Name: Selektive Reinigung von wilden Caenorhabditis-Nematoden zur Anreicherung von Darmmikrobiombakterien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Erfahren Sie eine Methode zur Anreicherung nicht kultivierbarer Darmmikrobiombakterien aus wilden Caenorhabditis-Nematoden. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Wirt-Mikrobe-Interaktionen.

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Vielen Dank an Dr. Christian Braendle und die Field Station Nouragues des Centre Nationale de la Recherche Scientifique (CNRS).

1. Induktion der Dauerbildung für wilde Nematoden auf NGM-Platten
<ol><li>Züchten Sie den wilden Caenorhabditis-Stamm auf Standard-NGM-Platten mit OP50-1 E. coli als Nahrungsquelle, nachdem Sie die Würmer mit einer unkulturierbaren Mikrobe von Interesse erhalten haben. Die Nematoden bei 20 °C inkubieren. HINWEIS: Die Standardtemperatur für das Wachstum von Caenorhabditis nematodes liegt zwischen 15-25 ° C, sollte jedoch empirisch bestimmt werden, um den Verlust der interessierenden Mikrobe zu verhindern.</li>
	<li>Verhungern Sie den Teller der Tiere bei 20 ° C für 4-5 Tage, bis alle OP50-1 verbraucht sind und die Mehrheit das Dauerstadium erreicht hat. HINWEIS: Dauers sind langlebige Larven, die sich aufgrund der fehlenden Nahrung entwickeln und schützende Nagelhaut haben.</li>
</ol>2. Die Nematoden waschen
<ol><li>Fügen Sie 5 ml M9-Minimalsalzmedien (42 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 8,6 mM NaCl, 19 mM NH4Cl) zu einer 6 cm großen Platte mit ausgehungerten Würmern hinzu.</li>
	<li>Mit einer sterilen Glaspipette und -zwiebel die M9 und die Würmer von der Platte pipettieren und in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführen.</li>
	<li>Mit einer klinischen Zentrifuge die Würmer im Röhrchen bei 1000 x g für 30 s bei Raumtemperatur nach unten drehen.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer sterilen 15-ml-Pipette den M9-Überstand über dem Pellet von Würmern und entsorgen Sie ihn. Stören Sie nicht die lebenden Würmer am Boden der Röhre, indem Sie etwa 50 μL M9 über den Würmern belassen.</li>
	<li>Geben Sie 10 ml M9 + 0,05% Triton X-100 in dasselbe Zentrifugenröhrchen und ziehen Sie die Kappe des Röhrchens ausreichend fest.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Röhrchen auf einem Nutator für 20 min bei Raumtemperatur, um die äußeren Mikroben zu entfernen. Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Nutator und drehen Sie die Würmer bei 1000 x g für 30 s nach unten.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer sterilen Pipette den M9-Überstand über dem Pellet von Würmern und entsorgen Sie ihn. Stören Sie nicht die lebenden Würmer am Boden der Röhre, indem Sie etwa 50 μL M9 über den Würmern belassen.</li>
	<li>Befolgen und wiederholen Sie die Schritte 2.5-2.8 noch dreimal.</li>
</ol>3. Desinfektion der Nematoden
<ol><li>Bereiten Sie ein Antibiotikum und eine SDS-Lösung in 10 ml M9-Puffer vor, indem Sie 0,25% SDS (250 μL 10% SDS), 50 μg/ml Carbenicillin, 25 μg/ml Kanamycin, 12,5 μg/ml Tetracyclin, 100 μg/ml Gentamycin, 50 μg/ml Streptomycin, 37,5 μg/ml Chloramphenicol und 200 μg/ml Cefotaxim hinzufügen (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Röhre, die Nematoden in der Antibiotikum- und SDS-Lösung enthält, über Nacht auf einem Nutator bei Raumtemperatur. HINWEIS: Alle Nicht-Dauerwürmer und Embryonen werden sterben, aber viele der Dauerwürmer werden diesen Reinigungsprozess überleben.</li>
