Name: Obtención de imágenes de ca2+ mitocondrial en astrocitos y neuronas utilizando indicadores de Ca2+ codificados genéticamente (GECI) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Aprende a realizar imagen de calcio mitocondrial en astrocitos y neuronas utilizando indicadores GCaMP5G y GCaMP6s. Este protocolo permite estudiar la dinámica del calcio en tiempo real mediante microscopía de dos fotones.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) otorga R01NS069726 y R01NS094539 a SD. Agradecemos a Erica DeMers por la grabación de audio.

Los procedimientos que involucran animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Missouri-Columbia.
1. Construcción de plásmidos de ADN
NOTA: Para imágenes in vitro e in vivo, se construyen plásmidos de ADN que codifican GCaMP5G/6s con promotores específicos de astrocitos y neuronas y secuencias de orientación mitocondrial.
<ol><li>Insertar la secuencia dirigida a la matriz mitocondrial (MM) (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG17 en los sitios de clonación EcoRI y BamHI en la columna vertebral del plásmido del virus adenoasociado (AAV) pZac2.1 para obtener plásmidos que contengan promotor astrocítico gfaABC1D o promotor neuronal CaMKII18,19,20.</li>
	<li>Subclón GCaMP5G/6s en los sitios de clonación BamH I y Not 1 en los plásmidos anteriores para obtener nuevos plásmidos pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s y pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s que se dirigen a la expresión transgénica en mitocondrias en astrocitos y neuronas20,21 (Figura 1A).</li>
	<li>Preparar plásmidos de ADN pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G y pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s para transfección para estudio in vitro (Sección 2). Producir vectores AAV con serotipo 5 para astrocitos y serotipo 9 para neuronas para estudio in vivo 18 (Sección 3).</li>
</ol>2. Imágenes de Ca2+ mitocondrial in vitro en astrocitos y neuronas
<ol><li>Preparar astrocitos primarios de la corteza de ratones neonatales P1 y neuronas primarias de la corteza de embriones E15-1618,22,23,24,y cultivarlos en fundas de vidrio de 12 mm de diámetro en placas de 24 pocillos utilizando el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS) y medio basal neuronal (NBM) que contiene 2% de B27, respectivamente.</li>
	<li>Transfectar astrocitos y neuronas maduras con plásmidos pZac-gfaABC1D-GCaMP6s y pZac-CaMKII-GCaMP5G utilizando reactivo de transfección basado en lípidos para expresar GCaMP6s en las mitocondrias de los astrocitos y GCaMP5G en las mitocondrias de las neuronas18,20,21. Transfecta células en cada pozo con 0,5 μg de ADN, y cambia el medio 6 h más tarde. NOTA: Los astrocitos y las neuronas están listos para la obtención de imágenes 1-2 días después de la transfección.</li>
	<li>Realizar imágenes mitocondriales in vitro de Ca2+ 1-2 días después de la transfección.<ol>
<li>Transfiera los cubrehojas de vidrio cultivados con astrocitos o neuronas a la cámara de perfusión PH-1 bajo un microscopio de epifluorescencia o dos fotones.</li>
		<li>Estimular la absorción astrocítica mitocondrial de Ca2+ con 100 μM de ATP en ACSF, o estimular las mitocondrias neuronales con 100 μM de glutamato/10 μM de glicina20,25 (Figura 2 y Figura 3). NOTA: Los cambios en la solución de ACSF a ACSF que contienen ATP y glutamato/glicina están controlados por un sistema de perfusión ALA-VM821. La velocidad del cambio de solución se controla a 1-2 ml/min ajustando una válvula.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Imágenes mitocondriales in vivo de Ca2+ en astrocitos y neuronas
<ol><li>Preparaciones AAV.<ol>
<li>Preparar los siguientes vectores de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) utilizando los plásmidos de ADN preparados en la sección 1: vectores rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G y rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s. NOTA: En este experimento, se prepararon vectores rAAV del serotipo 5 para expresar GCaMP5G en mitocondrias en astrocitos y vectores rAAV del serotipo 9 para expresar GCaMP6s en mitocondrias en neuronas.</li>
	</ol></li>
	<li>Inyección estereotáxica de AAV.<ol>
<li>Anestesiar al ratón con 3% de isoflurano. NOTA: Más tarde durante la cirugía, los niveles de isoflurano se reducen al 2%.</li>
		<li>Después de que el ratón alcance un nivel quirúrgico de anestesia, según lo determinado por el pellizco de la cola y el dedo del pie, afeite el cabello sobre el sitio de la cirugía, la corteza motora o somatosensorial, con un recortador de cabello.</li>
		<li>Coloque el mouse en el dispositivo estereotáxico del mouse y fije la cabeza con barras para los oídos. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para protegerlos durante la cirugía. Use una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal del ratón a 37 °C durante toda la cirugía. NOTA: Realice la cirugía utilizando procedimientos asépticos. Todas las herramientas quirúrgicas deben esterilizarse en autoclave o en un esterilizador de cuentas calientes.</li>
		<li>Después de montar el ratón en el dispositivo estereotáxico, esterilice el cuero cabelludo con exfoliantes alternados a base de yodo y etanol al 70% tres veces. Haga una incisión en la línea media del cuero cabelludo para exponer el sitio de inyección.</li>
		<li>Abra la piel en el eje bregma-lamda y cree un orificio de rebabas de ~ 1 mm de diámetro con un taladro de alta velocidad en la ubicación de inyección prevista del motor o la corteza somatosensorial.</li>
