Name: Messung der Fettsäure-β-Oxidation in einer Suspension frisch isolierter Maus-Hepatozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Erfahren Sie die Messung der Fettsäure-β-Oxidation in frisch isolierten Maus-Hepatozyten. Diese Methode erhalten die Organellintegrität und minimieren Genexpressionsänderungen für zuverlässige metabolische Analysen.

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Diese Arbeit wurde durch den Zuschuss der National Institutes of Health R35GM119528 an Roberta Leonardi unterstützt.

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<li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).</li>
<li>Richert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+human+hepatocytes+in+suspension+after+isolation+is+similar+to+the+liver+of+origin%2C+is+not+affected+by+hepatocyte+cold+storage+and+cryopreservation%2C+but+is+strongly+changed+after+hepatocyte+plating%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%3A+The+Biological+Fate+of+Chemicals%22%5BJournal%5D)">Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating.</a> Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).</li>
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<li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+hepatic+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+to+increasing+palmitate+concentrations+in+piglets%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Neonate%22%5BJournal%5D)">Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets.</a> Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).</li>
<li>Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+rat+and+human+tissues.+Effect+of+nutritional+state%2C+clofibrate+treatment+and+postnatal+development+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).</li>
<li>Hakvoort, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interorgan+coordination+of+the+murine+adaptive+response+to+fasting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).</li>
<li>Sokolovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptomic+signature+of+fasting+murine+liver%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The transcriptomic signature of fasting murine liver.</a> BMC Genomics. 9, 528(2008).</li>
<li>Kersten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+mediates+the+adaptive+response+to+fasting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).</li>
<li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li>
<li>Ng, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Primary+Rat+Hepatocytes+with+Multiparameter+Perfusion+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289(2021).</li>
<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917(2012).</li>
<li>Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+metformin+on+fatty+acid+and+glucose+metabolism+in+freshly+isolated+hepatocytes+and+on+specific+gene+expression+in+cultured+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes.</a> Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).</li>
<li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).</li>
<li>Bougarne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARalpha+blocks+glucocorticoid+receptor+alpha-mediated+transactivation+but+cooperates+with+the+activated+glucocorticoid+receptor+alpha+for+transrepression+on+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).</li>
<li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507(2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Während der Leberdurchblutung ist es wichtig, die Einführung von Luftblasen zu vermeiden, da sie die Mikrokapillaren in der Leber blockieren, die Pufferzirkulation verhindern oder einschränken und insgesamt die Hepatozytenausbeute und Lebensfähigkeit verringern20,21. Vorsichtsmaßnahmen, wie die genaue Inspektion der mit Puffern gefüllten Einlassleitung vor der Kanülierung des IVC und das Vermeiden des Abhebens der Einlassleitung von dem Rohr, das Puffer 1 enthält...

