Name: Bildgebung der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme in Astrozyten und Neuronen unter Verwendung von genetisch kodierten Ca2+ Indikatoren (GECIs) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Lernen Sie die Bildgebung der mitochondrialen Ca2+-Aufnahme in Astrozyten und Neuronen mit genetisch kodierten Ca2+-Indikatoren GCaMP5G und GCaMP6s. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung mitochondrialer Funktion in spezifischen Zelltypen.

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Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health unterstützt Das National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) gewährt R01NS069726 und R01NS094539 an SD. Wir danken Erica DeMers für die Audioaufnahme.

Verfahren mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Missouri-Columbia genehmigt.
1. Aufbau von DNA-Plasmiden
HINWEIS: Für die In-vitro- und In-vivo-Bildgebung werden DNA-Plasmide konstruiert, die für GCaMP5G/6s mit Astrozyten- und Neuronen-spezifischen Promotoren und mitochondrialen Targeting-Sequenzen kodieren.
<ol><li>Einfügen der mitochondrialen Matrix (MM)-Targeting-Sequenz (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG17 in die Klonierungsstellen EcoRI und BamHI im Rückgrat des Adeno-assoziierten Virus (AAV) Plasmids pZac2.1, um Plasmide zu erhalten, die astrozytäre gfaABC1D Promotor oder neuronalen CaMKII Promotor18,19,20enthalten.</li>
	<li>Subklone GCaMP5G/6s in die Klonierungsstellen BamH I und Not 1 in den oben genannten Plasmiden, um neue Plasmide zu erhalten pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s und pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s, die auf die Transgenexpression in Mitochondrien in Astrozyten und Neuronen abzielen20,21 (Abbildung 1A).</li>
	<li>pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G und pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s DNA-Plasmide für die Transfektion für in vitro Studien vorbereiten (Abschnitt 2). Herstellung von AAV-Vektoren mit Serotyp 5 für Astrozyten und Serotyp 9 für Neuronen für die In-vivo-Studie 18 (Abschnitt 3).</li>
</ol>2. In vitro mitochondriale Ca2+ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen
<ol><li>Präpariere primäre Astrozyten aus dem Kortex von P1-Neugeborenenmäusen und primären Neuronen aus dem Kortex der E15-16-Embryonen18,22,23,24und kulturiere sie auf Glasdecklippen mit einem Durchmesser von 12 mm in 24-Well-Platten unter Verwendung von Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), das 10% fetales Rinderserum (FBS) und neuronales Basalmedium (NBM) mit 2% B27 enthält. beziehungsweise.</li>
	<li>Transfizieren Sie reife Astrozyten und Neuronen mit pZac-gfaABC1D-GCaMP6s und pZac-CaMKII-GCaMP5G-Plasmiden unter Verwendung von lipidbasiertem Transfektionsreagenz, um GCaMP6s in den Mitochondrien von Astrozyten und GCaMP5G in den Mitochondrien von Neuronen zu exprimieren18,20,21. Transfizieren Sie Zellen in jeder Vertiefung mit 0,5 μg DNA und wechseln Sie das Medium 6 h später. HINWEIS: Die Astrozyten und Neuronen sind 1-2 Tage nach der Transfektion bereit für die Bildgebung.</li>
	<li>Führen Sie in vitro mitochondriale Ca2+ Bildgebung 1-2 Tage nach der Transfektion durch.<ol>
<li>Übertragen Sie die mit Astrozyten oder Neuronen kultivierten Glasdeckgläser unter einem Epifluoreszenz- oder Zwei-Photonen-Mikroskop in die PH-1-Perfusionskammer.</li>
		<li>Stimulieren Sie die astrozytäre mitochondriale Ca2+ Aufnahme mit 100 μM ATP in ACSF oder stimulieren Sie neuronale Mitochondrien mit 100 μM Glutamat / 10 μM Glycin20,25 (Abbildung 2 und Abbildung 3). HINWEIS: Lösungswechsel von ACSF zu ATP- und Glutamat/Glycin-haltigem ACSF werden durch ein ALA-VM8-Perfusionssystem21gesteuert. Die Geschwindigkeit des Lösungswechsels wird durch Einstellen eines Ventils mit 1-2 ml/min gesteuert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. In vivo mitochondriale Ca2+ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen
<ol><li>AAV-Vorbereitungen.<ol>
<li>Herstellung der folgenden rekombinanten Adeno-assoziierten Virusvektoren (rAAV) unter Verwendung der in Abschnitt 1 hergestellten DNA-Plasmide: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G und rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s-Vektoren. HINWEIS: In diesem Experiment wurden rAAV-Vektoren des Serotyps 5 hergestellt, um GCaMP5G in Mitochondrien in Astrozyten zu exprimieren, und rAAV-Vektoren des Serotyps 9 wurden hergestellt, um GCaMP6s in Mitochondrien in Neuronen zu exprimieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Stereotaxische AAV-Injektion.<ol>
<li>Betäuben Sie die Maus mit 3% Isofluran. HINWEIS: Später während der Operation werden die Isofluranspiegel auf 2% reduziert.</li>
		<li>Nachdem die Maus ein chirurgisches Anästhesieniveau erreicht hat, das durch Schwanz- und Zehendrücken bestimmt wird, rasieren Sie die Haare mit einem Haarschneider über die Operationsstelle, den motorischen oder somatosensorischen Kortex.</li>
		<li>Positionieren Sie die Maus auf dem stereotaktischen Mausgerät und fixieren Sie den Kopf mit Ohrbügeln. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um sie während der Operation zu schützen. Verwenden Sie ein Heizkissen, um die Körpertemperatur der Maus während der gesamten Operation bei 37 ° C zu halten. HINWEIS: Führen Sie eine Operation mit aseptischen Verfahren durch. Alle chirurgischen Werkzeuge müssen entweder durch Autoklavieren oder einen Heißperlensterilisator sterilisiert werden.</li>
		<li>Nachdem die Maus auf dem stereotaktischen Gerät montiert ist, sterilisieren Sie die Kopfhaut dreimal mit abwechselnd jodbasiertem Peeling und 70% Ethanol. Machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie der Kopfhaut, um die Injektionsstelle freizulegen.</li>
		<li>Schneiden Sie die Haut in der Bregma-Lamda-Achse auf und erstellen Sie mit einem Hochgeschwindigkeitsbohrer ein ~ 1 mm Durchmessergratloch an der vorgesehenen Injektionsstelle des motorischen oder somatosensorischen Kortex.</li>