</ol>4. Entfernen des Antibiotikums und der SDS-Lösung
<ol><li>Drehen Sie die Würmer in der Röhre bei 1000 x g für 1 min bei Raumtemperatur nach unten. Entfernen Sie mit einer sterilen Pipette den Überstand aus dem Zentrifugenröhrchen, ohne die Würmer am Boden des Röhrchens zu stören.</li>
	<li>Fügen Sie 10 ml M9 + 0,05% Triton X-100 hinzu und ziehen Sie die Kappe des Rohrs ausreichend fest. Das Röhrchen auf einem Nutator für 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Nutator und drehen Sie die Würmer bei 1000 x g für 1 min herunter. Befolgen und wiederholen Sie die Schritte 4.2-4.3 dreimal.</li>
	<li>Lassen Sie das Wurmpellet nach der letzten Wäsche ungestört unten in 100 μL der Lösung und entsorgen Sie den Rest.</li>
</ol>5. Vermehren Sie einen sauberen Nematodenstamm
<ol><li>Mit einer sterilen Glaspipette 100 μL des Überstands und des Pellets in die Mitte einer 10 cm NGM-Platte geben, die mit OP50-1 ausgesät ist. Lassen Sie die Platte trocknen, ohne die Flüssigkeit in der Mitte zu stören.</li>
	<li>Lassen Sie die Dauers 5-10 min aus der Mitte und durch den OP50-1-Rasen kriechen.</li>
	<li>Nehmen Sie vorsichtig eine einzelne Dauer auf und geben Sie sie auf eine 6 cm NGM-gesäte Platte. Insgesamt nehmen Sie mindestens 10 Dauers und platten sie in einzelne 6 cm NGM-Platten, die mit OP50-1 (insgesamt 10 Platten) ausgesät sind.</li>
	<li>Die Platten 4-5 Tage bei 20 °C inkubieren, bis die Dauer gewachsen ist und die nachfolgende Generation (F1) das Erwachsenenstadium erreicht hat. Überprüfen Sie alle Platten visuell auf Kontamination, die als mikrobielles Wachstum ohne OP50-1 angesehen wird.</li>
	<li>Überprüfen Sie für jede saubere Platte die Ausbreitung der interessierenden Mikrobe mittels Normarski oder Fluoreszenzmikroskopie, wie z. B. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)12, abhängig vom interessierenden Phänotyp.</li>
</ol>6. Intestinale Dissektion und PCR-Identifizierung mikrobieller Spezies
<ol><li>Züchten Sie Tiere bei 20 ° C für 3-4 Tage, damit sie verhungern und die Menge an OP50-1-Bakterien reduzieren können. Fügen Sie 5 ml M9-Medien auf die Platte der ausgehungerten Würmer hinzu.</li>
	<li>Mit einer sterilen Glaspipette und -zwiebel die M9 + -Würmer von der Platte pipettieren und in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführen.</li>
	<li>Mit einer klinischen Zentrifuge die Würmer im Röhrchen bei 1000 x g für 30 s bei Raumtemperatur nach unten drehen.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer sterilen 15-ml-Pipette den Überstand aus dem Zentrifugenröhrchen, ohne die lebenden Würmer am Boden des Röhrchens zu stören.</li>
	<li>Fügen Sie 10 ml M9 + 0,05% Triton X-100 hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen 20 Minuten lang auf einem Nutator, um externe Mikroben zu entfernen. Wiederholen Sie dies viermal, um die Würmer zu waschen.</li>
	<li>Nach der letzten Wäsche mit einer sterilen Pipettenspitze den Überstand entfernen, ohne das Pellet am Boden in 100 μL der Lösung zu stören.</li>
