Name: Direkte Reprogrammierung von Mausfibroblasten in Melanozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Erfahren Sie die direkte Reprogrammierung von Mausfibroblasten zu funktionalen Melanozyten mit nur drei Transkriptionsfaktoren. Diese optimierte Methode bietet höhere Effizienz und Stabilität für regenerative Therapien.

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Diese Studie wurde teilweise durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (82070638 und 81770621) und der Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20180281) unterstützt.

Diese Arbeit wurde vom Laboratory Animal Management and Use Committee an der Jiangsu University (UJS-IACUC-AP--20190305010) genehmigt. Die Experimente wurden in strikter Übereinstimmung mit den Standards durchgeführt, die von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International) festgelegt wurden. Es gab keine Experimente mit Menschen, so dass diese Arbeit keine Genehmigung der Ethikkommission für Humanforschung benötigte. Weitere Informationen zu Reagenzien finden Sie in der Materialtabelle .
1. Aufbau eines konzentrierten Lentivirus-Verpackungssystems für Transkriptionsfaktoren
<ol><li>Produktion des konzentrierten Virus (Abbildung 1A, B)<ol>
<li>Platte 1,5 × 106 HEK-293T-Zellen in eine 60 mm Schale und Kultur dieser Zellen mit normalem Medium (siehe Tabelle 1) bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2. HINWEIS: Wenn das Virus in Chargen verpackt werden muss, kann eine 100-mm-Zellkulturschale verwendet werden (Details siehe Tabelle 2).</li>
		<li>Stellen Sie nach 24 h sicher, dass die HEK-293T-Zellen am Tag der Transduktion einen Konfluenz von 80-90% erreicht haben, und ersetzen Sie das Medium durch 3,5 ml DMEM (150 μL DMEM pro 1 cm2). Lassen Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für2 h. HINWEIS: Das Ersatzmedium muss serumfrei sein, damit die Zellen für eine bessere Plasmidtransfektion "ausgehungert" werden können.</li>
		<li>Herstellen der Mischung von Plasmiden (Mischung A), die 3 μg der Zielplasmide von Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 oder Snai2 enthält; 1 μg des Verpackungsplasmids PMD2. G und 2 μg des Verpackungsplasmids PSPAX2. Machen Sie das Volumen von Mix A bis 150 μL mit serumfreiem DMEM aus. Bereiten Sie die Mischung des Transfektionsreagenzes (Mischung B) durch Zugabe von 12 μL des Transfektionsreagenzes vor (das Volumen ist doppelt so groß wie die Gesamtmasse aller Plasmide) und machen Sie das Volumen von Mischung B bis 150 μL mit serumfreiem DMEM aus. HINWEIS: Bei der Zubereitung der Mischungen ist es wichtig, Flüssigkeit langsam hinzuzufügen, um Luftblasen zu vermeiden.</li>
		<li>Kombinieren Sie Mix A und Mix B, nachdem Sie sie 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen haben. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 20-30 Minuten, um den Transfektionskomplex zu bilden.</li>
		<li>Nehmen Sie die HEK-293T-Zellen aus dem Inkubator, ersetzen Sie das Medium durch DMEM + 2% FBS, fügen Sie die Mischung aus Schritt 1.1.4 tropfenweise hinzu und mischen Sie die Flüssigkeit vorsichtig.</li>
		<li>Nach 8 h wechseln Sie das Medium mit 3,5 ml normalem Medium. Nach dem Wechseln des Mediums sammeln Sie den Virusüberstand alle 24 h und 48 h.</li>
		<li>Mischen Sie die Virusüberstände, die zu zwei verschiedenen Zeitpunkten gesammelt wurden. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min bei 4 °C. Führen Sie den Überstand durch 0,45-μm-Filter und sammeln Sie ihn in einem sterilen 50-ml-Konusrohr. HINWEIS: Das bei 24 h gesammelte Virus kann bei 4 °C gelagert und mit dem um 48 h gesammelten Virus gemischt werden.</li>
		<li>Konzentrieren Sie den Virusüberstand durch Zentrifugieren bei 6000 × g bei 4 °C über Nacht (~16 h). Stellen Sie sicher, dass das Viruspellet nach dem Zentrifugieren am Boden des konischen Röhrchens sichtbar ist.</li>
		<li>Gießen Sie den Überstand langsam aus. Lösen Sie das Viruspellet in einem Volumen des normalen Mediums auf, das 1/100 des Volumensdes Virusüberstands beträgt. Mit einer P1000-Mikropipette vorsichtig auf und ab pipettieren, bis eine homogene Mischung erhalten wird. Teilen Sie das konzentrierte Virus nach Bedarf in Mikrozentrifugenröhrchen auf. Bei −80 °C lagern. HINWEIS: Das Virus wird mit dieser Methode 100x konzentriert. Das konzentrierte Virus (100x) kann >1 Jahr bei −80 °C gelagert werden. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen des Virus.</li>
	</ol></li>
	<li>Nachweis des konzentrierten Virustiters (Abbildung 1C)<ol>
<li>Platte 1 × 10 5 HEK-293T-Zellen in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. Denken Sie daran, eine gut als Negativkontrolle hinzuzufügen. Kultivieren Sie diese Zellen mit normalem Medium bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2.</li>
		<li>0,1 μL oder 0,2 μL fluoreszierendes konzentriertes Virus (100x) zu jeder Vertiefung nach 24 h hinzufügen und 4 ng/μL des kationischen polymeren Transfektionsreagenzes zu jeder Vertiefung hinzufügen. Etwa 8-12 h nach der Infektion das Medium durch normales Medium ersetzen. HINWEIS: Um die Genauigkeit und Effizienz der Fluoreszenzerkennung zu gewährleisten, muss die Infektionsrate 10-30% betragen. Die Zugabe von 0,1 μL oder 0,2 μL des fluoreszierenden konzentrierten Virus kann die Infektionseffizienz in diesem Bereich aufrechterhalten. Der konzentrierte Virustiter kann mindestens 1 × 108 Transduziereinheiten (TU)/ml erreichen.</li>
