Rekonstitution der Msp1-Extraktionsaktivität mit vollständig gereinigten Komponenten

Die Verwendung von AAA-ATPasen zur Entfernung von Proteinen aus einer Lipiddoppelschicht ist ein häufiges Thema in der Proteinqualitätskontrolle. Ein mechanistisches Verständnis dieses wesentlichen Prozesses erfordert ein rekonstituiertes System. Die bisherige Rekonstitution mit AAA-ATPasen war komplex und heterogen.

Unser System ist einfach und vollständig definiert. Dies ermöglicht es uns, die AAA-ATPase Msp1, das Substrat und die Lipidumgebung zu manipulieren. Um zu beginnen, fügen Sie zuvor vorbereiteten Rekonstitutionspuffer, gereinigte Msp1- und TA-Proteine und Liposomen in einem PCR-Röhrchen hinzu und inkubieren Sie dann die Mischung für 10 Minuten auf Eis.

Schneiden Sie während der Inkubation die Spitze einer P200-Pipettenspitze auf einen Durchmesser von etwa 1/8 Zoll. Als nächstes das Röhrchen, das BioBeads enthält, gründlich schwenken, um eine gleichmäßige Mischung zu erhalten. Entfernen Sie dann schnell den Deckel und verwenden Sie die geschnittene P200-Pipettenspitze, um ein geeignetes Volumen der Perlen in ein leeres PCR-Röhrchen zu übertragen.

Sobald die 10-minütige Inkubation zur Rekonstitution abgeschlossen ist, entfernen Sie mit einer ungeschnittenen Pipettenspitze die gesamte Flüssigkeit aus den BioBeads. Übertragen Sie dann 100 Mikroliter der Rekonstitution mit den BioBeads in die Röhre und lassen Sie sie 16 Stunden lang auf einem Rad drehen. Drehen Sie am nächsten Tag das Röhrchen in einer PicoFuge, um die Perlen zu pelletieren, übertragen Sie dann das rekonstituierte Material in ein sauberes PCR-Rohr und halten Sie das Röhrchen auf Eis.

Um Proteine zu entfernen, die sich nicht in die Liposomen rekonstituieren konnten, balancieren Sie die Glutathion-Spinsäulen mit Extraktionspuffer, was typischerweise drei Waschrunden mit 400 Mikrolitern Puffer beinhaltet, gefolgt von einer Zentrifugation, um den Puffer zu entfernen. Als nächstes fügen Sie fünf Mikromol jedes Chaperons in das rekonstituierte Material hinzu, gefolgt von 100 Mikroliter Extraktionspuffer, wodurch das Volumen auf 200 Mikroliter steigt. Fügen Sie diese Mischung zu den äquilibrierten Glutathion-Spinsäulen hinzu, stecken Sie dann die Spinsäulen ein und drehen Sie sie für 30 Minuten, damit sich die Chaperone an das Harz binden können.

Drehen Sie die Spalten nach der Rotation kurz. Sammeln Sie den Durchfluss, bei dem es sich um das vorgereinigte Material handelt, das an aggregierten Proteinen erschöpft ist. Legen Sie es auf Eis und fahren Sie direkt mit dem Extraktionsassay fort.

Bereiten Sie Röhrchen für die SDB-PAGE-Analyse vor. Fügen Sie 45 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser in das Eingangsrohr, 40 Mikroliter Wasser in das Durchflussrohr und 16,6 Mikroliter 4X SDS-PAGE-Ladepuffer in jedes Rohr hinzu. Bereiten Sie für den Extraktionsassay die Extraktionsreaktion vor und erhöhen Sie das Endvolumen mit dem Extraktionspuffer auf 200 Mikroliter.

Dann wälzen Sie den Extraktionsassay in einem 30-Grad-Celsius-Hitzeblock für zwei Minuten vor. Um den Assay einzuleiten, geben Sie ATP in eine endgültige Konzentration von zwei Millimol hinzu. Drehen Sie die Röhre fünf Sekunden lang in einer PicoFuge und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius.

Nehmen Sie während der Inkubation eine fünf Mikroliter schwere Probe der Reaktion und geben Sie sie in das Eingangsröhrchen. Gleichen Sie auch eine Glutathion-Spin-Säule für jede Probe im Extraktionsassay aus, wie zuvor gezeigt. Sobald die 30-minütige Inkubation abgeschlossen ist, fügen Sie dem Röhrchen 200 Mikroliter Extraktionspuffer hinzu, wodurch das Gesamtvolumen auf 400 Mikroliter erhöht wird.

Dann fügen Sie diese Reaktion dem gleichgewichtigen Glutathionharz hinzu und lassen Sie es 30 Minuten bei vier Grad Celsius drehen. Drehen Sie nach der Rotation die Säulen, um den Durchfluss zu sammeln, und nehmen Sie dann eine 10-Mikroliter-Probe für das Durchflussrohr. Waschen Sie das Harz zweimal mit 400 Mikrolitern Extraktionspuffer und verwerfen Sie den Durchfluss nach jeder Wäsche.

Nach der dritten Wäsche den Durchfluss beibehalten und eine 50-Mikroliter-Probe für das Waschrohr entnehmen. Als nächstes bereiten Sie fünf Milliliter Elutionspuffer vor, indem Sie reduziertes Glutathion zu einer Endgültigen Konzentration von fünf Millimol im Extraktionspuffer hinzufügen. 200 Mikroliter des Elutionspuffers in die Spinsäule geben und fünf Minuten lang inkubieren.

Dann zentrifugieren Sie die Säule und sammeln Sie den Durchfluss. Wiederholen Sie den Elutionsschritt noch einmal. Nach der zweiten Elution nehmen Sie einen 50-Mikroliter-Aliquot aus der Elutionsprobe und geben Ihn in das Elutenröhrchen.

Nach dem Ausführen eines Western Blot kann die Extraktionseffizienz bestimmt werden, indem die Substratmenge in der elutierten Fraktion mit der Eingangsfraktion verglichen wird. Das Signal im Durchfluss zeigt eine gewisse Variabilität, ähnelt aber im Allgemeinen der Eingangsfraktion, und es gibt kein Signal in der Waschfraktion. Typischerweise gibt es einen Extraktionswirkungsgrad von etwa 10 % für die Positivkontrolle und einen Extraktionswirkungsgrad von ein bis 2 % für die Negativkontrolle.

Wenn die Rekonstitutionsbedingungen nicht optimiert sind, sind die Extraktionsmengen zwischen den positiven und negativen Proben vergleichbar. Diese Technik ermöglichte es unserem Labor, die biophysikalischen Eigenschaften des Substrats zu testen, die die Erkennung durch Msp1 beeinflussen.