	<li>Mit einer sterilen Pipettenspitze M9 und die Würmer auf eine ungesetzte NGM-Platte geben und die Platte trocknen lassen, während die Würmer 20 Minuten lang herumkriechen, um OP50-1 aus der Nagelhaut und dem Darm zu entfernen.</li>
	<li>Geben Sie 250 μL M9 auf die getrocknete Platte und verwenden Sie eine Glaspipette, um M9 + Würmer auf eine neue ungesetzte NGM-Platte zu übertragen. Lassen Sie die Platte wieder trocknen und lassen Sie die Würmer 20 Minuten lang herumkriechen.</li>
	<li>Fügen Sie 250 μL M9 auf die Platte auf und übertragen Sie 100 μL der M9 + Würmer auf ein sauberes Uhrglas.</li>
	<li>Enthaupten Sie die Nematoden mit zwei sterilen 26 G-Spritzennadeln, indem Sie den Wurm mit einer Nadel festhalten und mit der anderen Nadel den Wurm schneiden. Nach der Enthauptung werden der Darm (körnig) und die Gonade (transparent) aus dem Körper auf natürliche Weise aus dem Körper kommen.</li>
	<li>Schneiden Sie ein Stück des freiliegenden Darms ab, indem Sie den Darm mit einer Nadel festhalten und mit der anderen schneiden. HINWEIS: Wenn möglich, überprüfen Sie mit Normarski-Mikroskopie, FISH oder Immunhistochemie, ob die interessierende Mikrobe noch im Everted-Darm vorhanden ist23.</li>
	<li>Übertragen Sie einen einzelnen sezierten Darm in ein 0,5 ml PCR-Röhrchen mit 10 μL sterilem Wasser. Wiederholen Sie dies für insgesamt mindestens 5 PCR-Röhrchen, die Därme von verschiedenen Tieren enthalten.</li>
	<li>Die PCR-Röhrchen bei -80 °C für mindestens 5 min einfrieren. Nehmen Sie die PCR-Röhrchen aus dem Gefrierschrank und tauen Sie die Proben auf.</li>
	<li>Pipettieren Sie die Flüssigkeit einige Male auf und ab, um die Bakterien vom Darm zu trennen.</li>
	<li>PcR mit universellen Primerpaaren gegen die DNA-Sequenz der kleinen ribosomalen Untereinheit von Bakterien, Hefe oder Mikrosporidien durchführen, abhängig von der vermuteten Art der Mikrobe. HINWEIS: Beispielsweise ist in Tabelle 1 ein Beispielprotokoll mit universellen bakteriellen 16S-Primern dargestellt.</li>
	<li>Reinigen Sie das Amplikon mit einem filterbasierten DNA-Reinigungs- und Konzentrationskit (siehe Materialtabelle) und führen Sie eine Sanger-Sequenzierung durch.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Identifizierung von Mikroben aus wild isolierten Caenorhabditis-Nematoden mit einer Reihe von Reinigungsverfahren. Zahlreiche Mikroben sind mit wild isolierten Nematoden assoziiert, und einige von ihnen haben aufregende Phänotypen, die für zukünftige Studien zu Wirt-Mikroben-Interaktionen und angeborener Immunität verwendet werden können. Viele kultivierbare Mikrobiome und pathogene Bakterien wurden aus wilden Caenorhabditis-Nematoden unter Verwendung von Standardtechniken für das In-vitro-Bakterienwachstum isoliert25,26. Allerdings können nicht alle Mikroben in vitro kultiviert werden, und es wird notwendig, sie in wilden Nematoden anzureichern. Einige Mikroben haben ein resistentes Sporenstadium, wie Mikrosporidien, und hohe Konzentrationen von SDS können verwendet werden, um die meisten Bakterien und Pilze abzutöten, was eine spezifische Anreicherung von Sporen ermöglicht12. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Anreicherung von nicht kultivierbaren Darmmikroben dar, die nicht gegen SDS und Antibiotikabehandlung resistent sind.