		<li>Verwenden Sie eine 33 G Hamilton-Spritze mit Adeno-assoziiertem Virus (rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G-Vektoren [1 x 1011 GC] oder rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s-Vektoren [1 x 1011 GC]), um bis zu 1 μL Virus im Zielbereich zu injizieren. HINWEIS: Für die kortikale Virusabgabe injizieren Sie beispielsweise die Viruslösung in zwei Tiefen in mehreren Schritten. Führen Sie zuerst die Nadel bis zu einer Tiefe von 1 mm von der Dura ein und lassen Sie 5 Minuten für das Gehirn warten, um sich zu erholen. Bewegen Sie dann die Nadel bis zu ~ 700 μm Tiefe und injizieren Sie 500 nL der Viruslösung mit einer Injektionsgeschwindigkeit von 10 nL / s mit einer Hamilton-Spritze, die von einem Mikrospritzenpumpenregler gesteuert wird. Nachdem die Injektion abgeschlossen ist, warten Sie 5 Minuten, damit das Virus in das Gehirn diffundieren kann. Bewegen Sie dann die Nadel bis zur zweiten Injektionsstelle in einer Tiefe von 300 μm. Hier werden zusätzlich 500 nL der Viruslösung injiziert. Warten Sie 10 Minuten, damit das Virus in das Gehirn diffundieren kann.</li>
		<li>Schließen Sie die Kopfhaut und die Haut mit einem Gewebekleber. Lassen Sie die Mäuse sich auf dem Heizkissen erholen. Schicken Sie Mäuse nach der Genesung zurück in die Tiereinrichtung.</li>
	</ol></li>
	<li>Kraniale Fensterintstallation und in vivo Zwei-Photonen (2-P) Bildgebung von mitochondrialen Ca2+ Signalen. HINWEIS: Die Kranialfensterimplantation erfolgt 3 Wochen nach der AAV-Injektion über den motorischen oder somatosensorischen Kortex26,27,28,29. Carprofen (10 mg/kg) wird subkutan injiziert, um mögliche Schmerzen vor der Operation zu lindern. Die kranialen Fensterchirurgieverfahren sind identisch mit den chirurgischen Eingriffen der AAV-Injektion und werden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt.<ol>
<li>Betäuben Sie die Maus mit 3% Isofluran. HINWEIS: Dies ist die Anfangsdosis und reduzieren Sie sie auf 2% für die spätere Operation. Während der Bildgebung wird eine intraperitoneale (IP) Injektion von 130 mg Ketamin /10 mg Xylazin/kg Körpergewicht, gelöst in ACSF, zur Anästhesie verwendet.</li>
		<li>Positionieren Sie die Maus auf dem stereotaktischen Mausgerät und fixieren Sie den Kopf mit Ohrbügeln. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf. Verwenden Sie ein Heizkissen, um die Körpertemperatur der Maus während der gesamten Operation bei 37 ° C zu halten. HINWEIS: Alle chirurgischen Werkzeuge müssen sterilisiert werden.</li>
		<li>Machen Sie einen Schnitt von 5-8 mm Länge in der Mittellinie der Kopfhaut und entfernen Sie einen Hautlappen mit einer Schere.</li>
		<li>Nachdem der Schädel freigelegt wurde, führen Sie eine Kraniotomie mit einem Durchmesser von 2,0-3,0 mm mit einem Hochgeschwindigkeitsbohrer über dem vom Virus injizierten Bereich (d. h. motorischer Kortex oder somatosensorischer Kortex, Abbildung 1B) durch. Machen Sie zuerst vier kleine Löcher und bohren Sie dann in einem Kreis entlang, der die Löcher verbindet. Heben und entfernen Sie dann den Knochen mit einer scharfen Schere und entfernen Sie ihn. Die freiliegende Dura mater kann entfernt oder intakt gehalten werden, um das Schädelfenster zu bewirken.</li>
		<li>Legen Sie einen Glasdecker von 3-5 mm Durchmesser mit einem transparenten Silikon über die Kraniotomie. Verwenden Sie einen Zahnstocher, um das Schädelfenster sanft auf die Oberfläche des Gehirns zu drücken. Versiegeln Sie dann die Kante mit einer kleinen Menge Silikonkleber. HINWEISE: Alternativ kann anstelle einer Silikonscheibe ein 1,2% iges Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt zwischen dem Deckglas und dem Hirngewebe verwendet werden.</li>
		<li>Zum Schluss versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit Zahnzement. Achten Sie darauf, den Zement leicht am Rand des Schädelfensters aufzutragen, um eine starke Verklebung zu gewährleisten. Befestigen Sie eine maßgefertigte Kopfplatte aus Metall mit Zahnzement am Schädel. HINWEIS: Die Metallplatte wird verwendet, um den Kopf der Maus während der Bildgebungssitzung auf der Stufe des 2-P-Mikroskops zu fixieren (Abbildung 1C).</li>
		<li>Fügen Sie 0,5 ml ACSF-Lösung über den Deckglas am Schädelfenster hinzu, um während der Bildgebung in Wasser einzutauchen.</li>
		<li>Durchführung einer Zeitraffer-in-vivo-2-P-Bildgebung von Mito-GCaMP5G in Astrozyten und Mito-GCaMP6s in Neuronen mit 910 nm Wellenlänge durch das Schädelfenster (Abbildung 1C)18,20,27. HINWEIS: Während der Bildgebung befinden sich Mäuse auf dem Heizkissen, um die physiologische Temperatur aufrechtzuerhalten. Die Mäuse werden unmittelbar nach Abschluss der Bildgebungssitzung geopfert.</li>
		<li>Markieren Sie Astrozyten in vivo mit Sulforhodamin 101 (SR101), wenn es notwendig ist, die Kolokalisation zu bestimmen.<ol>
<li>Am Ende von Schritt 3.3.4 tragen Sie 100 μL 100 μM SR101 in ACSF für 1-5 min auf die kortikale Oberfläche auf.</li>
			<li>Spülen Sie die Oberfläche mit ACSF ab, um den ungebundenen SR101 wegzuspülen. Mittels 2-P-Bildgebung kann die Co-Markierung von Mito-GCaMP5G und SR101 in Astrozyten 45-60 min später beobachtet werden (Abbildung 4A).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Griffiths, E. J., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+as+a+key+regulator+of+mitochondrial+ATP+production+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).</li>
<li>Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Ca2%2B+homeostasis%3A+mechanism%2C+role%2C+and+tissue+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities.</a> Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).</li>
<li>Llorente-Folch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulation+of+mitochondrial+respiration+maintains+ATP+homeostasis+and+requires+ARALAR%2FAGC1-malate+aspartate+shuttle+in+intact+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).</li>
<li>Burkeen, J. F., Womac, A. D., Earnest, D. J., Zoran, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+signaling+mediates+rhythmic+extracellular+ATP+accumulation+in+suprachiasmatic+nucleus+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (23), 8432-8440 (2011).</li>
<li>Duchen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+calcium-dependent+neuronal+death+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease.</a> Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 111-121 (2012).</li>