		<li>Utilice una jeringa Hamilton de 33 G que contenga virus adenoasociados (vectores rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G [1 x 1011 GC] o vectores rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s [1 x 1011 GC]) para inyectar hasta 1 μL de virus en el área objetivo. NOTA: Por ejemplo, para la administración viral cortical, inyecte la solución del virus a dos profundidades en varios pasos. Primero, inserte la aguja a una profundidad de 1 mm desde la duramadre y espere 5 minutos para que el cerebro se recupere. Luego, mueva la aguja hasta ~ 700 μm de profundidad e inyecte 500 nL de la solución de virus a una velocidad de inyección de 10 nL / s usando una jeringa hamilton controlada por un controlador de bomba de microjeringa. Después de completar la inyección, espere 5 minutos para permitir que el virus se difunda en el cerebro. Luego, mueva la aguja hasta el segundo lugar de inyección a una profundidad de 300 μm. Aquí, inyecte 500 nL adicionales de la solución del virus. Espere 10 minutos para permitir que el virus se difunda en el cerebro.</li>
		<li>Cierre el cuero cabelludo y la piel con un adhesivo tisular. Deje que los ratones se recuperen en la almohadilla térmica. Envíe los ratones de regreso a la instalación de animales después de la recuperación.</li>
	</ol></li>
	<li>Intalación de ventana craneal e imágenes in vivo de dos fotones (2-P) de señales mitocondriales de Ca2+. NOTA: La implantación de la ventana craneal se realiza 3 semanas después de la inyección de AAV sobre la corteza motora o somatosensorial26,27,28,29. El carprofeno (10 mg/kg) se inyecta por vía subcutánea para aliviar el dolor potencial antes de la cirugía. Los procedimientos quirúrgicos de ventana craneal son idénticos a los procedimientos quirúrgicos de inyección de AAV y se realizan en condiciones asépticas.<ol>
<li>Anestesiar al ratón con 3% de isoflurano. NOTA: Esta es la dosis inicial y se reduce al 2% para la cirugía más adelante. Durante la toma de imágenes, se utiliza una inyección intraperitoneal (IP) de 130 mg de ketamina/10 mg de xilazina/kg de peso corporal disuelto en ACSF para la anestesia.</li>
		<li>Coloque el mouse en el dispositivo estereotáxico del mouse y fije la cabeza con barras para los oídos. Aplique ungüento oftálmico en los ojos. Use una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal del ratón a 37 °C durante toda la cirugía. NOTA: Todas las herramientas quirúrgicas deben ser esterilizadas.</li>
		<li>Haga una incisión de 5-8 mm de largo en la línea media del cuero cabelludo y retire un colgajo de piel con un par de tijeras.</li>
		<li>Después de exponer el cráneo, realice una craneotomía de 2.0-3.0 mm de diámetro utilizando un taladro de alta velocidad sobre el área inyectada por el virus (es decir, la corteza motora o la corteza somatosensorial, Figura 1B). Primero, haga cuatro agujeros pequeños y luego perfore a lo largo de un círculo que conecte los agujeros. Luego, levante y retire el hueso con tijeras afiladas y retírelo. La duramadre expuesta se puede quitar o mantener intacta para la impantación de la ventana craneal.</li>
		<li>Coloque una cubierta de vidrio de 3-5 mm de diámetro que lleve una silicona transparente sobre la craneotomía. Use un palillo de dientes para empujar la ventana craneal suavemente sobre la superficie del cerebro. Luego, selle el borde con una pequeña cantidad de adhesivo de silicona. NOTAS: Alternativamente, en lugar de disco de silicona, se puede usar un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1.2% entre el vidrio de la cubierta y el tejido cerebral.</li>
		<li>Finalmente, selle los bordes de la cubierta con cemento dental. Tenga cuidado de aplicar el cemento ligeramente en el borde de la ventana craneal para una unión fuerte. Coloque una placa de cabeza de metal hecha a medida en el cráneo con cemento dental. NOTA: La placa de metal se utiliza para fijar la cabeza del ratón a la etapa del microscopio 2-P durante la sesión de imágenes(Figura 1C).</li>
		<li>Agregue 0,5 ml de solución de ACSF sobre la cubierta de la ventana craneal para la inmersión en agua durante la toma de imágenes.</li>
		<li>Realizar imágenes time-lapse in vivo 2-P de mito-GCaMP5G en astrocitos y mito-GCaMP6s en neuronas con longitud de onda de 910 nm a través de la ventana craneal(Figura 1C)18,20,27. NOTA: Durante la toma de imágenes, los ratones están en la almohadilla térmica para mantener la temperatura fisiológica. Los ratones serán sacrificados inmediatamente después de que se complete la sesión de imágenes.</li>
		<li>Etiquetar astrocitos in vivo con sulforhodamine 101 (SR101) cuando sea necesario determinar la colocalización.<ol>
<li>Al final del paso 3.3.4, aplicar 100 μL de 100 μM SR101 en ACSF sobre la superficie cortical durante 1-5 min.</li>
			<li>Enjuague la superficie con ACSF para lavar el SR101 sin encuadernar. Utilizando imágenes 2-P, el co-etiquetado de mito-GCaMP5G y SR101 en astrocitos se puede observar 45-60 minutos más tarde (Figura 4A).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Griffiths, E. J., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+as+a+key+regulator+of+mitochondrial+ATP+production+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).</li>
<li>Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Ca2%2B+homeostasis%3A+mechanism%2C+role%2C+and+tissue+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities.</a> Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).</li>
<li>Llorente-Folch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulation+of+mitochondrial+respiration+maintains+ATP+homeostasis+and+requires+ARALAR%2FAGC1-malate+aspartate+shuttle+in+intact+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).</li>
<li>Burkeen, J. F., Womac, A. D., Earnest, D. J., Zoran, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+signaling+mediates+rhythmic+extracellular+ATP+accumulation+in+suprachiasmatic+nucleus+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (23), 8432-8440 (2011).</li>
<li>Duchen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+calcium-dependent+neuronal+death+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease.</a> Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 111-121 (2012).</li>
<li>Gouriou, Y., Demaurex, N., Bijlenga, P., De Marchi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+handling+during+ischemia-induced+cell+death+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium handling during ischemia-induced cell death in neurons.</a> Biochimie. 93 (12), 2060-2067 (2011).</li>