Fettsäure-β-Oxidation ist ein essentieller Prozess im Fettstoffwechsel und bietet einen katabolen Weg, um die Fettsäuresynthese und -aufnahme aus der Nahrung auszugleichen. Dieser Prozess erzeugt Energie für mehrere Organe, einschließlich des Herzmuskels, der Nierenrinde und der nüchternen Leber, und verwendet Fettsäuren, die aus der Nahrung, der Fettgewebelipolyse und den internen Triglyceridspeicherngewonnen werden 1,2.
Die Oxidation von Fettsäuren durch den β-Oxidationsweg führt zur sequentiellen Verkürzung der Fettacylkette um zwei Kohlenstoffe gleichzeitig, die als Acetyl-CoA freigesetzt werden, und dieser Prozess findet sowohl in den Mitochondrien als auch in den Peroxisomen statt. Während die meisten Fettsäuren nur einer β-Oxidation unterzogen werden, werden einige an verschiedenen Kohlenstoffen oxidiert, bevor sie in diesen Weg eintreten. Zum Beispiel werden 3-methylsubstituierte Fettsäuren, wie Phytansäure, durch α-Oxidation in den Peroxisomen entfernt, bevor sie in den β-Oxidationsweg eintreten. Ebenso werden einige Fettsäuren zunächst durch Oxidation der terminalen Methylgruppe (ω-Oxidation) im endoplasmatischen Retikulum in Dicarbonsäuren umgewandelt, bevor sie in den Peroxisomen durch β-Oxidation bevorzugt oxidiertwerden 3.
Unabhängig von der spezifischen Organelle muss eine Fettsäure zunächst in einen Coenzym A (CoA)-Thioester oder Acyl-CoA umgewandelt werden, um über den β-Oxidationsweg oxidiert zu werden. β-Oxidation von langkettigen Acyl-CoAs in der mitochondrialen Matrix benötigt das Carnitin-Shuttle für ihre Translokation, wobei Carnitin-Palmitoyltransferase 1 (CPT1) die Umwandlung von Acyl-CoAs in Acylcarnitine katalysiert und das geschwindigkeitsbegrenzende Enzym in diesem Prozessist 4. Nach der Translokation in die mitochondriale Matrix werden die Acyl-CoAs neu geformt und dienen als Substrate für die mitochondriale β-Oxidationsmaschinerie. Im nüchternen Zustand wird das durch β-Oxidation in den hepatischen Mitochondrien erzeugte Acetyl-CoA hauptsächlich zur Ketogenese geleitet. Peroxisomen dienen als primärer Ort für die β-Oxidation von sehr langkettigen, verzweigtkettigen und dicarbonsäurehaltigen Fettsäuren. Peroxisomen benötigen das Carnitin-Shuttle nicht, um Fettsäuresubstrate zu importieren, sondern importieren die entsprechenden Acyl-CoAs durch die Aktivität der ATP-bindenden Kassettentransporter (ABC) ABCD1-35. Innerhalb der Peroxisomen werden Acyl-CoAs dann durch einen speziellen Satz von Enzymen oxidiert, die sich von der mitochondrialen Fettsäure- β-Oxidationsmaschine unterscheiden. Sowohl Mitochondrien als auch Peroxisomen benötigen auch eine Zufuhr von NAD+ und freiem CoA, um Fettacylketten zu oxidieren. Es wurde gezeigt, dass der CoA-Spiegel in der Leber als Reaktion auf das Fasten ansteigt, was die erhöhte Rate der Fettsäureoxidation unterstützt, die in diesem Zustand auftritt6. Darüber hinaus führt ein erhöhter CoA-Abbau in den Peroxisosomen zu einer selektiven Abnahme der peroxisomalen Fettsäureoxidation7. Daher wird der Prozess der Fettsäureoxidation innerhalb der Zelle durch die Expressionsniveaus und Aktivitäten von Enzymen reguliert, die an der Aktivierung, dem Transport und der Oxidation von Fettsäuren beteiligt sind, sowie durch die Konzentrationen von Cofaktoren und anderen Metaboliten in mehreren subzellulären Kompartimenten.
Verfahren, bei denen Gewebehomogenate zur Messung der Fettsäureoxidation verwendet werden, zerstören die zelluläre Architektur, die diesen Prozess reguliert und unterstützt, was zu einer Sammlung von Daten führt, die den In-vivo-Stoffwechsel nicht genau widerspiegeln. Während Techniken, die plattierte primäre Hepatozyten verwenden, dieses System erhalten, führt die Kultivierung isolierter Zellen über längere Zeiträume zu einem Verlust des In-vivo-Genexpressionsprofils, das in den Zellen vorhanden war, als sie noch im Tier lebten 8,9. Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Isolierung primärer Hepatozyten und zur Bestimmung ihrer Fettsäure- β-Oxidationskapazität unmittelbar nach der Isolierung und in Suspension unter Verwendung von [1-14C]Palmitinsäure. Der Assay basiert auf der Messung der Radioaktivität, die mit den säurelöslichen Metaboliten (ASM) oder Produkten wie Acetyl-CoA assoziiert ist, die durch die β-Oxidationvon [1-14 C]palmitinsäure10,11 erzeugt werden.