Die hier vorgestellte Technik nutzt die Umweltresistenz, die bei Dauertieren aufgrund physiologischer Veränderungen wie der Stärkung der Kutikula, der Unterdrückung des Pharynxpumpens und der Abdeckung des Mundes mit einem Bukkalpfropfen beobachtet wird27. Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist die inkubation über Nacht mit verschiedenen Antibiotika und 0,25% SDS. Dieser Schritt wird verwendet, um alle externen Mikroben abzutöten, während die inneren Mikroben intakt bleiben. Während nachgewiesen wurde, dass C. elegans Dauers SDS-Konzentrationen von 10% für 30 min27 überlebt, verwendet dieses Protokoll eine moderate, aber verlängerte Inkubation, um nicht nur Mikroben abzutöten, sondern Bakterien weiter Antibiotika auszusetzen. Darüber hinaus kann eine moderate Konzentration von SDS dazu beitragen, dass Dauers von anderen Caenorhabditis-Arten überleben, da die Exposition von C. tropicalis gegenüber 1% SDS über Nacht zum Tod aller Dauertiere führte. Wenn alle Daueren absterben, sollten die Konzentration von SDS und/oder die Dauer der Exposition gegenüber SDS reduziert werden. Umgekehrt, wenn die F1-Erzeugungsplatten nach der Reinigung noch sichtbare Verunreinigungen aufweisen, sollten die SDB-Konzentration und die Inkubationszeit erhöht werden.
Ein weiterer kritischer Schritt ist die Isolierung einzelner Dauertiere nach der Reinigung. Dieser Schritt ist entscheidend, da nicht alle Tiere nach SDS und Antibiotikabehandlung sauber sind. Daher werden die Tiere in der Mitte einer 10 cm NGM-Platte mit OP50-1 platziert und radial nach außen kriechen gelassen. Oft ist es am besten, mehr distale Tiere zu pflücken, da ein ausgedehntes Kriechen durch OP50-1 dazu beizutragen scheint, potenziell überlebende Mikroben, die an der Kutikula befestigt sind, zu entfernen. Dies führt jedoch zu einer Einschränkung des Protokolls, da es schwieriger sein wird, sich für eine Mikrobe von Interesse anzureichern, wenn sie nicht mit hoher Frequenz in der Population vorhanden ist. Hier waren die anhaftenden Alphaproteobakterien in 90%-95% der Bevölkerung vorhanden; Daher hatten die meisten sauberen Platten das Mikrobiom-Bakterium. Wenn jedoch eine Mikrobe von Interesse in einer viel geringeren Häufigkeit in der Bevölkerung vorhanden ist, kann es notwendig sein, viel mehr F1-Platten zu screenen.
Dieses Protokoll könnte wahrscheinlich verwendet werden, um eine beliebige Anzahl von nicht kultivierbaren Mikroben von Interesse zu isolieren, die in wilden Nematoden gefunden werden. Die Mikrobe muss sich jedoch in einem gewebe befinden, das durch die Dauerkutikula geschützt ist, in der Lage ist, bei Dauertieren zu überleben, und einen beobachtbaren Phänotyp im Wirt haben. Als solche kann diese Technik verwendet werden, um andere Mikrobiombakterien im Darmlumen neben den hier beschriebenen Alphaproteobakterienarten anzureichern, einschließlich Bakterien, die nicht haften. Das Protokoll wurde auch verwendet, um ein fakultatives intrazelluläres Bakterium, Bordetella atropi, anzureichern, das den Fadenwurm Oscheius tipulae28 infiziert. Nach der Anreicherung wurde festgestellt, dass B. atropi Kolonien auf NGM-Platten bildet, was zeigt, dass eine Mikrobe von Interesse in vitro als kultivierbar entdeckt werden kann, sobald schneller wachsende Verunreinigungen entfernt werden. Diese Technik würde wahrscheinlich für Mikrosoliden und Viren, einschließlich des Orsay-Virus, angesichts dieser Fähigkeit, ein intrazelluläres Bakterium anzureichern, funktionieren. Diese Mikroben müssen jedoch in der Lage sein, den Übergang in und aus der Dauer zu überleben.
Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass dieses Protokoll zwar in einem Labor der Biosicherheitsstufe 1 durchgeführt werden kann, dass jedoch eine sterile Technik beibehalten werden muss, um eine weitere mikrobielle Kontamination zu verhindern. Das Protokoll kann entsprechend den Bedürfnissen des Forschers geändert werden, einschließlich der Art / Konzentration von Antibiotika, des Prozentsatzes von SDS und / oder der Zugabe von Antimykotika wie Nystatin. Oft kann die Anzahl der kontaminierenden Mikroben, die in einem wild isolierten Nematoden gefunden werden, dramatisch variieren. Hier wurde der scheinbare Verlust des Nicht-OP50-1-E . coli-Wachstums auf NGM-Platten als Anzeige für einen sauberen Nematodenstamm verwendet. Es können jedoch nicht kultivierbare Populationen kontaminierender Mikroben vorhanden sein, daher ist es wichtig, eine Metagenomik-Methode wie die 16S-rRNA-Amplikon-Sequenzierung durchzuführen, um das Ausmaß der Kontamination zu sehen26. Sobald der Wurmstamm gereinigt ist, kann er eingefroren und für zukünftige Studien aufbewahrt werden. Insgesamt ermöglicht dieses Protokoll den Forschern, unkulturierbare Mikroben in wilden Nematoden anzureichern, so dass sie Die Auswirkungen auf die Fitness des Wirts untersuchen, Phänotypen von Kolonisation oder Infektion charakterisieren und genetische Werkzeuge nutzen können, um die Mechanismen zu verstehen, die den Wirt-Mikroben-Interaktionen zugrunde liegen.

Der genetische Modellorganismus C. elegans ist ein ausgezeichnetes In-vivo-System zur Untersuchung von Wirt-Mikroben-Interaktionen1,2. Sie haben im Vergleich zu anderen Tieren eine relativ einfache Physiologie, doch ein Großteil ihrer Zellbiologie ähnelt grundsätzlich den Säugetieren, was sie zu einem guten Modell für die biologische Forschung macht1,3,4. Darüber hinaus sind sie mikroskopisch klein, pflegeleicht und bleiben während ihrer kurzen Lebensdauer transparent. Diese Eigenschaften ermöglichen schnelle Untersuchungen der Mechanismen, die die Wirt-Mikroben-Interaktionen steuern, und die Visualisierung von In-vivo-Infektionen und Kolonisationen der genetisch biegsamen Wirte5,6. Schließlich reagiert C. elegans schnell auf bakterielle, Pilz- und Virusinfektionen, was sie zu einem ausgezeichneten Modell für die Untersuchung von Wirt-Mikroben-Interaktionen und des Darmmikrobioms macht7,8,9.
Eine Zunahme der Probenahme von wilden C. elegans und anderen Nematoden hat die Erforschung der Ökologie freilebender Nematoden und der natürlichen genetischen Variation ermöglicht10,11. Gleichzeitig hat die Probenahme auch die Entdeckung natürlich vorkommender biologischer Krankheitserreger und Mikroben, die mit C. elegans interagieren, erhöht12,13,14,15, was zur Etablierung vieler Wirt-Mikroben-Modellsysteme führte, die Interaktionen mit Viren, Bakterien, Mikrosporidien, Oomyceten oder Pilzen untersuchen16,17,18,19,20 . Typischerweise kommt wilde C. elegans in verrottenden Stängeln und Früchten vor, oft in gemäßigteren Klimazonen, und meistens sind sie selbst reproduzierend21. Wenn diese Proben ins Labor gebracht werden, werden wilde Nematoden in klonale Populationen isoliert, die eine Reihe von assoziierten Mikrobiota tragen. Bei der Entdeckung neuer Mikroben von Interesse in Caenorhabditis nematodes werden Tiere oft direkt auf Infektion oder Kolonisierung durch Mikroskopie mit leicht sichtbaren Phänotypen untersucht. Zum Beispiel kann eine Virusinfektion als Zerfall von Darmstrukturen visualisiert werden, und mikrosporidische Stadien können in Wirtszellen als Sporen oder Meronts gesehen werden14,22. Wenn eine Mikrobe von Interesse für zukünftige Untersuchungen entdeckt wird, muss sie von den anderen kontaminierenden Mikroben in den wilden Nematoden getrennt werden, damit sie isoliert untersucht werden kann. In vielen Fällen kann die interessierende Mikrobe nicht in vitro kultiviert werden, so dass es unerlässlich ist, die Mikrobe im Wirtsnematoden anzureichern.