<li>Qiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+uniporter+Mcu+controls+excitotoxicity+and+is+transcriptionally+repressed+by+neuroprotective+nuclear+calcium+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium uniporter Mcu controls excitotoxicity and is transcriptionally repressed by neuroprotective nuclear calcium signals.</a> Nature Communications. 4, 2034(2013).</li>
<li>Filadi, R., Greotti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin+and+yang+of+mitochondrial+Ca2%2B+signaling+in+cell+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The yin and yang of mitochondrial Ca2+ signaling in cell physiology and pathology.</a> Cell Calcium. 93, 102321(2021).</li>
<li>Finkel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+mitochondrial+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of mitochondrial calcium.</a> Circulation Research. 116 (11), 1810-1819 (2015).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+The+calcium+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: The calcium connection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Yamada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+genetically+encoded+Ca2%2B+indicators+in+cortical+pyramidal+cells+and+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of genetically encoded Ca2+ indicators in cortical pyramidal cells and cerebellar Purkinje cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 5, 18(2011).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+green+fluorescent+protein+as+a+tool+for+visualizing+subcellular+organelles+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells.</a> Current Biology: CB. 5 (6), 635-642 (1995).</li>
<li>Xie, Y., Wang, T., Sun, G. Y., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+disruption+of+astrocytic+Ca2%2B+signaling+pathway+in+vivo+by+adeno-associated+viral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction.</a> Neuroscience. 170 (4), 992-1003 (2010).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFAP+promoter+elements+required+for+region-specific+and+astrocyte-specific+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression.</a> Glia. 56 (5), 481-493 (2008).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+mitochondrial+Ca2%2B+dynamics+in+astrocytes+using+cell-specific+mitochondria-targeted+GCaMP5G%2F6s%3A+Mitochondrial+Ca2%2B+uptake+and+cytosolic+Ca2%2B+availability+via+the+endoplasmic+reticulum+store%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store.</a> Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).</li>
<li>Zhang, N., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+mitochondrial+and+cytosolic+Ca2%2B+signals+in+cultured+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes.</a> Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).</li>
<li>Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-B-cell+colony-enhancing+factor+exerts+a+neuronal+protection+through+its+enzymatic+activity+and+the+reduction+of+mitochondrial+dysfunction+in+in+vitro+ischemic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models.</a> Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).</li>
<li>Wang, X., Li, H., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-B-cell+colony-enhancing+factor+protects+against+apoptotic+neuronal+death+and+mitochondrial+damage+in+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia.</a> Scientific Reports. 6, 32416(2016).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+NAMPT-mediated+NAD%2B+salvage+pathways+and+their+roles+in+bioenergetics+and+neuronal+protection+after+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury.</a> Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).</li>
<li>Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+deficits+in+parvalbumin+neuron+stimulation-evoked+network+activity+despite+recovery+of+dendritic+structure+and+excitability+in+the+somatosensory+cortex+following+global+ischemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).</li>
<li>Ding, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDing%2C+S+%22In+vivo+imaging+of+Ca2%2B+signaling+in+astrocytes+using+two-photon+laser+scanning+fluorescent+microscopy+in+Astrocytes%22">In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes</a>. Milner, R. , Humana Press. 545-554 (2012).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+IP3R2-mediated+Ca2%2B+signaling+pathway+in+astrocytes+ameliorates+neuronal+death+and+brain+damage+while+reducing+behavioral+deficits+after+focal+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke.</a> Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).</li>
<li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothrombosis+ischemia+stimulates+a+sustained+astrocytic+Ca2%2B+signaling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo.</a> Glia. 57 (7), 767-776 (2009).</li>
<li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+astrocytic+Ca2%2B+signals+contribute+to+neuronal+excitotoxicity+after+status+epilepticus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).</li>
<li>Gobel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-endoplasmic+reticulum+contacts+in+reactive+astrocytes+promote+vascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling.</a> Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).</li>
<li>Diaz-Garcia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+roles+of+calcium+in+rapid+control+of+neuronal+glycolysis+and+the+tricarboxylic+acid+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle.</a> eLife. 10, 64821(2021).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este artículo, proporcionamos un método y protocolo para obtener imágenes de señales mitocondriales de Ca2 + en astrocitos y neuronas. Implementamos estrategias específicas de mitocondrias y tipo de célula para expresar GECI GCaMP5G/6s. Para dirigirnos a GCaMP5G/6s en mitocondrias, incluimos una secuencia dirigida a mitocondrias en los plásmidos. Para expresar GCaMP5G/6s en astrocitos y neuronas in vivo,insertamos un promotor específico de astrocitos gfaABC1D y un promotor específico de neuronas Ca...