<table><tbody><tr><td>(R)-(+)-Etomoxir-Natriumsalz</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4539/10</td><td></td></tr><tr><td>[1-14C]-Palmitinsäure, 50&ndash; 60 mCi/mmol, 0,5 mCi/mL</td><td>Amerikanische radioaktiv markierte Chemikalien</td><td>ARC 0172A</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES, steril</td><td>Corning</td><td>25060CI</td><td></td></tr><tr><td>10 & Mikro; L Einwegkapillaren/-kolben für Verdrängerpipette</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008604</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L, 200 & Mikro; L und 10 &micro; L-Pipetten und -Spitzen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml, 10 mL und 25 mL serologische Pipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL sterile Zentrifugenröhrchen</td><td>CellTreat</td><td>229421</td><td></td></tr><tr><td>70 % Perchlorsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A2296-1LB</td><td></td></tr><tr><td>BSA, fettsäurefrei</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9704100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 Dihydrat</td><td>MilliporeSigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Gold Biotechnologie</td><td>E-217</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco</td><td>111000200CSPP</td><td></td></tr><tr><td>Filtersystem, 0,22 &mu; m PES-Filter, 500 ml, steril</td><td>CellTreat</td><td>229707</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicinsulfat</td><td>Gold Biotechnology</td><td>G-400-25</td><td></td></tr><tr><td>HDPE, 6,5 mL Szintillationsfläschchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-342-3</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injektionsnadeln 22 G, 1,5 Zoll</td><td>BD Biosciences</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>VetOne</td><td></td><td></td>502017</tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>MilliporeSigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM Research Grade</td><td>MilliporeSigma</td><td>5401119001</td><td>Definierte Mischung aus gereinigter Kollagenase I und II mit einer mittleren Konzentration von Thermolysin</td></tr><tr><td>M199 Medium</td><td>MilliporeSigma</td><td>M5017</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 Heptahydrat</td><td>MilliporeSigma</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>accuSpin Micro 17</td></tr><tr><td>Mikrodisparierschere</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument Co</td><td>RS-5980</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Chem-Impex International</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td>424270010</tr><tr><td>Palmitinsäure</td><td>MilliporeSigma</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Direktverdrängerpipette MR-10, 10 & micro; L</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008575</td><td></td></tr><tr><td>Kühlzentrifuge mit Einsätzen für konische 50-ml-Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>5810 R</td></tr><tr><td>Reagenzgläser aus Polypropylen-Kultur mit rundem Boden und 14 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-9A</td><td></td></tr><tr><td>Szintillationszähler</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>TriCarb 4810 TR</td></tr><tr><td>ScintiVerse BD Cocktail</td><td>Fisher Scientific</td><td>SX18-4</td><td></td></tr><tr><td>Schüttelwasserbad, 30 L Fassungsvermögen</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>&nbsp; Modell G76</td></tr><tr><td>Sterile Zellsiebe, 100 & Mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Daumenverbandzange</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument Co</td><td>RS-8120</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe mit variablem Durchfluss</td><td>Fisher Scientific</td><td>138762</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbäder, 2&ndash; 2,5 l Fassungsvermögen</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

messung der fettsäure-β-oxidation in einer suspension frisch isolierter maus-hepatozyten

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Die Fettsäure-β-Oxidation ist ein wichtiger Stoffwechselweg, um den Energiebedarf der Leber zu decken und Substrate und Cofaktoren für zusätzliche Prozesse wie Ketogenese und Glukoneogenese bereitzustellen, die für die Aufrechterhaltung der Ganzkörper-Glukosehomöostase unerlässlich sind und die extrahepatische Organfunktion im nüchternen Zustand unterstützen. Die Fettsäure-β-Oxidation erfolgt in den Mitochondrien und Peroxisomen und wird durch mehrere Mechanismen reguliert, einschließlich der Aufnahme und Aktivierung von Fettsäuren, der Enzymexpression und der Verfügbarkeit von Cofaktoren wie Coenzym A und NAD +. In Assays, die die Fettsäure-β-Oxidation in Leberhomogenaten messen, maskieren die Zelllyse und die übliche Zugabe supraphysiologischer Cofaktorenspiegel die Auswirkungen dieser Regulationsmechanismen. Darüber hinaus ist die Integrität der Organellen in den Homogenaten schwer zu kontrollieren und kann zwischen den Präparaten erheblich variieren. Die Messung der Fettsäure- β-Oxidation in intakten primären Hepatozyten überwindet die oben genannten Fallstricke. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Messung der Fettsäure-β-Oxidation in einer Suspension frisch isolierter primärer Maushepatozyten, die mit 14C-markierter Palmitinsäure inkubiert wurden. Durch die Vermeidung von Stunden bis Tagen der Kultur hat diese Methode den Vorteil, dass die Proteinexpressionsniveaus und die Stoffwechselwegaktivität der ursprünglichen Leber besser erhalten bleiben, einschließlich der Aktivierung der Fettsäure-β-Oxidation, die in Hepatozyten beobachtet wird, die von nüchternen Mäusen isoliert wurden, verglichen mit gefütterten Mäusen.

