Name: Messung des mitochondrialen Substratflusses in rekombinanten Perfringolysin O-permeabilisierten Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Erfahren Sie die Messung des mitochondrialen Substratflusses in rekombinanten Perfringolysin O-permeabilisierten Zellen. Diese Methode nutzt Mikroplatten-Respirometrie zur Untersuchung von Metformin-Effekten in A549- und Hep G2-Tumorzelllinien.

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Die Autoren danken den Mitarbeitern der Abteilung für Physiologie an der Medizinischen Fakultät in Hradec Králové und der Abteilung für Pathophysiologie der Dritten Medizinischen Fakultät für die Hilfe bei chemikalien und Probenvorbereitung. Diese Arbeit wurde durch die Stipendienprogramme der Karlsuniversität PROGRES Q40/02, den Zuschuss des tschechischen Gesundheitsministeriums NU21-01-00259, den Zuschuss der tschechischen Wissenschaftsstiftung 18-10144 und das INOMED-Projekt CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 unterstützt, das vom Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik und von der Europäischen Union finanziert wurde.

1. Einen Tag vor dem Assay
<ol><li>Herstellung von Reagenzien und Substraten.<ol>
<li>Mitochondriale Assay-Lösung (MAS): Herstellung von Stammlösungen aller Reagenzien wie in Tabelle 1beschrieben. Erwärmen Sie die Bestände an Mannitol und Saccharose auf 37 °C, um sich vollständig aufzulösen. Mischen Sie die Reagenzien, um 2x MAS vorzubereiten, dann erwärmen Sie die Mischung auf 37 ° C. Stellen Sie den pH-Wert mit 5N KOH auf 7,4 (~ 7 ml) ein, fügen Sie dann Wasser hinzu, um das Volumen auf 1 L zu bringen. Filtern Sie die Aliquots und lagern Sie die Aliquots bis zum Messtag bei -20 ° C.</li>
		<li>Rinderserumalbumin (5% BSA): 5 g BSA in 90 ml vorgewärmtem sterilem Wasser auf einem Magnetrührer auflösen und Schütteln vermeiden. Stellen Sie den pH-Wert mit 5 N KOH auf 7,4 ein und fügen Sie dann Wasser hinzu, um das Volumen auf 100 ml zu bringen. Filtriern-sterilisieren und lagern Sie die Aliquots bei -20 °C bis zum Messtag.</li>
		<li>Mitochondriale Substrate: Bereiten Sie 1 M Stammlösungen von Natriumsuccinat, Natriumpyruvat und Natriumglutamat in sterilem Wasser vor. Bereiten Sie 100 mM Stammlösung von Natriummalat in sterilem Wasser vor und verwenden Sie vorgewärmtes steriles Wasser, um eine 10 mM Stammlösung von Palmitoylcarnitin herzustellen. Stellen Sie den pH-Wert jeder Lösung auf 7,4 x 5 N KOH ein und filtern Sie ihn. Lagern Sie die Substrate bei 2-8 °C. Zum Zeitpunkt der Anwendung Palmitoylcarnitin auf 37 °C erwärmen, um etwaige Ausscheidungen aufzulösen. Zur späteren Verwendung aliquots aller Substrate außer Pyruvat bei -20 °C lagern.</li>
		<li>Mitochondriale Inhibitoren: Dimethylsulfoxid (DMSO) zur Herstellung von Stammlösungen aus 25 mM Oligomycin, 50 mM Carbonylcyanid 4-(Trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP), 20 mM Rotenon und 20 mM Antimycin A. Lagern Sie die Aliquots bei -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seeding und Behandlung der Zellen: Wie in Abbildung 2gezeigt, säen Sie die Zellen in den Spalten 2-11. Die Spalten 1 und 12 müssen leer gelassen werden, um als Hintergrundschächte zu dienen. In dieser Arbeit wurden HepG2- und A549-Zellen verwendet.<ol>
<li>Säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 20.000 Zellen pro Vertiefung aus. Verwenden Sie 50-80 μL Zellkulturmedium für die Aussaat.</li>
		<li>Füllen Sie die leeren Vertiefungen mit einem gleichen Volumen Zellkulturmedium und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5%CO2. Lassen Sie die Zellen für 3-4 Stunden anhaften und geben Sie dann 100 μL Zellkulturmedium zu allen Vertiefungen hinzu.</li>
		<li>Wenden Sie mit dieser letzten mittleren Zugabe die Behandlung in den Spalten 7–11 an. In dieser Arbeit wurde die experimentelle Gruppe 16 Stunden lang mit 1 mM Metforminhydrochlorid behandelt, und die Kontrollgruppe wurde mit einem gleichen Volumen sterilen destillierten Wassers als Vehikelkontrolle behandelt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hydratisierung der Sensoren: 200 μL steriles Wasser pro Vertiefung in die Versorgungsplatte pipettieren und dann die Sensorpatrone vorsichtig zurückgeben, während die Sensoren in Wasser eingetaucht werden. Inkubieren Sie die Kartusche ineinem CO2-freienInkubator bei 37 °C bis zum nächsten Tag.</li>