Las mitocondrias son orgánulos subcelulares dinámicos y se consideran como las centrales eléctricas celulares para la producción de energía. Por otro lado, las mitocondrias pueden absorber Ca2+ a la matriz en respuesta a las elevaciones locales o citosólicas de Ca2+. La absorción mitocondrial de Ca2+ afecta la función mitocondrial, incluidos los procesos metabólicos como las reacciones en el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y la fosforilación oxidativa, y regula las proteínas sensibles al Ca2+en condiciones fisiológicas1,2,3,4. La sobrecarga mitocondrial de Ca2+ también es un determinante para la muerte celular, incluyendo necrosis y apoptosis en diversos trastornos cerebrales5,6,7. Provoca la apertura de los poros de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTPs) y la liberación del cofactor caspasa, que inician la muerte celular apoptótica. Por lo tanto, es importante estudiar la dinámica y el manejo del Ca2+ mitocondrial en las células vivas para comprender mejor la fisiología y la patología celular.
Las mitocondrias mantienen la homeostasis de Ca2+ de la matriz a través de un equilibrio entre la absorción de Ca2+ y el eflujo. La absorción mitocondrial de Ca2+ está mediada principalmente por uniportadores mitocondriales de Ca2+ (MCU), mientras que el eflujo mitocondrial de Ca2+ está mediado por los intercambiadores Na+-Ca2+-Li+ (NCLX) y los intercambiadores H+/ Ca2 + (mHCX)8. El equilibrio puede ser perturbado a través de la estimulación de los receptores acoplados a proteínas G (GPCR)9. La homeostasis mitocondrial de Ca2+ también se ve afectada por la amortiguación mitocondrial por la formación de complejos insolubles xCa2+-xPO4x-xOH8.
Los cambios intracelulares y mitocondriales en la concentración de Ca2+ ([Ca2+]) pueden evaluarse mediante indicadores fluorescentes o luminiscentes de Ca2+. La unión de Ca2+ a los indicadores provoca modificaciones espectrales, lo que permite el registro de células libres [Ca2+]en tiempo real en células vivas. Actualmente hay dos tipos de sondas disponibles para monitorear los cambios de Ca2+ en las células: indicadores químicos orgánicos e indicadores de Ca2+ codificados genéticamente (GECI). En general, diferentes variantes con diferentes afinidades de Ca2+ (basadas en Kd),propiedades espectrales (longitudes de onda de excitación y emisión), rangos dinámicos y sensibilidades están disponibles para las preguntas biológicas bajo investigación. Aunque se han utilizado muchos indicadores sintéticos orgánicos de Ca2+ para imágenes de Ca2+ citosólico, solo unos pocos pueden cargarse selectivamente en la matriz mitocondrial para imágenes mitocondriales de Ca2+, siendo Rhod-2 el más utilizado (para revisiones ver10,11). Sin embargo, Rhod-2 tiene un gran inconveniente de fuga durante los experimentos de largo plazo; además, se divide entre mitocondrias, otros orgánulos y el citosol, dificultando las mediciones absolutas en diferentes subcompartimentos. Por el contrario, mediante el uso de promotores específicos de tipo celular y secuencias de orientación de compartimentos subcelulares, los GECI se pueden expresar en diferentes tipos de células y compartimentos subcelulares para imágenes de Ca2+ específicas de células y compartimentos in vitro o in vivo. Los indicadores GCaMP Ca2+ basados en la intensidad de fluorescencia de longitud de onda única han surgido recientemente como los principales GECI12,13,14,15,16. En este artículo, proporcionamos un protocolo para la orientación de las mitocondrias y la expresión específica del tipo celular de GCaMP5G y GCaMP6s (GCaMP5G / 6s) en astrocitos y neuronas, y la obtención de imágenes de la absorción mitocondrial de Ca2 + en estos tipos de células. Usando este protocolo, se puede revelar la expresión de GCaMP6G/6s en mitocondrias individuales, y se puede lograr la absorción de Ca2+ en resolución mitocondrial única en astrocitos y neuronas in vitro e in vivo.