Die hier beschriebene Leberperfusion ergibt typischerweise 30-40 Millionen Zellen / Leber mit einer durchschnittlichen Lebensfähigkeit von 80%, wie durch den Trypanblau-Ausschluss geschätzt (Abbildung 2). Die typische Konzentration von Glucose im Krebs-Henseleit-Puffer (KHB), der zur Herstellung der Perfusionspuffer 1 und 2 verwendet wird, beträgt 11 mM. Bei der Messung der Fettsäure-β-Oxidation in Hepatozyten, die von gefasteten Mäusen isoliert wurden, kann die Glukosekonzentration im KHB g...

Fettsäure-β-Oxidation ist ein essentieller Stoffwechselweg, der für die Energieerzeugung in vielen verschiedenen Zelltypen, einschließlich Hepatozyten, verantwortlich ist. Hier beschreiben wir eine Methode zur Messung der Fettsäure-β-Oxidation in frisch isolierten primären Hepatozyten unter Verwendung von 14C-markierter Palmitinsäure.

Messung der Fettsäure-β-Oxidation in einer Suspension frisch isolierter Maus-Hepatozyten

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um eine robuste Methode zur Messung der gesamten mitochondrialen und peroxisomalen Fettsäure-Beta-Oxidation in primären Maus-Hepatozyten bereitzustellen. Die Verwendung intakter Zellen erhält die Integrität der Organellen und die vorhandenen Regulationsmechanismen. Darüber hinaus minimiert die Untersuchung frisch isolierter Hepatozyten Veränderungen in der Genexpression in Bezug auf die Ursprungsleber.Die Operation kann eine Herausforderung sein. Du musst selbstbewusst, fleißig und konzentriert sein. Sobald die Kanülierung erfolgreich ist, versuchen Sie sich zu entspannen, aber achten Sie darauf und überwachen Sie die Qualität der Perfusion.Um das Verfahren zu beginnen, besprühen Sie den Bauch und die Brust der betäubten Maus großzügig mit 70% Ethanol. Verwenden Sie dann die Pinzette, um die Haut und die Bauchdecke in der Nähe der Bauchbasis hochzuziehen und seitlich auf beiden Seiten der Mittellinie und bis zum Zwerchfell zu schneiden, um die Organe freizulegen. Legen Sie die untere Hohlvene oder IVC frei, indem Sie den Darm auf die rechte Seite bewegen und die Leberlappen vorsichtig nach oben drehen.Führen Sie einen kleinen zylindrischen Gegenstand, z. B. eine Nadelkappe, unter den Rücken der Maus ein, um den IVC leicht zu neigen und die Kanülierung zu erleichtern. Nachdem Sie die Pumpe mit Puffer eins bei der niedrigsten Drehzahl gestartet haben, führen Sie die Nadel in den IVC ein. Schneiden Sie dann die Pfortader ab, um den Druck zu verringern und die Drainage von Blut und Perfusionspuffern zu ermöglichen.Vor der Erhöhung der Durchflussrate auf sieben ml pro Minute. Durchbluten Sie die Leber mit warmem Puffer eins und stellen Sie sicher, dass die in das Röhrchen, das Puffer eins enthält, eingeführte Leitung kontinuierlich untergetaucht bleibt, um die Einführung von Luftblasen zu vermeiden. Während die Perfusion stattfindet, fügen Sie 130 Mikroliter Kollagenaselösung hinzu, um zwei zu puffern, und mischen Sie durch Pipettieren mit einer serologischen Pipette.Wenn das Volumen in dem Röhrchen, das Puffer eins enthält, auf etwa fünf ml abnimmt, fügen Sie langsam fünf ml Puffer zwei hinzu, um einen durch Pipettieren an der Seite des Rohres zu puffern. Wiederholen Sie den Zusatz zweimal, bevor Sie den verbleibenden Puffer zwei in die Röhre geben. Stoppen Sie die Perfusion, wenn etwa 5 bis 