		<li>Waschen Sie das Geschirr etwa 48 Stunden nach der Infektion mit 1 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um abgestorbene Zellen zu entfernen.</li>
		<li>Trypsinisieren Sie diese Zellen mit 250 μL 0,05% Trypsin-EDTA pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte für 1 min bei Raumtemperatur. Bei 200 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und dann den Überstand entfernen.</li>
		<li>Resuspendiert das Zellpellet in 1 ml PBS, fügt die Suspension zu einem 5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen hinzu und erkennt die Infektionseffizienz der Virusfluoreszenz (grün fluoreszierendes Protein, GFP +) mittels Durchflusszytometrie.</li>
		<li>Berechnen Sie den konzentrierten Virustiter nach folgender Formel: 105 (Zellvolumen) × Infektionsrate (GFP+%)/hinzugefügtes Virusvolumen (0,1 μL oder 0,2 μL).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Direkte Reprogrammierung von Fibroblasten auf Melanozyten (Abbildung 2A)
<ol><li>Beschichten Sie eine Vertiefung einer 6-Well-Zellkulturplatte mit 1 ml 0,1% iger Gelatinelösung bei Raumtemperatur für 15-30 min. Stellen Sie sicher, dass der Brunnen vollständig mit der 0,1% igen Gelatinelösung bedeckt ist. Saugen Sie die 0,1% ige Gelatinelösung nach dem Überziehen ab. HINWEIS: Bereiten Sie 0,1% ige Gelatinelösung (100 ml) wie folgt vor: 0,1 g Gelatinepulver werden in 100 ml Reinstwasser in einer Autoklavglasflasche gelöst und dann bei 4 °C für nicht mehr als 2 Monate gelagert.</li>
	<li>Platte 5 × 104 MEFs in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte, die mit0,1% Gelatine beschichtet ist (wie in Schritt 2.1), und diese Zellen mit normalem Medium bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 über Nacht kultivieren.</li>
	<li>Bestätigen Sie nach 24 h, dass die MEFs einen Zusammenfluss von 40-50% erreicht haben. Ersetzen Sie das Medium durch ein normales Medium.</li>
	<li>Nehmen Sie am Tag 0 das konzentrierte Virus aus dem Gefrierschrank und schmelzen Sie das Virus auf Eis. Berechnen Sie das Volumen des hinzuzufügenden Virus anhand von Gl. (1). Fügen Sie das konzentrierte Virus für die sechs Transkriptionsfaktoren Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 und Snai2 (siehe Materialtabelle) entsprechend dem berechneten Volumen zu jeder Vertiefung hinzu und fügen Sie dann 4 μg / ml des kationischen polymeren Transfektionsmittels hinzu. Zellzahl (5 × 104) × 30 (Multiplizität der Infektion, MOI)/Virustiter (1)</li>
	<li>Entfernen Sie am Tag 1, 8-12 h nach der Infektion, das Medium, das das Virus enthält, und ersetzen Sie es durch frisches normales Medium, während Sie 0,5 μg / ml Puromycin hinzufügen, um stabile infizierte Zelllinien zu screenen.</li>
	<li>Ersetzen Sie am Tag 2, 48 h nach der Infektion, das überstehende Medium schrittweise durch das Umprogrammierungsmedium. Ändern Sie zunächst 1/4des gesamten mittleren Volumens und addieren Sie 3 μM CHIR99021.</li>
	<li>Wechseln Sie von Tag 3 bis Tag 7 je nach Zustand der Zellen das Medium, indem Sie das Reprogrammiermedium schrittweise durch einen höheren Anteil des Reprogrammiermediums (siehe Tabelle 1) ersetzen, und wechseln Sie innerhalb von 5 Tagen zum vollständigen Reprogrammiermedium. HINWEIS: Während dieser Zeit müssen Puromycin und CHIR99021 täglich angewendet werden. Viele tote Zellen erscheinen am ersten und zweiten Tag des Wechsels des Reprogrammiermediums. Dies ist normal, da sich die Zellen allmählich an die Transformation anpassen. Daher muss das Medium schrittweise gewechselt werden, um die gesunde Proliferation der Zellen zu gewährleisten.</li>
	<li>Um die Zellen zu passieren, fügen Sie 500 μL 0,05% Trypsin-EDTA hinzu, um die Zellen für 3 Minuten bei Raumtemperatur zu verdauen. Wenn ~ 60% der Zellen aufgewachsen sind, stoppen Sie die Verdauung, indem Sie normales Medium hinzufügen, das 2x das Volumen des Verdauungsenzyms beträgt. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15 ml sterilen konischen Röhrchen, zentrifugieren Sie bei 200 × g für 5 min bei 4 °C, entfernen Sie den Überstand, suspendieren Sie das Zellpellet mit dem Reprogrammiermedium und plattieren Sie die Zellen in einer 60 mm sterilen Schale mit einer Dichte von 3 × 104/cm2. Kultivieren Sie diese Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten 5%igenCO2-Inkubator. HINWEIS: Von Tag 8 bis Tag 21 werden diese Zellen alle 3-5 Tage subkultiviert und in 60 mm sterilen Schalen kultiviert, um sich auszudehnen. Sie können kultiviert werden, um mindestens Passage 5 zu erreichen.</li>
</ol>3. Optimierung zur direkten Reprogrammierung und Identifikation
<ol><li>Screening auf die optimierten Transkriptionsfaktoren<ol>
<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.7, und reduzieren Sie jedes Mal einen der sechs Transkriptionsfaktoren. Infizieren Sie die MEFs mit dem Virus mit Kombinationen von fünf Transkriptionsfaktoren.</li>
