Messung des mitochondrialen Substratflusses in rekombinanten Perfringolysin O-permeabilisierten Zellen

Weil es den Mitochondria-Substratfluss testet, der mit verschiedenen Pathologien oder Behandlungen betroffen sein kann. Zum Beispiel werden wir es heute verwenden, um die Reaktion von Krebszellen auf die Metformin-Behandlung aufzudecken. Es erfordert eine minimale Anzahl von Zellen bei ausreichenden Replikaten und angemessener Kontrolle für jedes einzelne Material.

Der Analysator ist nur für Forschungszwecke bestimmt. Diese Technik kann Fehler im mitochondrialen Stoffwechsel identifizieren und kann verwendet werden, um Kriegermedikamente zu bewerten, die Mitochondrien beeinflussen. Das Verfahren wird Karolina Vaneckova, eine Studentin und Forschungstechnikerin aus meinem Labor, demonstrieren.

Um zu beginnen, säen Sie A549-Zellen mit einer Dichte von 20.000 Zellen pro Vertiefung in Säulen, zwei bis 11 eines Seepferdchens XF 96 Zellkultur-Mikroplatte. Die Spalten eins und 12 bleiben als Hintergrundschachts leer. Füllen Sie die leeren Wells mit einem gleichen Volumen des Zellkulturmediums und inkubieren Sie die Zellen dann bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid zur Zellanlagerung.

Nach drei bis vier Stunden 100 Mikroliter Zellkulturmedium in die Wells geben. Behandeln Sie die experimentellen Gruppenspalten sieben bis 11 mit einem millimolaren Metformin und die Kontrollgruppe mit einem gleichen Volumen sterilen destillierten Wassers und bringen Sie die Platte dann zum Inkubator zurück. Zur Hydratation der Sensoren werden 200 Mikroliter steriles Wasser pro Vertiefung in die Versorgungsplatte pipettiert.

Geben Sie dann die Sensorpatrone vorsichtig zurück, während Sie den Sensor in Wasser tauchen. Inkubieren Sie die Kartusche in einem kohlendioxidfreien Inkubator bei 37 Grad Celsius bis zum nächsten Tag. Schalten Sie den Analysator und die Steuereinheit ein.

Starten Sie die Gerätesteuerungs- und Datenerfassungssoftware und entwerfen Sie das Assay-Protokoll wie im Textmanuskript beschrieben. Erstellen Sie unter Gruppendefinitionen vier Injektionsstrategien, bei denen sich Port A je nach injiziertem Substrat unterscheidet, und benennen Sie die Strategien nach den Substraten oder Abkürzungen. Weisen Sie Oligomycin Port B, FCCP Port C und Rotenone Antimycin A-Gemisch Port D zu.Erstellen und benennen Sie acht Gruppen, unter der Plattenzuordnung, weisen Sie gruppen den entsprechenden Wells zu.

Speichern Sie dann das Protokoll als gebrauchsfertige Vorlage. Lassen Sie den Analysatorschalter eingeschaltet, damit sich die Temperatur über Nacht stabilisieren kann. Entsorgen Sie am nächsten Tag das Wasser von der Versorgungsplatte und fügen Sie 200 Mikroliter des vorgewärmten Kalifrants pro Vertiefung in die Versorgungsplatte hinzu.

Bringen Sie die Kartusche bis zum Zeitpunkt des Assays in den kohlendioxidfreien Inkubator zurück. Halten Sie eine Feuchtigkeitsquelle im Inneren des Inkubators aufrecht und schalten Sie die Lüfterdrehzahl aus oder reduzieren Sie sie auf ein Minimum, um eine schnelle Verdunstung des Kalifants zu vermeiden. Bereiten Sie fünf Milliliter der Arbeitslösung der Substrate und Inhibitoren mit vorgewärmter zweifach mitochondrialer Assay-Lösung, 5% BSA und sterilem Wasser wie im Textmanuskript beschrieben her.

Als nächstes laden Sie die Injektorports mit Substrat und Inhibitoren, wie im Steuermanuskript beschrieben. Klicken Sie zur Kalibrierung auf der Registerkarte Assay ausführen auf den Startlauf, um den Test zu starten. Setzen Sie die geladene Zensorkassette ein und warten Sie, bis die Kalibrierung abgeschlossen ist.

Bereiten Sie ein 20 Milliliter Assay-Medium vor, indem Sie zweifache mitochondriale Assay-Lösung, steriles Wasser und 5% BSA in einem 50-Milliliter-Röhrchen mischen. Fügen Sie zwei Mikroliter von 10 mikromolaren rekombinanten Perfringolysin O hinzu, um eine Konzentration von einem Nanomolar zu erreichen. Und setzen Sie die Mischung mit sanftem Pipettieren wieder auf, um Schütteln und Wirbeln zu vermeiden.

Die Tube bis zum Gebrauch bei 37 Grad Celsius inkubieren. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die Zellen und die leeren leeren Brunnen zweimal zu waschen, wobei Sie vorgewärmte kalzium- und magnesiumfreie PBS-Lösung verwenden. Verwerfen Sie das PBS und fügen Sie 180 Mikroliter des vorgewärmten Assay-Mediums zur Zellpermeabilisierung hinzu.

Ersetzen Sie unmittelbar nach der Permeabilisierung die Versorgungsplatte der kalibrierten Sensorkartusche durch die Zellplatte mit permeabilisierten Zellen und starten Sie die Messung. Die Behandlungsgruppe hatte eine höhere Rate an Succinat-induzierter Atmung. Das Ansprechen von A549-Zellen auf die Metformin-Behandlung war höher als das von Hep G2. Für die Pyruvatmalat-induzierte Atmung zeigten A549-Zellen eine erhöhte Induktion im Vergleich zu Hep G2-Zellen zwischen fünf und 15 Minuten.

Ähnliche Ergebnisse wurden für die Glutamatmalat-induzierte Atmung und die Palmitoylcarnitin-Malat-induzierte Atmung erzielt. Um die richtige Konzentration von Substrat und Inhibitoren zu erreichen. Das richtige Volume muss in den richtigen Port geladen werden.

Wenn eine Veränderung in einem Stoffwechselweg eines bestimmten Substrats identifiziert wird, muss die Funktion der Enzyme und Transporter, die an diesem Weg beteiligt sind, bewertet werden.