<li>Gouriou, Y., Demaurex, N., Bijlenga, P., De Marchi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+handling+during+ischemia-induced+cell+death+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium handling during ischemia-induced cell death in neurons.</a> Biochimie. 93 (12), 2060-2067 (2011).</li>
<li>Qiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+uniporter+Mcu+controls+excitotoxicity+and+is+transcriptionally+repressed+by+neuroprotective+nuclear+calcium+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium uniporter Mcu controls excitotoxicity and is transcriptionally repressed by neuroprotective nuclear calcium signals.</a> Nature Communications. 4, 2034(2013).</li>
<li>Filadi, R., Greotti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin+and+yang+of+mitochondrial+Ca2%2B+signaling+in+cell+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The yin and yang of mitochondrial Ca2+ signaling in cell physiology and pathology.</a> Cell Calcium. 93, 102321(2021).</li>
<li>Finkel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+mitochondrial+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of mitochondrial calcium.</a> Circulation Research. 116 (11), 1810-1819 (2015).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+The+calcium+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: The calcium connection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Yamada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+genetically+encoded+Ca2%2B+indicators+in+cortical+pyramidal+cells+and+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of genetically encoded Ca2+ indicators in cortical pyramidal cells and cerebellar Purkinje cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 5, 18(2011).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+green+fluorescent+protein+as+a+tool+for+visualizing+subcellular+organelles+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells.</a> Current Biology: CB. 5 (6), 635-642 (1995).</li>
<li>Xie, Y., Wang, T., Sun, G. Y., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+disruption+of+astrocytic+Ca2%2B+signaling+pathway+in+vivo+by+adeno-associated+viral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction.</a> Neuroscience. 170 (4), 992-1003 (2010).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFAP+promoter+elements+required+for+region-specific+and+astrocyte-specific+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression.</a> Glia. 56 (5), 481-493 (2008).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+mitochondrial+Ca2%2B+dynamics+in+astrocytes+using+cell-specific+mitochondria-targeted+GCaMP5G%2F6s%3A+Mitochondrial+Ca2%2B+uptake+and+cytosolic+Ca2%2B+availability+via+the+endoplasmic+reticulum+store%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store.</a> Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).</li>
<li>Zhang, N., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+mitochondrial+and+cytosolic+Ca2%2B+signals+in+cultured+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes.</a> Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).</li>
<li>Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-B-cell+colony-enhancing+factor+exerts+a+neuronal+protection+through+its+enzymatic+activity+and+the+reduction+of+mitochondrial+dysfunction+in+in+vitro+ischemic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models.</a> Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).</li>
<li>Wang, X., Li, H., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-B-cell+colony-enhancing+factor+protects+against+apoptotic+neuronal+death+and+mitochondrial+damage+in+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia.</a> Scientific Reports. 6, 32416(2016).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+NAMPT-mediated+NAD%2B+salvage+pathways+and+their+roles+in+bioenergetics+and+neuronal+protection+after+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury.</a> Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).</li>
<li>Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+deficits+in+parvalbumin+neuron+stimulation-evoked+network+activity+despite+recovery+of+dendritic+structure+and+excitability+in+the+somatosensory+cortex+following+global+ischemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).</li>
<li>Ding, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDing%2C+S+%22In+vivo+imaging+of+Ca2%2B+signaling+in+astrocytes+using+two-photon+laser+scanning+fluorescent+microscopy+in+Astrocytes%22">In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes</a>. Milner, R. , Humana Press. 545-554 (2012).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+IP3R2-mediated+Ca2%2B+signaling+pathway+in+astrocytes+ameliorates+neuronal+death+and+brain+damage+while+reducing+behavioral+deficits+after+focal+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke.</a> Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).</li>
<li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothrombosis+ischemia+stimulates+a+sustained+astrocytic+Ca2%2B+signaling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo.</a> Glia. 57 (7), 767-776 (2009).</li>
<li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+astrocytic+Ca2%2B+signals+contribute+to+neuronal+excitotoxicity+after+status+epilepticus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).</li>
<li>Gobel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-endoplasmic+reticulum+contacts+in+reactive+astrocytes+promote+vascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling.</a> Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).</li>
<li>Diaz-Garcia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+roles+of+calcium+in+rapid+control+of+neuronal+glycolysis+and+the+tricarboxylic+acid+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle.</a> eLife. 10, 64821(2021).</li>
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In diesem Artikel stellen wir eine Methode und ein Protokoll zur Abbildung mitochondrialer Ca2+-Signale in Astrozyten und Neuronen zur Verfügung. Wir implementierten Mitochondria-Targeting- und zelltypspezifische Strategien, um GECI GCaMP5G/6s zu exprimieren. Um GCaMP5G/6s in Mitochondrien anzugreifen, haben wir eine Mitochondrien-Targeting-Sequenz in die Plasmide aufgenommen. Um GCaMP5G/6s in Astrozyten und Neuronen in vivo zu exprimieren,haben wir einen Astrozyten-spezifischen Promotor gfaABC1D und ...