		<li>Sieben Tage nach der Infektion extrahieren Sie die RNA dieser Zellen16 und analysieren Sie die Expressionsniveaus ihrer melanozytären Gene mit Reverse-Transkription PCR (RT-PCR)17 , um nach den Transkriptionsfaktoren mit dem größten Einfluss auf die Umwandlung in Melanozyten zu suchen, indem Sie sie nacheinander entfernen (Abbildung 3A).</li>
		<li>Verwenden Sie die drei wichtigsten Transkriptionsfaktoren, die die Umwandlung in Melanozyten beeinflussen, um die MEFs zu infizieren. Wiederholen Sie die Schritte 2.1 bis 2.7. HINWEIS: Sieben Tage nach der Infektion sollten die melanozytären Gene in diesen transformierten Zellen nachweisbar sein (Abbildung 3B). Primer-Informationen für die iMels-Charakterisierung sind in Tabelle 3 enthalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Identifizierung induzierter Melanozyten (iMels)<ol>
<li>Verwenden Sie die Immunfluoreszenzfärbung18 , um zu überprüfen, ob die iMels melanozytäre Proteine, einschließlich TYRP-1 und DCT, exprimieren (Abbildung 4A).</li>
		<li>Melanin-spezifische 3,4-Dihydroxyphenylalanin (DOPA)-Färbung (Abbildung 4B)<ol>
<li>4% Paraformaldehyd (10 ml) wie folgt herstellen: 0,4 g Paraformaldehydpulver in 10 mL PBS auflösen. Stellen Sie die Lösung 2 h lang in einen Ofen bei 56 °C, um die Auflösung zu fördern. HINWEIS: Die Lösung kann nicht länger als einen Monat bei 4 °C gehalten werden.</li>
			<li>Die iMels in einer 30 mm Schüssel anfassen und zweimal mit vorgewärmtem PBS abwaschen. Fügen Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd hinzu, um die Zellen für 20 min zu fixieren, und waschen Sie die Schüssel 3 Mal mit PBS.</li>
			<li>Bereiten Sie 0,1% DOPA-Färbungslösung (10 ml) kurz vor Gebrauch vor, indem Sie 0,01 g L-DOPA-Pulver in 10 ml PBS auflösen. Legen Sie die Lösung für 30 min in ein Wasserbad bei 37 ° C; Schütteln Sie es mehrmals, um die Auflösung zu fördern.</li>
			<li>Fügen Sie 1 ml frisch zubereitete 0,1% DOPA-Färbelösung hinzu. In einem Ofen bei 37 °C für 2-5 h inkubieren. Wenn keine braun-schwarzen Partikel vorhanden sind, inkubieren Sie bei 37 °C für weitere 2 h, jedoch nicht für >5 h. Überprüfen Sie die Proben alle 30 Minuten.</li>
			<li>Waschen Sie das Geschirr 3 Mal mit PBS für jeweils 1 Minute. Färben Sie den Kern mit 1 ml Hämatoxylin-Färbelösung für 2 min.</li>
			<li>Für die Langzeitlagerung dehydrieren Sie die Proben mit 95% Ethanol für 3 min und dann 100% Ethanol für 5 min. Verschließen Sie die Schale mit Xylol und neutralem Balsam.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Melanin-spezifische Masson-Fontana-Färbung (Abbildung 4B)<ol>
<li>Platte iMels in einer 30 mm Schale und fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 20 min; Waschen Sie das Geschirr 3 Mal mit PBS.</li>
			<li>Fügen Sie 1 ml Lösung A (Ammoniaksilberlösung) aus dem Masson-Fontana-Färbeset hinzu (siehe Materialtabelle), legen Sie die Schale in eine dunkle Schachtel und stellen Sie die dunkle Box für 15-40 min in einen Ofen bei 56 ° C. HINWEIS: Wenn braun-schwarze Partikel nach 15 min im Ofen nicht sichtbar sind, geben Sie die Proben in den 56 ° C-Ofen zurück, um die Inkubation fortzusetzen, jedoch nicht für >40 Minuten. Etwas Wasser kann in die dunkle Box gegeben werden, um ein Austrocknen zu verhindern.</li>
			<li>Aspirationslösung A und das Gericht 5-6 mal mit destilliertem Wasser waschen, jeweils 1-2 min.</li>
			<li>Fügen Sie 1 ml Lösung B (Hypolösung) aus dem Masson-Fontana-Färbeset hinzu und lassen Sie die Schale bei Raumtemperatur für 3-5 Minuten stehen.</li>
			<li>Sauglösung B an und spülen Sie das Geschirr 3 Mal, jeweils 1 min mit Leitungswasser ab.</li>
			<li>Fügen Sie 1 ml Lösung C (neutraler roter Farbstoff) aus dem Masson-Fontana-Färbeset hinzu und lassen Sie die Schale bei Raumtemperatur für 3-5 Minuten stehen.</li>
			<li>Aspirationslösung C und waschen Sie das Gericht 3 Mal mit destilliertem Wasser, jeweils 1 min.</li>
			<li>Fügen Sie 1 ml 100% Ethanol für eine schnelle Dehydratisierung hinzu und saugen Sie das Ethanol nach 3 Minuten ab. HINWEIS: Gebeizte Proben können nach dem Verschließen mit Xylol und neutralem Balsam lange gelagert werden.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitiligo%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Vitiligo.</a> Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).</li>
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<li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse-transcription+PCR+%28RT-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li>
<li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).</li>
<li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die Qualität des Virus ist entscheidend für den Erfolg der direkten Reprogrammierung auf Melanozyten in diesem Protokoll. Die Methode zum Verpacken und Konzentrieren von Viren in diesem Protokoll ist einfach und leicht zu wiederholen und stützt sich nicht auf ein anderes konzentriertes Hilfsreagenz. Dieses Protokoll kann in den meisten Labors erfolgreich befolgt werden. Um die Qualität des konzentrierten Virus zu gewährleisten, bedürfen die folgenden Punkte besonderer Aufmerksamkeit. Einer ist der Zellstatus von HEK-293T...

