Design und Entwicklung eines Modells zur Untersuchung der Wirkung von zusätzlichem Sauerstoff auf das Mukoviszidose-Atemwegsmikrobiom

Diese Protokolle wurden entwickelt, um die In-vitro-Effekte des zusätzlichen Sauerstoffverbrauchs auf das Lungenmikrobiom von Mukoviszidose-Patienten zu modellieren. Dieses Medienrezept ist auf die physiologische Zusammensetzung von Sputum für Menschen mit Mukoviszidose zugeschnitten. Der Sparging-Prozess führt die Fähigkeit ein, unter verschiedenen Sauerstoffbedingungen zu kultivieren.

Veränderungen des künstlichen Sputummediums ermöglichen es, andere chronische Lungenerkrankungen nachzuahmen und mikrobielle Gemeinschaften unter anderen Bedingungen zu modellieren, wie z.B. unterschiedliche Glukosekonzentrationen bei gleichzeitigen Mukoviszidose- und Diabetespatienten. Eine Übersicht über die Schritte zur künstlichen Sputummediumaufbereitung zeigt das Mischen der hergestellten ASCM, ASMM und ASBM. Der Mopppuffer wird verwendet, um den pH-Wert auf 6,3 zu titrieren und die Filtersterilisation des Mediums wird in einem kalten Raum auf einem Orbitalschüttler durchgeführt.

Bereiten Sie zunächst ein künstliches Sputummedium vor, indem Sie 250 Milliliter ASCM in die Ein-Liter-Flasche geben, die ASMM enthält. Dann geben Sie 250 Milliliter ASBM in die mittlere Flasche. Titrieren Sie das Medium mit einem einfachen molaren Mopppuffer, um einen pH-Wert von 6,3 auf einem pH-Papier zu erreichen.

Kühlen Sie das künstliche Sputummedium bei vier Grad Celsius bis zur Filtration. Um dann den Filtrationsprozess zu starten, geben Sie 200 Milliliter ungefiltertes künstliches Auswurfmedium in ein Vakuumfiltrationssystem mit einem 0,22 Mikrometer porengroßen Filter. Nachdem Sie das Filtersystem an die Vakuumpumpe angeschlossen haben, schalten Sie die Vakuumpumpe ein, stellen Sie die Kammer dann auf einen Orbitalschüttler und schütteln Sie mit 90 Umdrehungen pro Minute in einem kalten Raum bei vier Grad Celsius.

Wechseln Sie den Filter, nachdem 350 Milliliter Medium gefiltert wurden, um das Verstopfungsproblem zu überwinden. Nachdem eine beträchtliche Menge filtriert wurde, an einem zusätzlichen 150 Milliliter Medium für die Filtration. Wiederholen Sie die Filtration mit zusätzlichen Kammern, bis alle Medien gefiltert sind.

Überblick über die Sauerstoffschonung, die die Zugabe von Patientensputum zu künstlichem Sputummedium in einer autoklavierten Serumflasche demonstriert. Dann die versiegelte Serumflasche mit einem Gasgemisch schonen. Schließlich wird die Serumflasche inkubiert, um die Kultur Alec Watts im 24-Stunden-Intervall für die anschließende Metagenomik-Sequenzierung zu erhalten.

Um mit dem Sparging der Serumflaschenkultur zu beginnen, beschriften Sie 500 Milliliter autoklavierte Serumflaschen mit Probenkennzeichnungen, Datum und Uhrzeit der Impfung und Zielsauerstoffanteil. In einer biologischen Haube 24 Milliliter des künstlichen Sputummediums zu jeder aufzustellenden Serumflasche geben. Um ein ausreichendes Probenvolumen für jede Kulturbedingung zu erhalten, verdünnen Sie gegebenenfalls die Probe mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung, homogenisieren Sie dann Sputum mit einer 18-Gauge-Nadel und geben Sie einen Milliliter des Patienten-Sputums in jede Serumflasche.

Als nächstes legen Sie mit einer sterilen Pinzette die autoklavierten Gummistopfen auf die Oberseite jeder Serumflasche und drücken Sie die Gummistopfen nach unten, ohne die Unterseite des Stopfens zu berühren. Nachdem Sie die Flaschen von der Haube genommen haben, tragen Sie die Aluminiumdichtungen auf und crimpen Sie sie. Entfernen Sie das Mittelstück der Dichtungen und wischen Sie die Oberseite der Flaschen mit einem Alkoholwisch ab und führen Sie das Flaschensiegel durch eine Bunsenbrennerflamme.