Mitochondrien sind dynamische subzelluläre Organellen und gelten als Zellkraftwerke für die Energieproduktion. Auf der anderen Seite können MitochondrienCa2+ in die Matrix aufnehmen, als Reaktion auf lokale oder zytosolischeCa2+ Anstiege. Die mitochondrialeCa2+-Aufnahme beeinflusst die mitochondriale Funktion, einschließlich Stoffwechselprozesse wie Reaktionen im Tricarbonsäurezyklus (TCA) und oxidative Phosphorylierung, und reguliertCa2+-empfindlicheProteine unter physiologischenBedingungen 1,2,3,4. Mitochondriale Ca2+ Überlastung ist auch eine Determinante für den Zelltod, einschließlich Nekrose und Apoptose bei verschiedenen Hirnerkrankungen5,6,7. Es verursacht die Öffnung von mitochondrialen Permeabilitätsübergangsporen (mPTPs) und die Freisetzung von Caspase-Cofaktor, die den apoptotischen Zelltod einleiten. Daher ist es wichtig, die mitochondrialeCa2+-Dynamik und -Handhabung in lebenden Zellen zu untersuchen, um die zelluläre Physiologie und Pathologie besser zu verstehen.
Mitochondrien erhalten die MatrixCa2+ Homöostase durch ein Gleichgewicht zwischen Ca2+ Aufnahme und Efflux. Die mitochondrialeCa2+-Aufnahme wird hauptsächlich durch mitochondrialeCa2+-Uniporter (MCUs) vermittelt, während der mitochondrialeCa2+-Efflux durch die Na+-Ca2+-Li+-Austauscher (NCLXs) und dieH+/Ca2+-Austauscher(mHCXs)8vermittelt wird. Das Gleichgewicht kann durch die Stimulation von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) gestört werden9. MitochondrialeCa2+ Homöostase wird auch durch mitochondriale Pufferung durch die Bildung von unlöslichenxCa2+-xPO4x-xOH-Komplexenbeeinflusst 8.
Intrazelluläre und mitochondriale Veränderungen derCa2+-Konzentration ([Ca2+])können durch fluoreszierende oder lumineszierendeCa2+-Indikatoren bewertet werden. Die Bindung von Ca2+ an Indikatoren verursacht spektrale Modifikationen, die es ermöglichen, freie zelluläre [Ca2+] in Echtzeit in lebenden Zellen aufzuzeichnen. Derzeit stehen zwei Arten von Sonden zur Verfügung, um Ca2+-Veränderungen in Zellen zu überwachen: organisch-chemische Indikatoren und genetisch kodierteCa2+-Indikatoren (GECIs). Im Allgemeinen stehen für die untersuchten biologischen Fragestellungen unterschiedliche Varianten mit unterschiedlichenCa2+-Affinitäten (basierend auf Kd),spektralen Eigenschaften (Anregungs- und Emissionswellenlängen), Dynamikbereichen und Sensitivitäten zur Verfügung. Obwohl viele synthetische organische Ca2+-Indikatoren für die zytosolischeCa2+-Bildgebung verwendet wurden, können nur wenige selektiv in die mitochondriale Matrix für die mitochondrialeCa2+-Bildgebung geladen werden, wobei Rhod-2 am weitesten verbreitet ist (für Reviews siehe10,11). Rhod-2 hat jedoch einen großen Nachteil der Leckage bei langen Zeitverlaufsexperimenten; Darüber hinaus ist es zwischen Mitochondrien, anderen Organellen und dem Zytosol aufgeteilt, was absolute Messungen in verschiedenen Unterkompartimenten erschwert. Im Gegensatz dazu können GECIs durch die Verwendung von zelltypspezifischen Promotoren und subzellulären Kompartiment-Targeting-Sequenzen in verschiedenen Zelltypen und subzellulären Kompartimenten für die zell- und kompartimentspezifischeCa2+-Bildgebung in vitro oder in vivoexprimiert werden. Einwellenlängen-Fluoreszenzintensitäts-basierte GCaMP Ca2+ Indikatoren haben sich kürzlich als Haupt-GECIs12,13,14,15,16herausgestellt. In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll für das Mitochondria-Targeting und die zelltypspezifische Expression von GCaMP5G und GCaMP6s (GCaMP5G/6s) in Astrozyten und Neuronen sowie die Abbildung der mitochondrialen Ca2+-Aufnahme in diesen Zelltypen zur Verfügung. Mit diesem Protokoll kann die Expression von GCaMP6G/6s in einzelnen Mitochondrien aufgedeckt werden, und ca2+ Aufnahme in einzelner mitochondrialer Auflösung kann in Astrozyten und Neuronen in vitro und in vivoerreicht werden.