Vitiligo ist eine Hautkrankheit, die die körperliche und geistige Gesundheit der betroffenen Personen ernsthaft beeinträchtigt. Aus verschiedenen Gründen, einschließlich metabolischer Anomalien, oxidativem Stress, Bildung von Entzündungsmediatoren, Zellablösung und Autoimmunreaktion, gehen die funktionellen Melanozyten verloren und die Sekretion von Melanin wird gestoppt, was zur Entwicklung von Vitiligo 1,2 führt. Dieser Zustand tritt häufig auf und ist besonders problematisch im Gesicht. Die Hauptbehandlung ist die systemische Verwendung von Kortikosteroiden und Immunmodulatoren. Phototherapie kann für systemische oder lokale Krankheiten verwendet werden, und es gibt chirurgische Behandlungen, wie perforierte Hauttransplantation und autologe Melanozytentransplantation 3,4,5. Patienten, die medikamentöse Therapie und Phototherapie anwenden, sind jedoch anfällig für Rückfälle, und diese Behandlungen haben schlechte langfristige therapeutische Wirkungen. Die chirurgische Behandlung ist traumatisch und nur mäßig wirksam 2,6. Daher ist eine neue und wirksame therapeutische Strategie für Vitiligo erforderlich.
Die Reprogrammierung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) kehrt diese Zellen von ihrem terminalen Zustand in einen pluripotenten Zustand um, ein Prozess, der durch die Transkriptionsfaktoren Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc7 vermittelt wird. Aufgrund der Möglichkeit der Tumorigenität und der langen Produktionszeit ist diese Technologie jedoch auf Skepsis gestoßen, wenn sie auf klinische Umgebungen angewendet wird8. Die direkte Reprogrammierung ist eine Technologie, die einen Typ einer Terminalzelle in einen anderen Typ einer Terminalzelleverwandelt 9. Dieser Prozess wird durch geeignete Transkriptionsfaktoren erreicht. Verschiedene Zellen wurden bereits erfolgreich direkt umprogrammiert, darunter Kardiomyozyten10, Neuronen 11 und Cochlea-Haarzellen12. Einige Forscher haben sogar Hautgewebe direkt in situ umprogrammiert, das zur Wundheilung genutzt werden kann13. Zu den Vorteilen einer direkten Reprogrammierung gehören reduzierte Wartezeiten und Kosten, ein geringeres Krebsrisiko, weniger ethische Probleme und ein besseres Verständnis des Mechanismus, der der Bestimmung des Zellschicksals zugrunde liegt9.
Obwohl die direkte Reprogrammierungsmethode weit verbreitet ist, gibt es derzeit keine definitive Methode zur direkten Reprogrammierung von Hautzellen in Melanozyten, insbesondere wegen der zahlreichen Transkriptionsfaktoren, dieals 14,15 zu betrachten sind. Die Transkriptionsfaktoren Mitf, Sox10 und Pax3 wurden zur direkten Reprogrammierung von Hautzellen in Melanozyten14 verwendet. Im Gegensatz dazu wurde die Kombination von MITF, PAX3, SOX2 und SOX9 in einer anderen Studie15 auch für die direkte Reprogrammierung von Hautzellen in menschliche Melanozyten verwendet. In diesem Protokoll wurde trotz der Verwendung einer anderen Screening-Methode das gleiche Ergebnis mit der Kombination von Mitf, Sox10 und Pax3 zur direkten Reprogrammierung von Hautzellen in Melanozyten erzielt, wie zuvorbeschrieben 14. Die Entwicklung eines Systems zur Erzeugung von Melanozyten aus anderen Hautzellen kann ein Schema für die Umwandlung anderer Hautzellen von Vitiligo-Patienten in Melanozyten liefern. Daher ist es entscheidend, eine einfache und effiziente Methode für diese direkte Reprogrammierung zu konstruieren, um Melanozyten erfolgreich zu erzeugen.