	<li>Die Assay-Protokollvorlage: Schalten Sie den Analysator (siehe Materialtabelle)und die Controller-Einheit ein. Starten Sie die Gerätesteuerungs- und Datenerfassungssoftware, und entwerfen Sie das Assay-Protokoll wie in Tabelle 2beschrieben. Erstellen Sie unter Gruppendefinitionenvier Injektionsstrategien, bei denen sich Port A je nach injiziertem Substrat unterscheidet (Abbildung 3). Benennen Sie die Strategien nach den Substraten oder deren Abkürzungen.</li>
	<li>Weisen Sie den Ports B, C und D die Verbindungen Oligomycin, FCCP bzw. Rotenon/Antimycin A zu. Erstellen Sie acht Gruppen, und benennen Sie sie wie in Abbildung 4 dargestellt. Weisen Sie unter Plate Map die Gruppen den entsprechenden Wells zu und speichern Sie das Protokoll dann als gebrauchsfertige Vorlage. Lassen Sie den Analysator eingeschaltet, damit sich die Temperatur über Nacht stabilisieren kann. Bewahren Sie den Analysator an einem Ort mit einer stabilen Temperatur auf, um plötzliche Temperaturänderungen zu vermeiden.</li>
</ol>2. Der Tag des Assays
<ol><li>Ersetzen von Wasser durch den Kalifrant: Entsorgen Sie das Wasser von der Versorgungsplatte und pipettieren Sie 200 μL vorgewärmtes Calibrant pro Vertiefung in die Versorgungsplatte. Geben Sie die Kartusche bis zum Zeitpunkt des Assays in denCO2-freienInkubator zurück. Um eine schnelle Verdunstung des Kalifrants zu vermeiden, halten Sie eine Feuchtigkeitsquelle im Inneren des Inkubators aufrecht und schalten Sie die Lüfterdrehzahl aus oder reduzieren Sie sie auf ein Minimum.</li>
	<li>Vorbereitung der Arbeitslösungen: Beginnen Sie mit dem Erwärmen von 2x MAS, 5% BSA und sterilem Wasser auf 37 °C. In der Zwischenzeit lassen Sie die Inhibitorvorräte Raumtemperatur erreichen. Verwenden Sie warmes 2x MAS und steriles destilliertes Wasser, um 5 ml der Arbeitskonzentration der Substrate und Inhibitoren wie in Tabelle 3beschrieben herzustellen.</li>
	<li>Laden der Injektionsöffnungen: Wie in Abbildung 3gezeigt, laden Sie 20 μL der Substrate in Port A. Laden Sie das Succinat/Rotenon-Gemisch in Port A der Reihen A und B. Laden Sie das Pyruvat/Malat-Gemisch in Port A der Reihen C und D. Laden Sie das Glutamat/Malat-Gemisch in Port A der Reihen E und F. Laden Sie das Palmitoylcarnitin/Malat-Gemisch in port A der Zeilen G und H. Für die gesamte Platte laden Sie Port B mit 22 μL Oligomycin-Vorbereitung, Port C mit 25 μL FCCP-Vorbereitung und Port D mit 27 μL Rotenon/Antimycin A-Gemisch.</li>
	<li>Starten des Kalibrierungsschritts: Klicken Sie auf der Registerkarte Run Assay auf Start Run, um den Assay zu starten. Setzen Sie die geladene Sensorkassette ein und starten Sie den Kalibrierungsschritt. Warten Sie, bis die Kalibrierung abgeschlossen ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
	<li>Herstellung des Assay-Mediums (MAS-BSA-rPFO): Um 20 ml des Assay-Mediums herzustellen, mischen Sie 10 ml 2x MAS, 9,2 ml steriles Wasser und 0,8 ml 5% BSA in einem 50-ml-Röhrchen. Fügen Sie 2 μL 10 μM rPFO hinzu, um eine Konzentration von 1 nM zu erreichen, und resuspenieren Sie die Mischung mit schonender Pipettung. Vermeiden Sie Schütteln und verwenden Sie keinen Wirbelmischer zum Mischen. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C bis zum Zeitpunkt der Verwendung.</li>
	<li>Waschen der Zellen: Waschen Sie die Zellen und die leeren Rohlinge zweimal mit vorgewärmter kalzium- und magnesiumfreier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einer Mehrkanalpipette. Vermeiden Sie es, die gleichen Spitzen wiederzuverwenden, um das Zellkulturmedium zu verwerfen und PBS hinzuzufügen. Führen Sie diesen Schritt außerhalb der laminaren Strömung durch, um die Zellen vor dem Austrocknen durch den Luftstrom zu schützen.</li>
	<li>Zellpermeabilisierung im Assay-Medium: Verwerfen Sie das PBS mit einer Mehrkanalpipette und ersetzen Sie es durch 180 μL des vorgewärmten Assay-Mediums (MAS-BSA-rPFO).</li>
	<li>Beginn der Messung: Ersetzen Sie unmittelbar nach der Permeabilisierung die Versorgungsplatte der kalibrierten Sensorpatrone durch die Zellplatte und starten Sie die Messung.</li>
</ol>