<table><tbody><tr><td>Künstliche Tränensalbe</td><td>Rugby</td><td>NDC-0536-6550-91</td><td>83% weißes Vaseline</td></tr><tr><td>Cyanoacrylat-Kleber</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>3M Vetbond Klebstoff</td></tr><tr><td>Präparieren Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ 2B</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Dumont Pinzette mit feiner Spitze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>zum Entfernen von Dura</td></tr><tr><td>Glasabdeckfolien, 0,13-0,17 mm dick</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td>für kraniale Fensterabdeckung</td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrer</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-17</td><td>mit Knochenpolierbohrer</td></tr><tr><td>Injektionsspritze</td><td>Hamilton</td><td>2,5 ml</td><td>für die Virusinjektion</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>VEDCO</td><td>NDC-50989-996-06</td><td>100 mg/kg Körpergewicht</td></tr><tr><td>Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td>Reduzierung von Bewegungsartefakten</td></tr><tr><td>Metallrahmen</td><td>Sonderanfertigung</td><td>siehe Abb. 1</td><td>für den Anbau des Gehirns an den Mikroskoptisch</td></tr><tr><td>MicroSyringe Pump</td><td>Controller World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td>Injektionsgeschwindigkeitsregler</td></tr><tr><td>Maus stereotaktisches Gerät</td><td>Stoelting</td><td>51725</td><td>zum Halten von Mäusen</td></tr><tr><td>Perfusionskammer</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0284</td><td></td></tr><tr><td>Persfusionssystem</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>ALA-VM8</td><td></td></tr><tr><td>Selbstregulierendes Heizkissen</td><td>Fine Science Tools</td><td>21061</td><td>zur Verhinderung von Unterkühlung von Mäusen</td></tr><tr><td>Sulforhodamin 101</td><td>Invitrogen</td><td>S-359</td><td>roter Fluoreszenzfarbstoff zur Markierung von Astrozyten</td></tr><tr><td>Chirurgische Schere, 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-12</td><td>zum Sezieren</td></tr><tr><td>Trephine</td><td>Fine Science Tools</td><td>18004-23</td><td>zum Reinigen von Material</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>VEDCO</td><td>NDC-50989-234-11</td><td>10 mg/kg Körpergewicht</td></tr></tbody></table>