Zum Beispiel beschreibt dieses Protokoll ein wildes Isolat von C. tropicalis , das ein Bakterium enthält, das sich im Darmlumen von Nematoden ansiedelt und direktional an den Darmepithelzellen haftet. Phänotypisch wächst das Bakterium senkrecht entlang der Innenseiten des Darmlumens und verleiht ihm ein borstenartiges Aussehen, das auf einem Standard-Normarski-Mikroskop in allen Stadien des Tieres, einschließlich des Dauerstadiums, sichtbar gemacht wird. Die Platte des Nematodenwachstumsmediums (NGM), auf der dieser wilde C. tropicalis-Stamm gezüchtet wurde, enthielt eine sichtbare Kontamination mit anderen Mikroben. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um zusätzliches kontaminierendes mikrobielles Wachstum auf den Platten zu reduzieren, um dieses unbekannte anhaftende Bakterium zu untersuchen. Die Nematoden wurden in das Dauerstadium gezwungen, um die Bakterien im Lumen zu schützen, und dann mit einer Reihe von Wäschen gereinigt. Anschließend wurde die unbekannte Bakterienart durch Dissektion des Darms und PCR-Amplifikation der 16S-Ribosom-DNA zur Sequenzierung identifiziert.
Insgesamt kann dieses Protokoll potenziell jede Mikrobe von Interesse anreichern, die mit einem wild gefangenen Nematoden verbunden ist. Anschließend identifizieren die Forscher die Zielmikrobe, visualisieren In-vivo-Infektions - oder Kolonisationsphänotypen durch Mikroskopie und untersuchen Die Auswirkungen auf die Wirtsfitness oder andere Aspekte von Wirt-Mikroben-Interaktionen. Die Isolierung und Untersuchung neuartiger mikrobieller Spezies, die mit Caenorhabditis nematoden interagieren, kann die genetischen Mechanismen der Wirtsimmunität und neue Paradigmen von Wirt-Mikroben-Interaktionen aufdecken, die für mikrobielle Pathogenese und Mikrobiomstudien relevant sind.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>AM9822</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Nadel - 26 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C1389-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaxim</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C7039-500mg</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C0378-25G</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Reinigungs- und Konzentrator-Kit</td><td>Zymo Research</td><td>11-303C</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Polymerase</td><td>Fisher Scientific</td><td>EP0711</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G1264-250mg</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Millipore-Sigma</td><td>K1876-1G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P-286</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-671</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-661</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S6501-50G</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T7660-5G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-151</td><td></td></tr><tr><td>Uhrenbrille</td><td>VWR</td><td>470144-850</td><td></td></tr></tbody></table>

selektive reinigung von wilden caenorhabditis-nematoden zur anreicherung von darmmikrobiombakterien