<ol><li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li>
<li>Murphy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+function%2C+biology%2C+and+role+in+disease%3A+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).</li>
<li>Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+key+role+of+anaplerosis+and+cataplerosis+for+citric+acid+cycle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).</li>
<li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicholls%2C+DG+%22Bioenergetics+3%22">Bioenergetics 3</a>. , Academic press. London. (2002).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>Staňková, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+mitochondrial+substrate+flux+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101(2020).</li>
<li>Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+measurement+of+respiratory+activity+in+permeabilized+cells+using+extracellular+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).</li>
<li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazolidinediones+are+acute%2C+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li>
<li>Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+probe+Methyltriphenylphosphonium+%28TPMP%29+inhibits+the+Krebs+cycle+enzyme+2-Oxoglutarate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase.</a> PLoS One. 11 (8), 0161413(2016).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), 21746(2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

Dieses Protokoll ist eine Modifikation der zuvor veröffentlichten Studien7,8,9,10 und des Produkt-Benutzerhandbuchs. Im Gegensatz zum Protokoll des Herstellers wird anstelle von 3x MAS 2x MAS verwendet, da 2× MAS leichter aufzulösen ist und nach dem Einfrieren keine Ausfällungen bildet. Gefrorene 2x MAS Aliquots können bis zu sechs Monate gelagert werden und zeigen konsistente Ergebnisse. Ein w...