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-062</td><td>Gelagert bei -20 &°; C</td></tr><tr><td>0,45 &mu; M Filter</td><td>Millipore</td><td>SLHVR33RB</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Polystyrol Rundbodenröhrchen</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>95%/100% Ethanol</td><td>LANBAO</td><td>210106</td><td>Gelagert bei RT</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A2786</td><td>Stammkonzentration 40 mg/mL Endkonzentration 24 &μm; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Ziege Anti-Maus IgG2a</td><td>Invitrogen</td><td>A21137</td><td>Verdünnung von 1:500 zur Verwendung von</td></tr><tr><td>Antibiotika (Pen/Streptokokken)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Gelagert bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Anti-TRP1/TYRP1 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MABC592</td><td>Wirt/Isotyp: Maus IgG2a Speziesreaktivität: Maus/Mensch Verdünnung von 1:200 zur Verwendung von</td></tr><tr><td>Anti-TRP2/DCT Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab74073</td><td>Wirt/Isotyp: Kaninchen IgG Speziesreaktivität: Maus/Mensch Verdünnung von 1:200 zur Verwendung von</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>Stammkonzentration 10 mM Endgültig Konzentration 3 &mu; M</td></tr><tr><td>Choleratoxin</td><td>Sigma</td><td>C8052</td><td>Stammkonzentration 0,3 mg/ml Endkonzentration 20 pM</td></tr><tr><td>Cy3 Ziege anti-Kaninchen IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-165-144</td><td>Verdünnung von 1:500 zur Verwendung von</td></tr><tr><td>DMEM (hoher Glukose)</td><td>HyClone</td><td>SH30243,01</td><td>Lagerung bei 4 &deg; C</td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Gelagert bei RT</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Gelagert bei -20 &Grad; C Vor Gebrauch hitzeinaktiviert</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>Gelagert bei RT</td></tr><tr><td>GFP-PURO Plasmide (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 und Snai2)</td><td>Hanheng Biological Technology Co., Ltd.</td><td>pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325</td><td>Gelagert bei -20 &Grad; C</td></tr><tr><td>Hämatoxylin</td><td>Abcam</td><td>ab220365</td><td>Gelagert bei RT</td></tr><tr><td>Human EDN3</td><td>American-Peptide</td><td>88-5-10A</td><td>Stammkonzentration 100 &mu; M Endkonzentration 0,1 &mu; M</td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td>Stammkonzentration 100 & Mikro; g/mL Endkonzentration 0,5 &μ; g/mL</td></tr><tr><td>L-DOPA</td><td>Sigma</td><td>D9628</td><td>Gelagert bei RT</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Transfektionsreagenz, gelagert bei 4 &°; C</td></tr><tr><td>Masson-Fontana Färbeset</td><td>Solarbio</td><td>G2032</td><td>Gelagert bei 4 > C</td></tr><tr><td>Neutraler Balsam</td><td>Solarbio</td><td>G8590</td><td>Gelagert bei 4 &Grad; C</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Gelagert bei RT</td></tr><tr><td>PBS (-)</td><td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td>Gelagert bei RT</td></tr><tr><td>Phorbol 12-Myristat-13-acetat (TPA)</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td>Stammkonzentration 1 mM Endkonzentration 200 nM</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>kationisches polymeres Transfektionsreagenz; Bestandskonzentration 8 &mu; g/&micro; L Endkonzentration 4 ng/&micro; L</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td>Gelagert bei -20 &Grad; C</td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>Stammkonzentration 4 &mu; g/mL Endkonzentration 10 ng/ml</td></tr><tr><td>rekombinantes Humaninsulin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I3536</td><td>Stammkonzentration 10 mg/ml Endkonzentration 5 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Rekombinante humane SCF</td><td>R& T & D</td><td>255-SC-010</td><td>Bestandskonzentration 200 &mu; g/mL Endkonzentration 100 ng/mL</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>Gelagert bei 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma</td><td>1330-20-7</td><td>Gelagert bei RT</td></tr></tbody></table>