<table><tbody><tr><td>Pomada de lágrimas artificiales</td><td>Rugby</td><td>NDC-0536-6550-91</td><td>83% vaselina blanca</td></tr><tr><td>Pegamento de cianoacrilato</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>3M Vetbond Adhesivo</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de disección</td><td>Nikon</td><td>SMZ 2B</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont con punta fina</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>para la extracción de</td></tr><tr><td>duramadre Deslizamientos de cubierta de vidrio, 0,13-0,17 mm de espesor</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td>para cubierta de ventana craneal</td></tr><tr><td>Microtaladro de alta velocidad</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-17</td><td>con broca para pulir huesos</td></tr><tr><td>Jeringa de inyección</td><td>Hamilton</td><td>2,5 ml</td><td>para inyección viral</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>VEDCO</td><td>NDC-50989-996-06</td><td>100 mg/kg de peso corporal</td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td>Artefactos de movimiento reductor Estructura</td></tr><tr><td>metálica</td><td>Hecho a medida</td><td>ver Fig. 1</td><td>para la fijación del cerebro a la etapa del microscopio</td></tr><tr><td>Controlador de bomba de microjeringa</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td>Controlador de velocidad de inyección</td></tr><tr><td>Dispositivo estereotáxico de ratón</td><td>Stoelting</td><td>51725</td><td>para sujetar ratones</td></tr><tr><td>Cámara de perfusión</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0284</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de perfusión</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>ALA-VM8</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica autorregulable</td><td>Fine Science Tools</td><td>21061</td><td>para prevenir la hipotermia de ratones</td></tr><tr><td>Sulforhodamina 101</td><td>Invitrogen</td><td>S-359</td><td>colorante fluorescente rojo para marcar astrocitos</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas, 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-12</td><td>para disección</td></tr><tr><td>Trephine</td><td>Fine Science Tools</td><td>18004-23</td><td>para la limpieza de material</td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>VEDCO</td><td>NDC-50989-234-11</td><td>10 mg/kg de peso corporal</td></tr></tbody></table>