Die Mikroplatten-basierte Respirometrie hat die mitochondriale Forschung revolutioniert, indem sie die Untersuchung der Zellatmung einer kleinen Stichprobengrößeermöglicht 1. Die Zellatmung wird im Allgemeinen als Indikator für die mitochondriale Funktion oder "Dysfunktion" angesehen, obwohl der mitochondriale Funktionsumfang über die Energieproduktion hinausgeht2. Unter aeroben Bedingungen extrahieren Mitochondrien die in verschiedenen Substraten gespeicherte Energie, indem sie diese Substrate abbauen und in metabolische Zwischenprodukte umwandeln, die den Zitronensäurezyklus3 antreiben können (Abbildung 1). Der kontinuierliche Fluss von Substraten ist essentiell für den Fluss des Zitronensäurezyklus, um hochenergetische "Elektronendonatoren" zu erzeugen, die Elektronen an die Elektronentransportkette liefern, die einen Protonengradienten über die innere mitochondriale Membran erzeugt, so dass die ATP-Synthase ADP zu ATP4phosphorylieren kann. Daher muss ein experimentelles Design zur Untersuchung der mitochondrialen Atmung die Probennatur (intakte Zellen, permeabilisierte Zellen oder isolierte Mitochondrien) und mitochondriale Substrate umfassen.
Zellen halten einen Vorrat an einheimischen Substraten5, und Mitochondrien oxidieren mehrere Arten von Substraten gleichzeitig6, was die Interpretation von Ergebnissen aus Experimenten an intakten Zellen erschwert. Ein gängiger Ansatz zur Untersuchung der mitochondrialen Fähigkeit, ein ausgewähltes Substrat zu oxidieren, besteht darin, Mitochondrien zu isolieren oder die untersuchten Zellen zu permeabilisieren5. Obwohl isolierte Mitochondrien ideal für quantitative Studien sind, ist der Isolationsprozess mühsam. Es steht vor technischen Schwierigkeiten wie der Notwendigkeit eines großen Stichprobenumfangs, der Reinheit der Ausbeute und der Reproduzierbarkeit der Technik5. Permeabilisierte Zellen bieten eine Lösung für die Nachteile der mitochondrialen Isolierung; Routinemäßige Permeabilisatoren der Detergenziennatur sind jedoch nicht spezifisch und können die mitochondrialen Membranen schädigen5.
Rekombinantes Perfringolysin O (rPFO) wurde als selektives Plasmamembranpermeabilisierungsmittel7angeboten und in mehreren Studien7,8,9,10erfolgreich in Kombination mit einem extrazellulären Flussmittelanalysator eingesetzt . Wir haben ein Protokoll mit rPFO modifiziert, um den mitochondrialen Substratfluss mit dem extrazellulären Flussanalysator XFe96 zu screenen. In diesem Protokoll werden vier verschiedene Substratoxidationswege in zwei zellulären Phänotypen verglichen, während ausreichende Replikate und die richtige Kontrolle für jedes getestete Material vorhanden sind.

<table><tbody><tr><td>Adenosin 5&prime; -diphosphat monokaliumsalzdihydrat</td><td>Merck</td><td>A5285</td><td>bei -20 &deg; lagern C</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Merck</td><td>A8674</td><td>lagern bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Merck</td><td>A3803</td><td>bei 2 - 8 &deg; C</td></tr><tr><td>Carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy)phenylhydrazon</td><td>Merck</td><td>C2920</td><td>bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Merck</td><td>D8418</td><td>bei RT</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Merck</td><td>63559</td><td>bei RT aufbewahren</td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>bei RT aufbewahren</td></tr><tr><td>Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraessigsäure</td><td>Merck</td><td>03777</td><td>bei RT</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck</td><td>H7523</td><td>bei RT L</td></tr><tr><td>(-)Apfelsäure-Dinatriumsalz</td><td>Merck</td><td>M9138</td><td>bei RT</td></tr><tr><td>L-Glutaminsäure-Natriumsalzhydrat</td><td>Merck</td><td>G5889</td><td>bei RT lagern</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Merck</td><td>M2670</td><td>bei RT</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Merck</td><td>O4876</td><td>bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Palmitoyl-DL-Carnitinchlorid</td><td>Merck</td><td>P4509</td><td>bei -20 &deg lagern; C</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid</td><td>Merck</td><td>484016</td><td>bei RT lagern</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Merck</td><td>P5655</td><td>bei RT</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>lagern Merck</td><td>R8875</td> bei <td>-20 &deg; C</td></tr><tr><td>Seahorse Wave Desktop Software</td><td>Agilent Technologien</td><td></td><td>Download von www.agilent.com</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analyzer</td><td>Agilent technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent technologies</td><td>102416-100</td><td>XFe96 Sensorkartuschen und XF96 Zellkultur-Mikrotiterplatten</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Merck</td><td>P2256</td><td>lagern bei 2 - 8 &deg; C</td></tr><tr><td>Natriumsuccinat, zweibasisches Hexahydrat,</td><td>Merck</td><td>S2378</td>, <td>Lager bei RT</td></tr><tr><td>Saccharose</td>, <td>Merck</td><td>S7903</td>, <td>Lager bei RT</td></tr><tr><td>Water</td><td>Merck</td><td>W3500</td>, <td>Lager bei RT</td></tr><tr><td>XF Kalibrant</td><td>Agilent Technologies</td><td>100840-000</td>, <td>Lager bei RT</td></tr><tr><td>XF Plasmamembran-Permeabilizer</td><td>Agilent Technologies</td><td>102504-100</td><td>Rekombinantes Perfringolysin O (rPFO) - Aliquot und lagern bei -20 &deg; C</td></tr></tbody></table>