direkte reprogrammierung von mausfibroblasten in melanozyten

Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

Der Funktionsverlust der Melanozyten führt zu Vitiligo, was die körperliche und geistige Gesundheit der betroffenen Personen ernsthaft beeinträchtigt. Derzeit gibt es keine wirksame Langzeitbehandlung für Vitiligo. Daher ist es unerlässlich, eine bequeme und wirksame Behandlung für Vitiligo zu entwickeln. Die Technologie der regenerativen Medizin zur direkten Reprogrammierung von Hautzellen in Melanozyten scheint eine vielversprechende neuartige Behandlung der Vitiligo zu sein. Dies beinhaltet die direkte Umprogrammierung der Hautzellen des Patienten in funktionelle Melanozyten, um den Verlust von Melanozyten bei Patienten mit Vitiligo zu lindern. Diese Methode muss jedoch zuerst an Mäusen getestet werden. Obwohl die direkte Reprogrammierung weit verbreitet ist, gibt es kein klares Protokoll für die direkte Reprogrammierung in Melanozyten. Darüber hinaus ist die Anzahl der verfügbaren Transkriptionsfaktoren überwältigend. 
Hier wird ein konzentriertes Lentivirus-Verpackungssystemprotokoll vorgestellt, um Transkriptionsfaktoren zu erzeugen, die für die Reprogrammierung von Hautzellen in Melanozyten ausgewählt wurden, einschließlich Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 und Snai2. Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus wurden mit dem konzentrierten Lentivirus für all diese Transkriptionsfaktoren für die direkte Reprogrammierung der MEFs in induzierte Melanozyten (iMels) in vitro infiziert. Darüber hinaus wurden diese Transkriptionsfaktoren gescreent und das System für die direkte Reprogrammierung auf Melanozyten optimiert. Die Expression der charakteristischen Melaninmarker in iMels auf Gen- oder Proteinebene war signifikant erhöht. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die direkte Reprogrammierung von Fibroblasten auf Melanozyten eine erfolgreiche neue therapeutische Strategie für Vitiligo sein könnte und den Mechanismus der Melanozytenentwicklung bestätigt, der die Grundlage für eine weitere direkte Reprogrammierung von Fibroblasten in Melanozyten in vivo bilden wird.

Dieser Artikel enthält die Protokolle eines konzentrierten Lentivirus-Verpackungssystems zur Herstellung von Lentiviren von Transkriptionsfaktoren für die direkte Reprogrammierung von Fibroblasten zu Melanozyten und Protokolle für das Screening auf Transkriptionsfaktoren und die direkte Reprogrammierung von Melanozyten aus MEFs.
Der Erfolg der konzentrierten Lentivirusproduktion wurde durch Beobachtung der Fluoreszenzintensität von GFP (Abbildung 1A) oder durch Durchflusszytometrie (Abbildung ...

Hier beschreiben wir ein optimiertes Direktreprogrammierungssystem für Melanozyten und ein hocheffizientes, konzentriertes Virusverpackungssystem, das eine reibungslose direkte Reprogrammierung gewährleistet.