obtención de imágenes de ca2+ mitocondrial en astrocitos y neuronas utilizando indicadores de ca2+ codificados genéticamente (geci)

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

El Ca2+ mitocondrial desempeña un papel fundamental en el control de la amortiguación citosólica del Ca2+, el metabolismo energético y la transducción de señales celulares. La sobrecarga de Ca2+ mitocondrial contribuye a diversas afecciones patológicas, incluida la neurodegeneración y la muerte celular apoptótica en enfermedades neurológicas. Aquí presentamos un enfoque molecular específico de tipo celular y dirigido a mitocondrias para imágenes mitocondriales de Ca2+ en astrocitos y neuronas in vitro e in vivo. Construimos plásmidos de ADN que codifican indicadores de Ca2+ codificados genéticamente (GECI) GCaMP5G o GCaMP6s (GCaMP5G/6s) dirigidos a mitocondrias con promotores específicos de astrocitos y neuronas gfaABC1D y CaMKII y secuencia dirigida a mitocondrias (mito-). Para las imágenes mitocondriales in vitro de Ca2+, los plásmidos se transfectaron en astrocitos y neuronas cultivados para expresar GCaMP5G/6s. Para las imágenes mitocondriales in vivo de Ca2+, se prepararon vectores virales adenoasociados (AVA) e inyectaron en los cerebros de los ratones para expresar GCaMP5G/6s en mitocondrias en astrocitos y neuronas. Nuestro enfoque proporciona un medio útil para obtener imágenes de la dinámica mitocondrial de Ca2 + en astrocitos y neuronas para estudiar la relación entre la señalización citosólica y mitocondrial de Ca2 +, así como las interacciones astrocito-neurona.

El objetivo de este estudio fue proporcionar una metodología para obtener imágenes de señales mitocondriales de Ca2+ utilizando GECI en astrocitos y neuronas in vitro e in vivo. Aquí se presentan los resultados de las imágenes mitocondriales de Ca2+ in vitro e in vivo.
Señalización in vitro mitocondrial de Ca2+ en astrocitos y neuronas cultivadas<b...

Este proctocol tiene como objetivo proporcionar un método para imágenes de Ca2+ mitocondrial in vitro e in vivo en astrocitos y neuronas.

Obtención de imágenes de ca2+ mitocondrial en astrocitos y neuronas utilizando indicadores de Ca2+ codificados genéticamente (GECI)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