messung des mitochondrialen substratflusses in rekombinanten perfringolysin o-permeabilisierten zellen

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

Der mitochondriale Substratfluss ist ein Unterscheidungsmerkmal jedes Zelltyps, und Veränderungen seiner Komponenten wie Transporter, Kanäle oder Enzyme sind an der Pathogenese mehrerer Krankheiten beteiligt. Mitochondrialer Substratfluss kann mit intakten Zellen, permeabilisierten Zellen oder isolierten Mitochondrien untersucht werden. Die Untersuchung intakter Zellen stößt aufgrund der gleichzeitigen Oxidation verschiedener Substrate auf mehrere Probleme. Außerdem enthalten mehrere Zelltypen interne Speicher verschiedener Substrate, die die Interpretation der Ergebnisse erschweren. Methoden wie die mitochondriale Isolierung oder die Verwendung von Permeabilisatoren sind nicht leicht reproduzierbar. Die Isolierung reiner Mitochondrien mit intakten Membranen in ausreichenden Mengen aus kleinen Proben ist problematisch. Die Verwendung von nicht-selektiven Permeabilisatoren verursacht verschiedene Grade unvermeidlicher mitochondrialer Membranschäden. Rekombinantes Perfringolysin O (rPFO) wurde dank seiner Fähigkeit, die Plasmamembran selektiv zu permeabilisieren, ohne die mitochondriale Integrität zu beeinträchtigen, als geeigneterer Permeabilisator angeboten. In Kombination mit der Mikroplatten-Respirometrie ermöglicht es, den Fluss mehrerer mitochondrialer Substrate mit genügend Replikaten innerhalb eines Experiments unter Verwendung einer minimalen Anzahl von Zellen zu testen. In dieser Arbeit beschreibt das Protokoll eine Methode zum Vergleich des mitochondrialen Substratflusses von zwei verschiedenen zellulären Phänotypen oder Genotypen und kann angepasst werden, um verschiedene mitochondriale Substrate oder Inhibitoren zu testen.

Beginnen Sie mit der Normalisierung der Ergebnisse auf die zweite Messung der Baseline-Atmung, um Werte als Prozentsatz der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) anzuzeigen. Die Ergebnisse des Assays sind in abbildung 5, Abbildung 6, Abbildung 7 und Abbildung 8 dargestellt. Es ist wichtig, jeder Gruppe die richtigen Hintergrundbohrungen zuzuweisen und die Hintergrundbohrungen...

In dieser Arbeit beschreiben wir ein modifiziertes Protokoll zum Testen des mitochondrialen respiratorischen Substratflusses unter Verwendung von rekombinantem Perfringolysin O in Kombination mit mikroplattenbasierter Respirometrie. Mit diesem Protokoll zeigen wir, wie Metformin die mitochondriale Atmung von zwei verschiedenen Tumorzelllinien beeinflusst.