10 ml Puffer zwei in der Röhre verbleiben.Dann entfernen Sie die Leber und geben Sie sie in die 100-ml-Kulturschale, die 20 ml eiskalten Puffer zwei enthält. Unter der laminaren Durchflusshaube wird das Lebergewebe mit chirurgischer Schere und Pinzette vorsichtig auseinander gebrochen. Als nächstes fügen Sie etwa 20 ml eiskalten M199-Puffer zur Hepatozytensuspension hinzu und filtern Sie sie durch ein 100-Mikron-Zellsieb mit dem Kolben einer Spritze, um die Freisetzung zusätzlicher Hepatozyten aus den größeren Leberstücken sanft zu fördern.Waschen Sie die 100-ml-Kulturschale und das Zellsieb mit M199-Puffer, um die Zellsuspension zu sammeln, bis das Auffangrohr voll ist. Dann zentrigieren Sie die Suspension bei 50 x g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Saugen Sie den Überstand ab, bevor Sie das Hepatozytenpellet in 30 ml kaltem M199 durch Wirbeln wieder suspendieren.Wiederholen Sie die Wäsche einmal. Tauen Sie die Palmitinsäure- und Rinderserumalbumin- oder BSA-Lösungen auf, bevor Sie die Substratmischung für mehrere Reaktionen vorbereiten. Aliquot 13,5 Mikroliter BSA-Lösung pro Reaktion in einem Mikrozentrifugenröhrchen.Nachdem Sie das Röhrchen auf 41 Grad Celsius erwärmt haben, fügen Sie einen Mikroliter der 200 mM Palmitinsäurelösung pro Reaktion hinzu. Wirbeln Sie die Röhre vor und während der Inkubation bei 41 Grad Celsius für 20 bis 30 Minuten kräftig auf, um die Bildung des löslichen Palmitinsäure-BSA-Komplexes zu erleichtern. Während dieser Zeit werden 133 Mikroliter 1 M Perchlorsäure aliquot, die verwendet werden, um die Reaktionen in separaten 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu stoppen.Vor Beginn der Reaktionen aliquotieren und inkubieren 485,5 Mikroliter M199-Puffer pro Reaktion in ein Röhrchen bei 37 Grad Celsius, um den hergestellten radioaktiven BSA-Palmitinsäure-Komplex zu verdünnen. Als nächstes geben Sie 750 Mikroliter M199 mit oder ohne Inhibitoren in den separaten 14-ml-Rundbodenröhrchen als Proben ab. Während der Hepatozytenwaschschritte, 10 bis 15 Minuten vor Beginn der Reaktionen, geben Sie die Röhrchen in ein Schüttelwasserbad, das auf 37 Grad Celsius bei 180 bis 200 Umdrehungen pro Minute eingestellt ist.Wenn die Lebensfähigkeit der Hepatozyten mindestens 75% beträgt, ist die Herstellung der Substratmischung abgeschlossen, indem 0,8 Mikroliter Kohlenstoff-14-Palmitinsäure pro Reaktion auf das Mikrozentrifugenröhrchen mit der geklärten BSA-Palmitinsäurelösung übertragen werden. Vortex, bevor die Röhre bei 41 Grad Celsius in das Wasserbad zurückgebracht wird. Unmittelbar nach der endgültigen Hepatozytenresuspension, 750 Mikroliter der Hepatozytenssuspension mit einer Ein-ml-Pipette auf jedes der 14-ml-Rundbodenrohre im Schüttelwasserbad übertragen und die Röhrchen kurz mit niedriger Geschwindigkeit umdrehen, bevor sie in einen Inkubator überführt werden, wobei jede Zugabe um 30 Sekunden gestaffelt wird.