Demostrando el procedimiento estarán el estudiante graduado Zhe Zhang, el especialista en investigación Nannan Zhang, los profesores Illker Ozden y Shinghua Ding. El objetivo general de este procedimiento es desarrollar astrocitos de pares específicos de tipo celular y las neuronas y el método de orientación mitocondrial para recuentos mitocondriales in vitro e in vivo de imágenes utilizando el indicador de calcio codificado genéticamente, GCaMP5G y 6s. Para la obtención de imágenes in vitro o in vivo, construiremos plásmidos de ADN que contengan promotores específicos de astrocitos o neuronas gfaABC1D o CaMKII e indicadores de calcio codificados genéticamente, GCaMP5G/6s con secuencias de orientación mitocondrial.Para la obtención de imágenes de calcio mitocondrial in vitro se transfectaron astrocitos de neuronas cultivados en trozos de cubierta de vidrio con los plásmidos de ADN antes mencionados utilizando el método lipofectamine. Las imágenes se pueden iniciar uno o dos días después de la transfección transfiriendo los resbalones de la cubierta de vidrio a la cámara de profusión bajo un microscopio de epifluorescencia o de dos fotones. Aquí hay ejemplos de señales fluorescentes de mitocondrias y un astrocito que expresa GCaMP6s a la izquierda, y para mitocondrias en una neurona, expresando GCaMP5G a la derecha.Para la obtención de imágenes in vivo, preparamos adenovirus asociados al serotipo 5 para la expresión de mito-GCaMP5G en astrocitos y adenovirus asociado al serotipo 9 para la expresión de mito-GCaMP6 en neuronas. Para las cirugías de inyección de virus estereotáxicos, primero anestesiamos al ratón con 3% de isoflurano. Más tarde, durante la cirugía, los niveles de isoflurano se reducen al 2% Después de que se alcanza el nivel adecuado de anestesia, el cabello sobre el cuero cabelludo se afeita y el ratón se coloca en un instrumento quirúrgico estereotax.Se aplica un ungüento oftálmico a los ojos para protegerlos durante la cirugía. Las cirugías de inyección se realizan mediante procedimientos asépticos, incluidos instrumentos estériles y técnicas asépticas. Los instrumentos quirúrgicos se esterilizan en autoclave o mediante un esterilizador de cuentas calientes.Después de montar el ratón en el estereotax, el cuero cabelludo se limpia con betadina y etanol al 70% tres veces. Luego, la piel se corta a lo largo del eje Bregma Lambda y la vertical se hace mediante un taladro de alta velocidad sobre la ubicación objetivo. En este trabajo, nos dirigimos a la corteza motora o al paracórtex.Una jeringa Hamilton de calibre 33 que transporta un vector de adenovirus asociado se inserta a través del orificio en el cerebro y los vectores se inyectan en el área objetivo. Para la administración cortical, inyectamos la solución de virus a dos profundidades en múltiples pasos. Primero, insertamos la aguja un milímetro de profundidad en la corteza.Después de dejar cinco minutos para que el cerebro se recupere, movemos la aguja hasta 700 micrómetros de profundidad, inyectamos 500 nano litros de solución de virus. Después de completar la inyección, esperamos cinco minutos para permitir que el virus se difunda en el cerebro. Y luego movemos la aguja hasta la segunda ubicación de inyección a 300 micrómetros de profundidad.Aquí, inyectamos otros 500 nano litros de solución de virus. Después de completar la inyección, esperamos 10 minutos para permitir que el virus se difunda y luego retiramos la aguja del cerebro y cerramos el orificio de rebaba con cera ósea o Kwik-Sil. Finalmente, la piel se sutura con Vetbond y el ratón se recupera en una almohadilla térmica antes de ser enviado de vuelta a la instalación de animales.El ratón estará listo para su uso para imágenes in vivo en un mínimo de tres semanas, que es el período de tiempo en el que madura la expresión de GCaMP. Las cirugías de implantación de ventanas craneales también se realizan mediante el uso de condiciones asépticas como se describe para las cirugías de inyección. Los procedimientos quirúrgicos de la ventana craneal son idénticos a los procedimientos quirúrgicos de inyección hasta el punto de exposición del cráneo.Una vez que el cráneo está expuesto, los cuartos de una craneotomía de 2-3 mm de diámetro sobre el área inyectada por el virus están marcados con cuatro agujeros poco profundos hechos por un taladro de alta velocidad conectado a un manipulador. Luego, la sección del cráneo, en las gargantas de la craneotomía, se adelgaza perforando cuidadosa y lentamente el hueso en un círculo, conectando estos cuatro agujeros. Una vez que el cráneo en los bordes es lo suficientemente delgado, entonces el hueso se levanta con pinzas afiladas y se retira.La duramadre expuesta se puede quitar o mantener intacta para la implantación de la ventana craneal. Nuestra ventana craneal consiste en una cubierta de vidrio deslizante de 3-5 milímetros de diámetro, creando un disco de silicona de aproximadamente 300 micras de espesor en el centro. El montaje de la ventana craneal se logra colocándola sobre la craneotomía.Un trozo de palillo de dientes unido a un manipulador se utiliza para empujar la ventana craneal suavemente sobre la superficie del cerebro. Luego, el borde de la ventana craneal se sella con una pequeña cantidad de adhesivo de silicona Kwik-Sil. Finalmente, la ventana craneal se fija en los bordes del cráneo con acrílico dental.Se debe tener cuidado al aplicar el acrílico dental ligeramente sobre los bordes de la ventana craneal para una unión fuerte. Como muchos otros grupos de investigación han implementado en el pasado, se puede usar un gel de agarosa al 1.2% entre el vidrio de la cubierta y el cerebro como una alternativa al disco de silicona. Después de que la ventana craneal se instala de forma segura, se adhiere una placa de metal al cráneo.Esta placa de cabeza se utilizará para fijar la cabeza del ratón en el escenario de un microscopio de dos fotones durante las sesiones de imágenes. La absorción de calcio mitocondrial en los astrocitos puede ser provocada por la aplicación de ATD, mientras que la absorción de calcio mitocondrial en las neuronas puede ser provocada por la aplicación de glicina de glutamato en el líquido cefalorraquídeo artificial, con gravedad a través de un sistema de perfusión. La absorción de calcio en las mitocondrias individuales en los astrocitos y las neuronas se puede observar.Las siguientes películas muestran la absorción de calcio mitocondrial en un astrocito provocado por ATP a la izquierda y en una neurona provocada por el glutamato y la glicina a la derecha. La obtención de imágenes se realiza mediante la recopilación de imágenes de dos fotones in vivo con lapso de tiempo de señales fluorescentes mitocondriales en astrocitos y neuronas con un sistema de microscopía de dos fotones Ultima de Prairie Technologies, que está equipado con un millón de lásers Ti Sapphire Ultra one de Coherent. Utilizamos las longitudes de onda de excitación de 880 a 910 nanómetros, que son óptimas para imágenes in vivo con GCaMP5G y 6s.Astrocitos y expresión específica de neuronas de mito-GCaMP5G y 6s y reconfirmada por co-localización del marcado específico de astrocitos de SR101 o marcador específico de neurona NeuN. La absorción espontánea de calcio mitocondrial en astrocitos y neuronas in vivo se puede observar mediante imágenes de lapso de tiempo utilizando microscopía de dos fotones. Las imágenes muestran aumentos espontáneos de calcio en las mitocondrias individuales en un astrocito a la izquierda y una neurona a la derecha.Nuestros enfoques son útiles para imágenes de calcio mitocondrial específicas del tipo celular in vitro e in vivo. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo obtener imágenes de la absorción de calcio mitocondrial en los astrocitos y en las neuronas.