Messung des mitochondrialen Substratflusses in rekombinanten Perfringolysin O-permeabilisierten Zellen

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

Weil es den Mitochondria-Substratfluss testet, der mit verschiedenen Pathologien oder Behandlungen betroffen sein kann. Zum Beispiel werden wir es heute verwenden, um die Reaktion von Krebszellen auf die Metformin-Behandlung aufzudecken. Es erfordert eine minimale Anzahl von Zellen bei ausreichenden Replikaten und angemessener Kontrolle für jedes einzelne Material.Der Analysator ist nur für Forschungszwecke bestimmt. Diese Technik kann Fehler im mitochondrialen Stoffwechsel identifizieren und kann verwendet werden, um Kriegermedikamente zu bewerten, die Mitochondrien beeinflussen. Das Verfahren wird Karolina Vaneckova, eine Studentin und Forschungstechnikerin aus meinem Labor, demonstrieren.Um zu beginnen, säen Sie A549-Zellen mit einer Dichte von 20.000 Zellen pro Vertiefung in Säulen, zwei bis 11 eines Seepferdchens XF 96 Zellkultur-Mikroplatte. Die Spalten eins und 12 bleiben als Hintergrundschachts leer. Füllen Sie die leeren Wells mit einem gleichen Volumen des Zellkulturmediums und inkubieren Sie die Zellen dann bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid zur Zellanlagerung.Nach drei bis vier Stunden 100 Mikroliter Zellkulturmedium in die Wells geben. Behandeln Sie die experimentellen Gruppenspalten sieben bis 11 mit einem millimolaren Metformin und die Kontrollgruppe mit einem gleichen Volumen sterilen destillierten Wassers und bringen Sie die Platte dann zum Inkubator zurück. Zur Hydratation der Sensoren werden 200 Mikroliter steriles Wasser pro Vertiefung in die Versorgungsplatte pipettiert.Geben Sie dann die Sensorpatrone vorsichtig zurück, während Sie den Sensor in Wasser tauchen. Inkubieren Sie die Kartusche in einem kohlendioxidfreien Inkubator bei 37 Grad Celsius bis zum nächsten Tag. Schalten Sie den Analysator und die Steuereinheit ein.Starten Sie die Gerätesteuerungs- und Datenerfassungssoftware und entwerfen Sie das Assay-Protokoll wie im Textmanuskript beschrieben. Erstellen Sie unter Gruppendefinitionen vier Injektionsstrategien, bei denen sich Port A je nach injiziertem Substrat unterscheidet, und benennen Sie die Strategien nach den Substraten oder Abkürzungen. Weisen Sie Oligomycin Port B, FCCP Port C und Rotenone Antimycin A-Gemisch Port D zu.Erstellen und benennen Sie acht Gruppen, unter der Plattenzuordnung, weisen Sie gruppen den entsprechenden Wells zu.Speichern Sie dann das Protokoll als gebrauchsfertige Vorlage. Lassen Sie den Analysatorschalter eingeschaltet, damit sich die Temperatur über Nacht stabilisieren kann. Entsorgen Sie am nächsten Tag das Wasser von der Versorgungsplatte und fügen Sie 200 Mikroliter des vorgewärmten Kalifrants pro Vertiefung in die Versorgungsplatte hinzu.Bringen Sie die Kartusche bis zum Zeitpunkt des Assays in den kohlendioxidfreien Inkubator zurück. Halten Sie eine Feuchtigkeitsquelle im Inneren des Inkubators aufrecht und schalten Sie die Lüfterdrehzahl aus oder reduzieren Sie sie auf ein Minimum, um eine schnelle Verdunstung des Kalifants zu vermeiden. Bereiten Sie fünf Milliliter der Arbeitslösung der Substrate und Inhibitoren mit vorgewärmter zweifach mitochondrialer Assay-Lösung, 5% BSA und sterilem Wasser wie im Textmanuskript beschrieben her.Als nächstes laden Sie die Injektorports mit Substrat und Inhibitoren, wie im Steuermanuskript beschrieben. Klicken Sie zur Kalibrierung auf der Registerkarte Assay ausführen auf den Startlauf, um den Test zu starten. Setzen Sie die geladene Zensorkassette ein und warten Sie, bis die Kalibrierung abgeschlossen ist.Bereiten Sie ein 20 Milliliter Assay-Medium vor, indem Sie zweifache mitochondriale Assay-Lösung, steriles Wasser und 5% BSA in einem 50-Milliliter-Röhrchen mischen. Fügen Sie zwei Mikroliter von 10 mikromolaren rekombinanten Perfringolysin O hinzu, um eine Konzentration von einem Nanomolar zu erreichen. Und setzen Sie die Mischung mit sanftem Pipettieren wieder auf, um Schütteln und Wirbeln zu vermeiden.Die Tube bis zum Gebrauch bei 37 Grad Celsius inkubieren. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die Zellen und die leeren leeren Brunnen zweimal zu waschen, wobei Sie vorgewärmte kalzium- und magnesiumfreie PBS-Lösung verwenden. Verwerfen Sie das PBS und fügen Sie 180 Mikroliter des vorgewärmten Assay-Mediums zur Zellpermeabilisierung hinzu.Ersetzen Sie unmittelbar nach der Permeabilisierung die Versorgungsplatte der kalibrierten Sensorkartusche durch die Zellplatte mit permeabilisierten Zellen und starten Sie die Messung. Die Behandlungsgruppe hatte eine höhere Rate an Succinat-induzierter Atmung. Das Ansprechen von A549-Zellen auf die Metformin-Behandlung war höher als das von Hep G2. Für die Pyruvatmalat-induzierte Atmung zeigten A549-Zellen eine erhöhte Induktion im Vergleich zu Hep G2-Zellen zwischen fünf und 15 Minuten.Ähnliche Ergebnisse wurden für die Glutamatmalat-induzierte Atmung und die Palmitoylcarnitin-Malat-induzierte Atmung erzielt. Um die richtige Konzentration von Substrat und Inhibitoren zu erreichen. Das richtige Volume muss in den richtigen Port geladen werden.Wenn eine Veränderung in einem Stoffwechselweg eines bestimmten Substrats identifiziert wird, muss die Funktion der Enzyme und Transporter, die an diesem Weg beteiligt sind, bewertet werden.

