Bildgebung der mitochondrialen Ca²⁺ Aufnahme in Astrozyten und Neuronen unter Verwendung von genetisch kodierten Ca²⁺ Indikatoren (GECIs)

Das Verfahren werden der Doktorand Zhe Zhang, der Forschungsspezialist Nannan Zhang, die Professoren Illker Ozden und Shinghua Ding demonstrieren. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Entwicklung von zelltypspezifischen Astrozytenpaaren und neuronen sowie der mitochondrialen Targeting-Methode für in vitro und in vivo mitochondriale Bildgebungszählungen unter Verwendung des genetisch kodierten Kalziumindikators GCaMP5G und 6s. Für die In-vitro- oder In-vivo-Bildgebung werden wir DNA-Plasmide konstruieren, die Astrozyten- oder Neuronen-spezifische Promotoren gfaABC1D oder CaMKII und genetisch kodierte Kalziumindikatoren, GCaMP5G/6s mit mitochondrialen Targeting-Sequenzen enthalten.

Für die in vitro mitochondriale Calciumbildgebung transfizierten wir Astrozytenneuronen, die auf Glasabdeckungsrutschen kultiviert wurden, mit den oben genannten DNA-Plasmiden unter Verwendung der Lipofectamin-Methode. Die Bildgebung kann ein bis zwei Tage nach der Transfektion begonnen werden, indem die Glasabdeckungsrutschen unter einem Epifluoreszenz- oder Zwei-Photonen-Mikroskop in die Profusionskammer übertragen werden. Hier sind Beispiele für fluoreszierende Signale von Mitochondrien und einem Astrozyten, der GCaMP6s auf der linken Seite exprimiert, und für Mitochondrien in einem Neuron, die GCaMP5G auf der rechten Seite exprimieren.

Für die In-vivo-Bildgebung haben wir das Serotyp-5-assoziierte Adenovirus für die Expression von Mito-GCaMP5G in Astrozyten und das Serotyp-9-assoziierte Adenovirus für die Expression von Mito-GCaMP6s in Neuronen hergestellt. Für stereotaktische Virusinjektionsoperationen haben wir die Maus zunächst mit 3% Isofluran betäubt. Später während der Operation wird der Isofluranspiegel auf 2% reduziert Nachdem das richtige Anästhesieniveau erreicht ist, werden die Haare über der Kopfhaut rasiert und die Maus auf einem stereosteuerlichen chirurgischen Instrument positioniert.

Eine Augensalbe wird auf die Augen aufgetragen, um sie während der Operation zu schützen. Die Injektionsoperationen werden mit aseptischen Verfahren durchgeführt, einschließlich steriler Instrumente und aseptischer Techniken. Die chirurgischen Instrumente werden entweder durch Autoklavieren oder durch einen Heißperlensterilisator sterilisiert.

Nachdem die Maus auf der Stereotax montiert ist, wird die Kopfhaut dreimal mit Betadin und 70% Ethanol gereinigt. Dann wird die Haut entlang der Bregma Lambda-Achse aufgeschnitten und die Vertikale wird durch einen Hochgeschwindigkeitsbohrer über die Zielposition gemacht. In dieser Arbeit zielten wir entweder auf den motorischen Kortex oder den Paracortex ab.

Eine Hamilton-Spritze mit 33 Messgeräten, die einen assoziierten Adenovirus-Vektor trägt, wird durch das Loch in das Gehirn eingeführt und Vektoren werden im Zielbereich injiziert. Für die kortikale Verabreichung injizieren wir die Viruslösung in zwei Tiefen in mehreren Schritten. Zuerst führen wir die Nadel einen Millimeter tief in den Kortex ein.

Nachdem wir dem Gehirn fünf Minuten Zeit gegeben haben, um sich zu erholen, bewegen wir die Nadel bis zu 700 Mikrometer tief und injizieren 500 Nanoliter Viruslösung. Nachdem die Injektion abgeschlossen ist, warten wir fünf Minuten, damit das Virus im Gehirn diffundieren kann. Und dann bewegen wir die Nadel bis zur zweiten Injektionsstelle in 300 Mikrometer Tiefe.

Hier injizieren wir weitere 500 Nanoliter Viruslösung. Nachdem die Injektion abgeschlossen ist, warten wir 10 Minuten, um das Virus diffundieren zu lassen, und dann entfernen wir die Nadel aus dem Gehirn und schließen das Gratloch mit Knochenwachs oder Kwik-Sil. Schließlich wird die Haut mit Vetbond vernäht und die Maus wird auf einem Heizkissen geborgen, bevor sie in die Tiereinrichtung zurückgeschickt wird.