bildgebung der mitochondrialen ca2+ aufnahme in astrozyten und neuronen unter verwendung von genetisch kodierten ca2+ indikatoren (gecis)

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

MitochondrialesCa2+ spielt eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der zytosolischenCa2+-Pufferung, des Energiestoffwechsels und der zellulären Signaltransduktion. Die Überlastung des mitochondrialen Ca2+ trägt zu verschiedenen pathologischen Zuständen bei, einschließlich Neurodegeneration und apoptotischem Zelltod bei neurologischen Erkrankungen. Hier stellen wir einen zelltypspezifischen und auf Mitochondrien abzielenden molekularen Ansatz für die mitochondriale Ca2+ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen in vitro und in vivovor. Wir konstruierten DNA-Plasmide, die für Mitochondrien kodieren, die auf genetisch kodierte Ca2+ Indikatoren (GECIs) GCaMP5G oder GCaMP6s (GCaMP5G/6s) mit astrozyten- und neuronenspezifischen Promotoren gfaABC1D und CaMKII und mitochondrien-Targeting-Sequenz (mito-) abzielen. Für die in vitro mitochondriale Ca2+ Bildgebung wurden die Plasmide in kultivierten Astrozyten und Neuronen transfiziert, um GCaMP5G/6s zu exprimieren. Für die in vivo mitochondriale Ca2+ Bildgebung wurden adeno-assoziierte virale Vektoren (AAVs) hergestellt und in das Gehirn der Maus injiziert, um GCaMP5G/6s in Mitochondrien in Astrozyten und Neuronen zu exprimieren. Unser Ansatz bietet ein nützliches Mittel, um die mitochondrialeCa2+-Dynamik in Astrozyten und Neuronen abzubilden, um die Beziehung zwischen zytosolischer und mitochondrialerCa2+-Signalgebung sowie Astrozyten-Neuronen-Interaktionen zu untersuchen.

Ziel dieser Studie war es, eine Methodik zur Abbildung mitochondrialer Ca2+-Signale unter Verwendung von GECIs in Astrozyten und Neuronen in vitro und in vivo bereitzustellen. Ergebnisse der in vitro und in vivo mitochondrialen Ca2+ Bildgebung werden hier vorgestellt.
In vitro mitochondriale Ca2+ Signalisierung in kultivierten Astrozyten und Neuronen</stron...

Dieses Proktokol zielt darauf ab, eine Methode für die in vitro und in vivo mitochondriale Ca2+ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen bereitzustellen.

