindung sowohl aufgrund astrozytischer als auch mikroglialer Veränderungen beobachtet. Bei älteren TgF344-AD-Ratten zeigten striatale Astrozyten im Vergleich zum Wildtyp eine verringerte 5HT2AR-Dichte. Eine kortikale Überexpression von TSPO wurde sowohl in Astrozyten als auch in Mikroglia von AD-Probanden im Vergleich zu altersangepassten Kontrollen beobachtet, wenn FACS-RTT an humanen AD-Postmortem-Proben durchgeführt wurde.

Befolgen Sie bei der Arbeit mit Radioaktivität die Anweisungen des Strahlenschutzes und tragen Sie eine geeignete persönliche Schutzausrüstung. Stellen Sie dann nach dem Eingriff sicher, dass die Arbeitsumgebung dekontaminiert wird. Die Proteinquantifizierung und Genexpressionsanalyse kann nach diesem Verfahren an isolierten Zellpopulationen problemlos durchgeführt werden.