Die Maus wird in mindestens drei Wochen für die In-vivo-Bildgebung bereit sein, was dem Zeitrahmen entspricht, in dem die GCaMP-Expression reift. Schädelfensterimplantationsoperationen werden auch unter Verwendung aseptischer Bedingungen durchgeführt, wie für Injektionsoperationen beschrieben. Die chirurgischen Verfahren des Schädelfensters sind identisch mit den chirurgischen Injektionsverfahren bis zur Schädelexposition.

Sobald der Schädel freigelegt ist, werden Viertel einer Kraniotomie mit einem Durchmesser von 2-3 mm über dem vom Virus injizierten Bereich mit vier flachen Löchern markiert, die von einem Hochgeschwindigkeitsbohrer hergestellt werden, der an einem Manipulator befestigt ist. Dann wird der Abschnitt des Schädels an den Schluchten der Kraniotomie verdünnt, indem der Knochen vorsichtig und langsam in einem Kreis herumgebohrt wird, der diese vier Löcher verbindet. Sobald der Schädel an den Rändern dünn genug ist, wird der Knochen mit einer scharfen Pinzette angehoben und entfernt.

Die freiliegende Dura mater kann für die Implantation des Schädelfensters entfernt oder intakt gehalten werden. Unser Schädelfenster besteht aus einem Glasabdeckungsschlupf mit einem Durchmesser von 3-5 Millimetern, wodurch in der Mitte eine etwa 300 Mikrometer dicke Silikonscheibe entsteht. Die Montage des Schädelfensters erfolgt, indem es über die Kraniotomie gelegt wird.

Ein Stück Zahnstocher, das an einem Manipulator befestigt ist, wird verwendet, um das Schädelfenster sanft auf die Oberfläche des Gehirns zu drücken. Dann wird die Kante des Schädelfensters mit einer kleinen Menge Silikonkleber Kwik-Sil versiegelt. Schließlich wird das Schädelfenster in den Schädelrändern mit Dentalacryl fixiert.

Es sollte darauf geachtet werden, dass das Dentalacryl leicht über die Kanten des Schädelfensters aufgetragen wird, um eine starke Verklebung zu gewährleisten. Wie viele andere Forschungsgruppen in der Vergangenheit implementiert haben, kann ein 1,2% Agarosegel zwischen dem Deckglas und dem Gehirn als Alternative zur Silikonscheibe verwendet werden. Nachdem das Schädelfenster sicher installiert ist, wird eine Metallplatte am Schädel befestigt.

Diese Kopfplatte wird verwendet, um den Kopf der Maus auf der Bühne eines Zwei-Photonen-Mikroskops während der Bildgebungssitzungen zu fixieren. Mitochondriale Kalziumaufnahme in Astrozyten kann durch ATD-Anwendung ausgelöst werden, während mitochondriale Kalziumaufnahme in Neuronen durch Glutamat-Glycin-Anwendung in künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit mit Schwerkraft durch ein Perfusionssystem ausgelöst werden kann. Die Kalziumaufnahme in einzelnen Mitochondrien in Astrozyten und Neuronen kann dann beobachtet werden.

Die folgenden Filme zeigen die mitochondriale Kalziumaufnahme in einem Astrozyten, der links durch ATP und rechts durch Glutamat und Glycin hervorgerufen wird. Die Bildgebung erfolgt durch das Sammeln von zeitrafften In-vivo-Zwei-Photonen-Bildern von mitochondrialen Fluoreszenzsignalen in Astrozyten und Neuronen mit einem Ultima-Zwei-Photonen-Mikroskopiesystem von Prairie Technologies, das mit einer Million Ti Sapphire Ultra einem Laser von Coherent ausgestattet ist. Wir nutzen die Anregungswellenlängen von 880 bis 910 Nanometern, die für die In-vivo-Bildgebung mit GCaMP5G und 6s optimal sind.

Astrozyten und neuronenspezifische Expression von Mito-GCaMP5G und 6s und durch Kolokalisation der Astrozyten-spezifischen Markierung von SR101 oder neuronenspezifischem Marker NeuN erneut bestätigt. Die spontane mitochondriale Kalziumaufnahme in Astrozyten und Neuronen in vivo kann durch Zeitrafferbildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie beobachtet werden. Bilder zeigen spontane Kalziumerhöhungen in einzelnen Mitochondrien in einem Astrozyten auf der linken Seite und einem Neuron auf der rechten Seite.

Unsere Ansätze sind nützlich für die zelltypspezifische mitochondriale Calciumbildgebung in vitro und in vivo. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die mitochondriale Kalziumaufnahme in Astrozyten und in Neuronen abbilden können.