Bildgebung der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme in Astrozyten und Neuronen unter Verwendung von genetisch kodierten Ca2+ Indikatoren (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

Das Verfahren werden der Doktorand Zhe Zhang, der Forschungsspezialist Nannan Zhang, die Professoren Illker Ozden und Shinghua Ding demonstrieren. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Entwicklung von zelltypspezifischen Astrozytenpaaren und neuronen sowie der mitochondrialen Targeting-Methode für in vitro und in vivo mitochondriale Bildgebungszählungen unter Verwendung des genetisch kodierten Kalziumindikators GCaMP5G und 6s. Für die In-vitro- oder In-vivo-Bildgebung werden wir DNA-Plasmide konstruieren, die Astrozyten- oder Neuronen-spezifische Promotoren gfaABC1D oder CaMKII und genetisch kodierte Kalziumindikatoren, GCaMP5G/6s mit mitochondrialen Targeting-Sequenzen enthalten.Für die in vitro mitochondriale Calciumbildgebung transfizierten wir Astrozytenneuronen, die auf Glasabdeckungsrutschen kultiviert wurden, mit den oben genannten DNA-Plasmiden unter Verwendung der Lipofectamin-Methode. Die Bildgebung kann ein bis zwei Tage nach der Transfektion begonnen werden, indem die Glasabdeckungsrutschen unter einem Epifluoreszenz- oder Zwei-Photonen-Mikroskop in die Profusionskammer übertragen werden. Hier sind Beispiele für fluoreszierende Signale von Mitochondrien und einem Astrozyten, der GCaMP6s auf der linken Seite exprimiert, und für Mitochondrien in einem Neuron, die GCaMP5G auf der rechten Seite exprimieren.Für die In-vivo-Bildgebung haben wir das Serotyp-5-assoziierte Adenovirus für die Expression von Mito-GCaMP5G in Astrozyten und das Serotyp-9-assoziierte Adenovirus für die Expression von Mito-GCaMP6s in Neuronen hergestellt. Für stereotaktische Virusinjektionsoperationen haben wir die Maus zunächst mit 3% Isofluran betäubt. Später während der Operation wird der Isofluranspiegel auf 2% reduziert Nachdem das richtige Anästhesieniveau erreicht ist, werden die Haare über der Kopfhaut rasiert und die Maus auf einem stereosteuerlichen chirurgischen Instrument positioniert.Eine Augensalbe wird auf die Augen aufgetragen, um sie während der Operation zu schützen. Die Injektionsoperationen werden mit aseptischen Verfahren durchgeführt, einschließlich steriler Instrumente und aseptischer Techniken. Die chirurgischen Instrumente werden entweder durch Autoklavieren oder durch einen Heißperlensterilisator sterilisiert.Nachdem die Maus auf der Stereotax montiert ist, wird die Kopfhaut dreimal mit Betadin und 70% Ethanol gereinigt. Dann wird die Haut entlang der Bregma Lambda-Achse aufgeschnitten und die Vertikale wird durch einen Hochgeschwindigkeitsbohrer über die Zielposition gemacht. In dieser Arbeit zielten wir entweder auf den motorischen Kortex oder den Paracortex ab.Eine Hamilton-Spritze mit 33 Messgeräten, die einen assoziierten Adenovirus-Vektor trägt, wird durch das Loch in das Gehirn eingeführt und Vektoren werden im Zielbereich injiziert. Für die kortikale Verabreichung injizieren wir die Viruslösung in zwei Tiefen in mehreren Schritten. Zuerst führen wir die Nadel einen Millimeter tief in den Kortex ein.Nachdem wir dem Gehirn fünf Minuten Zeit gegeben haben, um sich zu erholen, bewegen wir die Nadel bis zu 700 Mikrometer tief und injizieren 500 Nanoliter Viruslösung. Nachdem die Injektion abgeschlossen ist, warten wir fünf Minuten, damit das Virus im Gehirn diffundieren kann. Und dann bewegen wir die Nadel bis zur zweiten Injektionsstelle in 300 Mikrometer Tiefe.Hier injizieren wir weitere 500 Nanoliter Viruslösung. Nachdem die Injektion abgeschlossen ist, warten wir 10 Minuten, um das Virus diffundieren zu lassen, und dann entfernen wir die Nadel aus dem Gehirn und schließen das Gratloch mit Knochenwachs oder Kwik-Sil. Schließlich wird die Haut mit Vetbond vernäht und die Maus wird auf einem Heizkissen geborgen, bevor sie in die Tiereinrichtung zurückgeschickt wird.Die Maus wird in mindestens drei Wochen für die In-vivo-Bildgebung bereit sein, was dem Zeitrahmen entspricht, in dem die GCaMP-Expression reift. Schädelfensterimplantationsoperationen werden auch unter Verwendung aseptischer Bedingungen durchgeführt, wie für Injektionsoperationen beschrieben. Die chirurgischen Verfahren des