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Forschung

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Biologie

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Hochauflösende Respirometrie, gekoppelt mit Fluoreszenzsensoren, bestimmt den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur Beurteilung der mitochondrialen Atemfrequenzen und der ROS-Produktion im permeabilisierten Ischiasnerv.

Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie

Wir beschreiben schrittweise Protokolle zur Messung der mitochondrialen Atmung von Maus und humanen Neutrophilen und HL60-Zellen mit dem metabolischen extrazellulären Flussanalysator.

Echtzeitmessung des mitochondrialen bioenergetischen Profils von Neutrophilen

Hier präsentieren wir eine Zusammenstellung von Assays zur direkten Messung der mitochondrialen Funktion in Säugetierzellen, unabhängig von ihrer Fähigkeit, molekularen Sauerstoff zu verbrauchen.

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

Hier beschreiben wir eine umfassende Methode zur Messung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung in frischen permeabilisierten Skelettmuskelfasern aus menschlichen oder Mausmuskeln. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Quantifizierung der mitochondrialen Atmung und die Beurteilung der Brennstoffpräferenz und der metabolischen Flexibilität unter Beibehaltung bestehender mitochondrialer Netzwerke und der Membranintegrität.

Messung der mitochondrialen Atmung in Skelettmuskelfasern von Mensch und Maus mittels hochauflösender Respirometrie

Die Methoden zur Untersuchung der mitochondrialen Bioenergetik unter physiologisch relevanten Substratkonzentrationen in Immunzellen sind begrenzt. Wir stellen ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das hochauflösende Fluorespirometrie verwendet, um Veränderungen in der Reaktion des mitochondrialen Membranpotentials auf den Energiebedarf in menschlichen T-Zellen, Monozyten und peripheren mononukleären Zellen zu bewerten.

Hochauflösende Fluorespirometrie zur Beurteilung dynamischer Veränderungen des mitochondrialen Membranpotentials in menschlichen Immunzellen

Erfahren Sie die Messung des mitochondrialen Substratflusses in rekombinanten Perfringolysin O-permeabilisierten Zellen. Diese Methode nutzt Mikroplatten-Respirometrie zur Untersuchung von Metformin-Effekten in A549- und Hep G2-Tumorzelllinien.

Messung des mitochondrialen Substratflusses in rekombinanten Perfringolysin O-permeabilisierten Zellen

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