Direkte Reprogrammierung von Mausfibroblasten in Melanozyten

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

Eine direkte Reprogrammierung zur Erzeugung von Melanozyten wurde berichtet. In verschiedenen Studien werden jedoch verschiedene Transkriptionsfaktoren verwendet. In diesem Protokoll haben wir die Anzahl der Transkriptionsfaktoren validiert und reduziert, immer noch mit höherer Reprogrammierungseffizienz.Wir haben ein direktes Reprogrammierungssystem eingerichtet, um Melanozyten mit nur drei Transkriptionsfaktoren, Mitf, Sox10 und PAX3, zu erzeugen, und das Kultursystem modifiziert, um es stabiler und robuster zu machen. Wie man funktionelle Melanozyten regeneriert, ist eine wichtige Frage, die helfen kann, Therapieeinschränkungen für Depigmentierungskrankheiten wie Vitiligo anzugehen. Die richtige Neuprogrammierung bietet eine Perspektive Unsere Technik hat die Eigenschaften von Komfort, starker Bedienbarkeit und Stabilität, die leichter zu fördern und zu wiederholen ist.Um mit der Produktion des konzentrierten Lentivirus zu beginnen, werden die 6 HEK-293T-Zellen 1,5 mal 10 Mal in eine 60-Millimeter-Schale gepresst und die Zellen mit normalem Medium bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid kultiviert. Nach 24 Stunden der Inkubation, wenn die HEK-293T-Zellen eine Konfluenz von 80 bis 90% erreicht haben, ersetzen Sie das Medium durch 3,5 ml DMEM und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid für zwei Stunden. Nachdem Sie die Zellen aus dem Inkubator entfernt haben, ersetzen Sie das Medium durch DMEM, das 2% FBS enthält, und fügen Sie die frisch zubereitete Transfektionskomplexmischung tropfenweise zu den Zellen hinzu.Mischen Sie die flüssige Mischung vorsichtig. Nach Ablauf von acht Stunden wechseln Sie das Zellmedium mit 3,5 ml normalem Medium. Sammeln Sie den Virusüberstand nach 24 und 48 Stunden.Als nächstes mischen Sie die zu zwei verschiedenen Zeitpunkten gesammelten Virusüberstände und zentrifugieren Sie die Mischung bei 200 xg für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Führen Sie dann den gesammelten Überstand durch 0,45-Mikron-Filter, um das Filtrat in einem sterilen 50-ml-Konusrohr zu sammeln. Konzentrieren Sie den filtrierten Virusüberstand durch Zentrifugation auf 6.000 xg bei vier Grad Celsius über Nacht.Stellen Sie nach dem Fertig sicher, dass das Viruspellet am Boden des konischen Röhrchens sichtbar ist. Gießen Sie den Überstand langsam aus. Zum Auflösen des Viruspellets im normalen Medium mit einem mal 100-Volumen*Volumen des Virusüberstandes.Verwenden Sie eine P1000-Mikropipette, um vorsichtig auf und ab zu pipettieren, bis eine homogene 100x konzentrierte Virusmischung erhalten wird. Teilen Sie das konzentrierte Virus in die Mikrozentrifugenröhrchen, um es bei 80 Grad Celsius zu lagern. Platte 1 mal 10 bis die 5. HEK-293T Zellen in eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte.Kultivieren Sie diese Zellen mit dem normalen Medium bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid. Nach 24 Stunden fügen Sie 0,1 bis 0,2 Mikroliter des 100x fluoreszierenden konzentrierten Virus zu jeder Vertiefung hinzu. Gefolgt von der Zugabe von vier Nanogramm pro Mikroliter des kationischen polymeren Transfektionsreagenzes zu jeder Vertiefung.Etwa acht bis zwölf Stunden nach der Infektion mit dem Virus das Medium durch das normale Medium ersetzen. Achtundvierzig Stunden nach der Infektion waschen Sie das Geschirr mit 1 ml sterilem PBS, um die toten Zellen zu entfernen. Dann trypsinisieren Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung pro Vertiefung einer Sechs-Well-Platte bei Raumtemperatur.Zentrieren Sie die Platte bei 200 xg für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, suspendieren Sie das Zellpellet erneut in einem ml PBS und fügen Sie die Zellsuspension zu einem fünf ml Polystyrol-Rundbodenrohr hinzu. Legen Sie dann das Rohr in das Durchflusszytometer, um die Probe zu analysieren.Zur direkten Reprogrammierung von Fibroblasten beschichten Sie eine Vertiefung einer Zellkulturplatte mit sechs Well mit 1 ml 0,1%iger Gelatinelösung bei Raumtemperatur. Nach 15 bis 30 Minuten, wenn der Brunnen vollständig mit der Gelatine bedeckt ist, aspirieren Sie 0,1% Gelatinelösung. Als nächstes Platte 5 mal 10 bis zur 4. Maus embryonale Fibroblasten oder MEFs, in eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte, die mit 0,1% Gelatine beschichtet ist, und die Zellen über Nacht mit dem normalen Medium bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid kultivieren.Nach 24 Stunden, wenn die MEFs eine Konfluenz von 40 bis 50% erreicht haben, ersetzen Sie das Medium durch das normale Medium. Als nächstes schmelzen Sie das gefrorene, konzentrierte Virus auf Eis. Berechnen Sie das Volumen des hinzuzufügenden Virus mithilfe der Gleichung und addieren Sie dann das konzentrierte Virus für die sechs Transkriptionsfaktoren zu jedem Bohrloch entsprechend dem berechneten Volumen.Fügen Sie vier Mikrogramm pro ml des kationischen polymeren Transfektionsmittels in die Vertiefung hinzu. Betrachten Sie es als Tag Null der Lentivirus-Infektion. Am ersten Tag, nach 8 bis 12 Stunden Infektion, ersetzen Sie das Medium, das das Virus enthält, durch das frische normale Medium, während Sie 0,5 Mikrogramm pro ml Puromycin hinzufügen, um stabile infizierte Zelllinien zu screenen.Ersetzen Sie am zweiten Tag, 48 Stunden nach der Infektion, das überstehende Medium allmählich durch das Reprogrammierungsmedium. Ändern Sie ein Viertel des gesamten mittleren Volumens, bevor Sie drei mikromolare CHIR99021 hinzufügen. Wechseln Sie vom dritten bis zum siebten Tag je nach Zustand der Zellen das Medium, indem Sie es schrittweise durch einen höheren Anteil an Reprogrammiermedium ersetzen, um innerhalb von fünf Tagen auf das komplette Reprogrammiermedium umzusteigen.Als nächstes lösen Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern 0,05% Trypsin-EDTA-Verdauungsenzym für drei Minuten bei Raumtemperatur. Wenn etwa sechzig Prozent der Zellen nach oben geschwommen sind, stoppen Sie die Verdauung, indem Sie das normale Medium hinzufügen, das Zweifache des Volumens des Verdauungsenzyms. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-ml-sterilen konischen Röhrchen, um bei 200 xg für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.Entfernen Sie den Überstand, bevor Sie das Zellpellet mit dem Reprogrammiermedium wieder suspendieren. Wenn Sie fertig sind, plattieren Sie die resuspendierten Zellen in einer 60-Millimeter-Sterilschale. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5%Kohlendioxid-Inkubator.Nach achtundvierzig Stunden Lentivirus-Infektion in HEK-293T-Zellen wurde der Erfolg der konzentrierten Lentivirus-Produktion durch Beobachtung der Fluoreszenzintensität von GFP oder durch Durchflusszytometrie bewertet. Der Titer des konzentrierten Virus war bei 10 bis zur 8. TU / ml hoch. Während der direkten Reprogrammierung der Fibroblasten änderte sich die Zellmorphologie allmählich zu länglichen Zellsynapsen und vergrößerten Zellkernen.Die Zellen alterten jedoch nach dem zwanzigsten Tag zunehmend. Die Entfernung der Transkriptionsfaktoren Mitf, Pax3 oder Sox10 führte zum Schweigen der Expression der melanozytären Gene Tyr, Tyrp1 und Mlana, was auf den größten Einfluss auf die Umwandlung von Fibroblasten in Melanozyten hinweist. Daher war die Expression von melanozytären Genen, die durch die direkte Programmierung mit drei Transkriptionsfaktoren induziert wurden, im Vergleich zu sechs Transkriptionsfaktoren höher.Zur Identifizierung von MEF-induzierten Melanozyten oder iMels, der Expression von melanozytären Markern, wurde TYRP1 und DCT mittels Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen. Darüber hinaus zeigten die Melanin-spezifischen Färbemethoden wie DOPA und Masson-Fontana-Färbung positive Ergebnisse. Die 293T-Zellen sollten gleichmäßig verteilt sein.Auch die Zugabe von Transfektionsmischung zu Zellen muss sanft erfolgen, um zu verhindern, dass die Zellen schweben. Das Protokoll ist stabil und praktisch und kann verwendet werden, um andere Arten von Zellen neu zu programmieren. Es wird erwartet, dass es eine Referenz und eine Strategie für die direkte In-vivo-Reprogrammierung der Melanozytenregeneration in der zukünftigen Medizin liefern wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen mit induzierbaren Lentivirus, dass ausdrückliche Oct4, Sox2, c-Myc und Klf4.