imaging-mitochondrial-ca2-uptake-astrocytes-neurons-using-genetically

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

Un método para cargar subventricular (SVZ de zona) células con colorantes indicadores de calcio para el registro de la actividad de calcio se describe. El postnatal SVZ contiene células apretadas, incluyendo las células progenitoras neurales y neuroblastos. En lugar de utilizar carga baño se inyecta el medio de contraste por la presión en el interior del tejido que permite una mejor difusión de tinte.

Preparación de agudos Slices zona subventricular for Imaging Calcio

En este protocolo, actualizamos los recientes avances en imágenes...

Respuestas imágenes de calcio en las neuronas GFP-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón

Este video describe un ensayo basado en imágenes de microscopía confocal para medir la absorción de calcio mitocondrial en células cultivadas. El ensayo utiliza el colorante fluorescente sensible al calcio Rhod-2/AM para medir el calcio mitocondrial en células cultivadas permeabilizadas.

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Aquí se describe una adaptación de los protocolos utilizados para inducir la plasticidad homeostática en las neuronas para el estudio de la plasticidad de los receptores acoplados a proteínas G astrocíticos. Recientemente se utiliza para examinar los cambios en el grupo I mGluRs astrocítica en ratones jóvenes, el método se puede aplicar para medir la escala de varios GPCRs astrocitos, en el tejido de los ratones adultos in situ e in vivo, y para obtener una mejor apreciación de la sensibilidad...

La inducción de la plasticidad de astrocítico Receptores por manipulación de Neuronales cocción Precios

Las propiedades y funciones de las señales intracelulares de Ca2+ de los astrocitos en el cuerpo estriado permanecen incompletamente exploradas. Describimos métodos para expresar indicadores de calcio codificados genéticamente en astrocitos estriados utilizando virus adenoasociados del serotipo 2/5 (AAV2/5), así como procedimientos para obtener imágenes fiables de señales de Ca2+ dentro de astrocitos estriados in situ.

Imaging intracelular de Ca 2 + Las señales en estriatal astrocitos de ratones adultos a través de indicadores de calcio codificados genéticamente-

Aquí, presentamos dos protocolos para la medición de mitocondrial Ca2 + afluencia en mitocondrias aisladas y células cultivadas. Para mitocondrias aisladas, detallamos una placa base de lector Ca2 + importación de ensayo utilizando el Ca2 + sensible tinte verde-5N de calcio. Para las células cultivadas, se describe un método de microscopia confocal con el Ca2 + tinte Rhod-2/AM.

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Ca2 + indicadores genético codificados (GECIs) han cambiado radicalmente cómo in situ Ca2 + proyección de imagen se realiza. Para maximizar la recuperación de datos de esas grabaciones, análisis apropiado de señales de Ca2 + se requiere. Los protocolos en este trabajo facilitan la cuantificación de Ca2 + señales grabadas in situ utilizando Cartografía espacio-temporal y el análisis de partículas.

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Este artículo describe un protocolo para determinar las diferencias en el estado redox basal y las respuestas redox a las perturbaciones agudas en las neuronas primarias del hipocampo y cortical utilizando microscopía viva confocal. El protocolo se puede aplicar a otros tipos de células y microscopios con modificaciones mínimas.

Imágenes en vivo del estado redox de glutatión mitocondrial en neuronas primarias utilizando un indicador ratiométrico

Los métodos actuales describen un enfoque no ratiométrico para imágenes de calcio subcompartimentales de alta resolución in vivo en Caenorhabditis elegans utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente fácilmente disponibles.

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Un método de fotometría de fibra bicolor para registrar la actividad de las neuronas astrocitos en múltiples regiones cerebrales durante comportamientos de aprendizaje y memoria

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Obtención de imágenes de ca2+ mitocondrial en astrocitos y neuronas utilizando indicadores de Ca2+ codificados genéticamente (GECI) (Video) | JoVE Journal

Obtención de imágenes de ca²⁺ mitocondrial en astrocitos y neuronas utilizando indicadores de Ca²⁺ codificados genéticamente (GECI)

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