Übertragen Sie ein separates Aliquot von Hepatozyten auf ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, um es fünf Minuten lang bei 3000 x g zu drehen. Entfernen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet bei minus 80 Grad Celsius lagern, um die Gesamtmenge an Protein in der Probe zu messen, um die Ergebnisse zu normalisieren. Während sich die Hepatozyten bei 37 Grad Celsius unter Vorinkubation befinden, fügen Sie den radioaktiven BSA-Palmitinsäure-Komplex in das warme Medium hinzu, um bei 37 Grad Celsius zu bleiben, bis Sie bereit sind, die Reaktionen zu starten.Um die Reaktionen zu starten, entfernen Sie die Hepatozyten aus dem Wasserbad und fügen Sie 500 Mikroliter der Substratmischung zu den Hepatozyten hinzu. Wirbeln Sie die Zellen fünf Sekunden lang mit niedriger Geschwindigkeit auf, bevor Sie zum Wasserbad zurückkehren, um 15 Minuten lang zu inkubieren. Starten Sie eine Reihe von Reaktionen und stoppen Sie sofort, um die Hintergrundradioaktivität zu bestimmen.Übertragen und reservieren Sie die doppelten Aliquots von 200 bis 250 Mikrolitern der übrig gebliebenen Substratmischung in 6-ml-Szintillationsfläschchen, um die Zählung durchzuführen. Um die Reaktionen zu stoppen, entfernen Sie die Hepatozyten aus dem Wasserbad, um sie durch Vortexen mit moderater Geschwindigkeit zu resuspendieren, und übertragen Sie dann 400 Mikroliter der Hepatozytenssuspension auf die Mikrozentrifugenröhrchen, die Perchlorsäure enthalten. Verschließen und wirbeln Sie sofort die Röhrchen, bevor Sie die Sequenz für alle Proben wiederholen und um 30 Sekunden taumeln.Nachdem Sie die 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen bei 13.000 x g für 10 Minuten gedreht haben, übertragen Sie 300 Mikroliter des Überstands auf eine 6-ml-Szintillationsdurchstechflasche und fügen Sie 4 ml der Szintillationsflüssigkeit hinzu, um die Radioaktivität in den Proben und die Substratmischung Aliquots in einem Szintillationszähler zu zählen. In der Studie ergab die Leberdurchblutung 30 bis 40 Millionen Zellen pro Leber, mit einer durchschnittlichen Lebensfähigkeit von 80%Es wurde auch beobachtet, dass eine Senkung der Glukosekonzentration in der Fastengruppe keinen negativen Einfluss auf die Ausbeute oder Lebensfähigkeit der Hepatozyten hatte. Die Hepatozytensuspension, die aus gefütterten und gefasteten männlichen Mäusen isoliert wurde, wurde auf die Betaoxidationskapazität von Fettsäuren in Gegenwart und Abwesenheit von Etomoxir, einem starken Inhibitor von CPT1 und mitochondrialer Fettsäureoxidation, untersucht.Die Zählungen pro Minute oder CPM, die mit der Hintergrundradioaktivität verbunden sind, variieren mit der Charge von Palmitinsäure. Der CPM war jedoch immer noch deutlich niedriger als die mit der Substratmischung inkubierten Proben. Die aus den nüchternen Mäusen isolierten Hepatozyten zeigen einen robusten Anstieg der Raten sowohl der mitochondrialen als auch der peroxisomalen Fettsäure-Beta-Oxidation.Die Daten wurden weiter untersucht, um die Rate zu bestimmen, mit der Palmitinsäure in den Hepatozyten, die aus den gefütterten und gefasteten Mäusen isoliert wurden, oxidiert wird. Verhindern Sie, dass Blasen in die Linie gelangen. Halten Sie die Nadel während der Perfusion konstant.Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit den Hepatozyten. Halten Sie sie in der Schwebe, wenn Sie sie abgeben. Die aus diesem Verfahren isolierten Hepatozyten können als Suspension verwendet werden, um andere Stoffwechselwege wie die Fettsäuresynthese zu untersuchen, oder sie können für Zellkulturexperimente plattiert werden.

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Biochemie

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