Befestigen Sie nun eine sterile 18-Gauge-Nadel an einer Kolbenlistenspritze mit einem Filter, führen Sie die angebrachte Gasfreisetzungsspritze zuerst in die Flasche ein. Befestigen Sie nun eine sterile Nadel mit 18 Messgeräten am Gasausgang des Systems und führen Sie die Gasausgangsnadel ebenfalls in die Flasche ein. Leiten Sie die T-Kreuzungen von den Tanks durch den Sauerstoffmonitor.

Nach der Überprüfung der Zielsauerstoffkonzentration, die durch das System fließt, sollen etwa fünf Liter pro Minute Gasstrom anvisiert werden. Leiten Sie die T-Knotenpunkte von den Tanks bis zum Gasausgang um. Wenn das Gas durch die Serumflasche zu fließen beginnt, achten Sie genau auf das Manometer und wenn der Druck unerwartet ansteigt, schalten Sie das System sofort aus.

Nach dem Laufen sauerstoffsparen Sie eine Minute lang mit fünf Litern pro Minute durch die Serumflasche, die Einstellungen ermöglichen 10 Luftwechsel und stellen sicher, dass die innere Atmosphäre die gewünschte Konzentration von 100% Sauerstoff erreicht. Entfernen Sie die Gasfreisetzung, 18 Gauge Nadel. Nachdem sich der Druck in der Serumflasche auf eine Atmosphäre aufgebaut hat, entfernen Sie sofort die Gasausgangsnadel.

Inkubieren Sie die Serumflaschen in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator-Shaker in 150 Umdrehungen pro Minute für 3, 24-Stunden-Intervalle. Alec Watts werden in jedem 24-Stunden-Intervall zur nachgeschalteten Analyse entnommen und die Proben werden jedes Mal neu gespatzt. Das Beispiel hier zeigt, wie eine Kultur vor und nach der Inkubation aussehen kann.

Die Sauerstoff- und pH-Werte des Ausflusses wurden im Laufe des Kulturprozesses für Sputumproben gemessen, die bei 37 Grad Celsius gehalten wurden. Bei beiden Sparging-Intervallen von 12 Stunden und 24 Stunden wurden die Sauerstoffkonzentrationen im Laufe der Zeit ungefähr aufrechterhalten, wobei für alle drei Bedingungen ein moderater Abfall der Sauerstoffkonzentration beobachtet wurde. Die gemessenen pH-Werte lagen im physiologischen Bereich ohne signifikante Veränderungen im Laufe der Zeit.

Der Vergleich von mikrobieller Belastung, Diversität und Gemeinschaftszusammensetzung zwischen unkultiviertem und kultiviertem Sputum ergab eine 20-fache Zunahme der mikrobiellen Belastung im kultivierten Sputum. Diversitätsmetriken zeigten die Erhaltung der Zusammensetzung der Gemeinschaft mit minimalen globalen Unterschieden, die durch den Kulturprozess eingeführt wurden. Die vergleichende Analyse der 120 mikrobiellen Arten im kultivierten und unkultivierten Sputum wurde durch metagenomische Sequenzierung durchgeführt.

46 dieser Arten wurden sowohl in unkultivierten als auch in kultivierten Proben identifiziert. Während 35 ausschließlich in unkultivierten Proben und 39 ausschließlich in kultivierten Proben identifiziert wurden. Absorbierende Wachstumskurven wurden für häufige CF-Lungenpathogene erzeugt, die in künstlichen Sputummedien aus Patientenprobenisolaten unter normaler Sauerstoffkonzentration von 21% kultiviert wurden.

Keine Änderung der optischen Dichte bei 600 Nanometern im Asom im Laufe der Zeit, nur die Negativkontrolle zeigte eine kontaminationsfreie Kultur an. Die beobachteten typischen Wachstumskurvenmuster deuten darauf hin, dass ASM-Medium zur Erzeugung von Wachstumskurven mit optischen Methoden verwendet werden kann. Die metagenomische Sequenzierung wird hier verwendet, um die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft zu beschreiben.

Andere Techniken wie die metatranskriptomische Sequenzierung können verwendet werden, um die Genexpression zu bewerten, oder die Metabolomik, um die Metabolitenproduktion zu bewerten.