Schädelfensters sind identisch mit den chirurgischen Injektionsverfahren bis zur Schädelexposition.Sobald der Schädel freigelegt ist, werden Viertel einer Kraniotomie mit einem Durchmesser von 2-3 mm über dem vom Virus injizierten Bereich mit vier flachen Löchern markiert, die von einem Hochgeschwindigkeitsbohrer hergestellt werden, der an einem Manipulator befestigt ist. Dann wird der Abschnitt des Schädels an den Schluchten der Kraniotomie verdünnt, indem der Knochen vorsichtig und langsam in einem Kreis herumgebohrt wird, der diese vier Löcher verbindet. Sobald der Schädel an den Rändern dünn genug ist, wird der Knochen mit einer scharfen Pinzette angehoben und entfernt.Die freiliegende Dura mater kann für die Implantation des Schädelfensters entfernt oder intakt gehalten werden. Unser Schädelfenster besteht aus einem Glasabdeckungsschlupf mit einem Durchmesser von 3-5 Millimetern, wodurch in der Mitte eine etwa 300 Mikrometer dicke Silikonscheibe entsteht. Die Montage des Schädelfensters erfolgt, indem es über die Kraniotomie gelegt wird.Ein Stück Zahnstocher, das an einem Manipulator befestigt ist, wird verwendet, um das Schädelfenster sanft auf die Oberfläche des Gehirns zu drücken. Dann wird die Kante des Schädelfensters mit einer kleinen Menge Silikonkleber Kwik-Sil versiegelt. Schließlich wird das Schädelfenster in den Schädelrändern mit Dentalacryl fixiert.Es sollte darauf geachtet werden, dass das Dentalacryl leicht über die Kanten des Schädelfensters aufgetragen wird, um eine starke Verklebung zu gewährleisten. Wie viele andere Forschungsgruppen in der Vergangenheit implementiert haben, kann ein 1,2% Agarosegel zwischen dem Deckglas und dem Gehirn als Alternative zur Silikonscheibe verwendet werden. Nachdem das Schädelfenster sicher installiert ist, wird eine Metallplatte am Schädel befestigt.Diese Kopfplatte wird verwendet, um den Kopf der Maus auf der Bühne eines Zwei-Photonen-Mikroskops während der Bildgebungssitzungen zu fixieren. Mitochondriale Kalziumaufnahme in Astrozyten kann durch ATD-Anwendung ausgelöst werden, während mitochondriale Kalziumaufnahme in Neuronen durch Glutamat-Glycin-Anwendung in künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit mit Schwerkraft durch ein Perfusionssystem ausgelöst werden kann. Die Kalziumaufnahme in einzelnen Mitochondrien in Astrozyten und Neuronen kann dann beobachtet werden.Die folgenden Filme zeigen die mitochondriale Kalziumaufnahme in einem Astrozyten, der links durch ATP und rechts durch Glutamat und Glycin hervorgerufen wird. Die Bildgebung erfolgt durch das Sammeln von zeitrafften In-vivo-Zwei-Photonen-Bildern von mitochondrialen Fluoreszenzsignalen in Astrozyten und Neuronen mit einem Ultima-Zwei-Photonen-Mikroskopiesystem von Prairie Technologies, das mit einer Million Ti Sapphire Ultra einem Laser von Coherent ausgestattet ist. Wir nutzen die Anregungswellenlängen von 880 bis 910 Nanometern, die für die In-vivo-Bildgebung mit GCaMP5G und 6s optimal sind.Astrozyten und neuronenspezifische Expression von Mito-GCaMP5G und 6s und durch Kolokalisation der Astrozyten-spezifischen Markierung von SR101 oder neuronenspezifischem Marker NeuN erneut bestätigt. Die spontane mitochondriale Kalziumaufnahme in Astrozyten und Neuronen in vivo kann durch Zeitrafferbildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie beobachtet werden. Bilder zeigen spontane Kalziumerhöhungen in einzelnen Mitochondrien in einem Astrozyten auf der linken Seite und einem Neuron auf der rechten Seite.Unsere Ansätze sind nützlich für die zelltypspezifische mitochondriale Calciumbildgebung in vitro und in vivo. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die mitochondriale Kalziumaufnahme in Astrozyten und in Neuronen abbilden können.

imaging-mitochondrial-ca2-uptake-astrocytes-neurons-using-genetically

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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Bildgebung der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme in Astrozyten und Neuronen unter Verwendung von genetisch kodierten Ca2+ Indikatoren (GECIs) (Video) | JoVE Journal

Bildgebung der mitochondrialen Ca²⁺ Aufnahme in Astrozyten und Neuronen unter Verwendung von genetisch kodierten Ca²⁺ Indikatoren (GECIs)

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