Generieren von iPS-Zellen aus MEFS durch Forced Expression von Sox-2, Oct-4, c-Myc und Klf4

Dieses Video beschreibt die schnelle Methode, die Melanozyten und Fibroblasten gleichzeitig aus der Haut des postnatalen Mauswelpen zu isolieren und zu kultivieren. Diese Zellen können in vitro erhalten und manipuliert werden, um die Zellbiologie der Haut, die Wundheilung und das Melanom zu untersuchen.

Schnelle Kultivierung primärer melanischer Melanozyten und Fibroblasten: Isolierung von Melanozyten und Fibroblasten aus einer ganzen Maushautprobe

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammungen.

Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Induktion eines hämogenen Programms in embryonalen Fibroblasten der Maus durch Überexpression eines minimalen Satzes von Transkriptionsfaktoren. Diese Technologie kann auf das menschliche System übertragen werden, um Plattformen für zukünftige Studien zur Hämatopoese, zu hämatologischen Erkrankungen und hämatopoetischen Stammzelltransplantationen bereitzustellen.

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

Hier präsentieren wir eine robuste Methode zur primären embryonale Fibroblasten in funktionellen Herzmuskelzellen durch Überexpression des GATA4, Hand2, Mef2c und Tbx5, MiR-1 und MiR-133 (GHMT2m) neben Hemmung der TGF-β-Signal neu zu programmieren. Unser Protokoll generiert schlagende Herzzellen bereits 7 Tage nach Transduktion mit bis zu 60 % Wirkungsgrad.

Unterdrückung der Pro-fibrotische Signalisierung potenziert Faktor-vermittelten Reprogrammierung von Maus embryonalen Fibroblasten in induzierte Kardiomyozyten

Hier stellen wir Ihnen unser Protokoll für Herstellung von induzierten erythroiden Vorläuferzellen (iEPs) von Maus Erwachsenen Fibroblasten mit Transkription Faktor-driven direkte Abstammung Neuprogrammierung (DLR).

Direkte Linie Reprogrammierung von adulten Maus-Fibroblasten zu erythroiden Vorläuferzellen

Hier beschreiben wir eine klinisch relevante, hohem Wirkungsgrad, Feeder-free Methode, um menschliche primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen mit modifizierten mRNAs codieren Neuprogrammierung Faktoren neu zu programmieren und Reife MicroRNA-367/302 imitiert. Ebenfalls enthalten sind Methoden zur Beurteilung der Neuprogrammierung Effizienz klonalen iPSC Kolonien zu erweitern, und Ausdruck der Pluripotenz Markierung TRA-1-60 zu bestätigen.

RNA-basierten Reprogrammierung von menschlichen primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen

Dieses Protokoll skizziert eine schnelle Methode, um gleichzeitig Melanozyten- und Fibroblastenkulturen aus der Haut von 0-4 Tage alten Mäusen zu erzeugen. Diese Primärkulturen können in vitro gepflegt und manipuliert werden, um eine Vielzahl physiologisch relevanter Prozesse zu untersuchen, einschließlich Hautzellbiologie, Pigmentierung, Wundheilung und Melanom.

Schnelle Generierung von primären Melanozyten- und Fibroblastenkulturen

Dieses Protokoll demonstriert die Induktion eines hämogen Programms in humanen dermalen Fibroblasten durch erzwungene Expression der Transkriptionsfaktoren GATA2, GFI1B und FOS zur Erzeugung hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen.

Hämogene Reprogrammierung menschlicher Fibroblasten durch erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren

Die Zellumprogrammierung erfordert die Einführung von Schlüsselgenen, die den pluripotenten Zellzustand regulieren und aufrechterhalten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Bildung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen dermalen Fibroblasten ohne virale/integrierende Methoden, aber unter Verwendung nicht modifizierter RNAs (NM-RNAs) in Kombination mit Immunumgehungsfaktoren, die die zellulären Abwehrmechanismen reduzieren.

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Dieses Protokoll beschreibt die Umwandlung von Hautfibroblasten in Myoblasten und deren Differenzierung in Myotuben. Die Zelllinien stammen von Patienten mit neuromuskulären Störungen und können zur Untersuchung pathologischer Mechanismen und zur Erprobung therapeutischer Strategien verwendet werden.

Direkte Umprogrammierung menschlicher Fibroblasten in Myoblasten zur Untersuchung von Therapien für neuromuskuläre Störungen

Erfahren Sie die direkte Reprogrammierung von Mausfibroblasten zu funktionalen Melanozyten mit nur drei Transkriptionsfaktoren. Diese optimierte Methode bietet höhere Effizienz und Stabilität für regenerative Therapien.

Direkte Reprogrammierung von Mausfibroblasten in Melanozyten

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