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Caenorhabditis elegans (C. elegans) hat sich als hervorragendes Modell für die Untersuchung von Wirt-Mikroben-Interaktionen und des Mikrobioms, insbesondere im Kontext des Darms, erwiesen. Vor kurzem hat die ökologische Probenahme von wilden Caenorhabditis-Nematoden eine Vielzahl von assoziierten Mikroben entdeckt, darunter Bakterien, Viren, Pilze und Mikrosporidien. Viele dieser Mikroben haben interessante Kolonisations- oder Infektionsphänotypen, die weitere Studien rechtfertigen, aber sie sind oft unkulturierbar. Dieses Protokoll stellt eine Methode dar, um die gewünschten Darmmikroben in C. elegans und verwandten Nematoden anzureichern und das Vorhandensein der vielen kontaminierenden Mikroben, die an der Kutikula haften, zu reduzieren. Dieses Protokoll beinhaltet das Zwingen von Tieren in das Dauerstadium der Entwicklung und die Verwendung einer Reihe von Antibiotika- und Waschmitteln, um externe Kontaminationen zu entfernen. Da Dauertiere physiologische Veränderungen aufweisen, die Nematoden vor rauen Umweltbedingungen schützen, werden alle Darmmikroben vor diesen Bedingungen geschützt. Aber damit die Anreicherung funktioniert, muss die Mikrobe von Interesse erhalten bleiben, wenn sich Tiere zu Dauer entwickeln. Wenn die Tiere das Dauerstadium verlassen, werden sie einzeln in einzelne Linien vermehrt. F1-Populationen werden dann für gewünschte Mikroben oder Infektionsphänotypen und gegen sichtbare Kontamination ausgewählt. Diese Methoden werden es den Forschern ermöglichen, unkulturierbare Mikroben im Darmlumen anzureichern, die Teil des natürlichen Mikrobioms von C. elegans und intrazellulären Darmpathogenen sind. Diese Mikroben können dann auf Kolonisations- oder Infektionsphänotypen und ihre Auswirkungen auf die Wirtsfitness untersucht werden.

Ein wilder C. tropicalis-Stamm (JU1848) wurde aus faulen Palmenfrüchten im Nouragues-Wald von Französisch-Guayana isoliert (Abbildung 1A)24. Es wurde festgestellt, dass dieser Stamm dünne Mikroben hat, die das Lumen des Darms in gerichteter Weise besiedeln (Abbildung 1B). Diese Mikrobe wurde leicht über die Kokultur mit dem Stamm JU1848 auf den C. elegans-Stamm N2 übertragen, wo sie das Darmlumen in ähnlicher Weise besiedelte.
Die Vermehrung von JU1848 auf Standard-NGM-Platten, die mit E. coli OP50-1 über mehrere Generationen ausgesät wurden, führte kontinuierlich zu einer sichtbaren Kontamination, die als verschiedene dunkle, schleimige Kolonien auf und neben dem OP50-1-Rasen zu sehen war (Abbildung 2A). Ein Teller wilder JU1848 wurde ausgehungert, um Tiere in die Dauer zu zwingen und wie beschrieben gereinigt. Einzelne Dauertiere, die die Reinigung überlebten, wurden auf einzelne 6 cm NGM-Platten plattiert, die mit OP50-1 ausgesät wurden und 4 Tage bei 20 °C wachsen durften. Mehrere Platten von F1-Nachkommen wurden ohne sichtbare mikrobielle Kontamination beobachtet (Abbildung 2B). Es wurde nachgewiesen, dass die F1-Nachkommen noch anhaftende Bakterien im Lumen des Darms enthalten (siehe unten).
Saubere JU1848-Tiere wurden gewaschen und enthauptet, um Darmstücke zu isolieren, wie im Protokoll beschrieben (Schritte 6.1-6.12). Anhaftende Bakterien im Lumen des sezierten Darms wurden mittels Nomarski-Mikroskopie nachgewiesen (Abbildung 3). Die Mikrobe im Lumen von JU1848 wurde verdächtigt, ein Bakterium zu sein, so dass der sezierte Darm als Vorlage für die PCR mit universellen bakteriellen 16S-Primern, 27F und 1492R verwendet wurde. Aus insgesamt sechs einzelnen sezierten Eingeweiden wurden die PCR-Produkte über Sanger sequenziert, und saubere Chromatographen zeigten, dass alle sechs Sequenzen identisch waren. Anhand dieser Sequenzen wurde dieses Bakterium als neue Spezies in der Klasse Alphaproteobakterien identifiziert, konnte aber nicht in eine bekannte Ordnung oder Gattung eingeordnet werden (Ergänzungsdatei 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62937/62937fig01.jpg"> Abbildung 1: Anhaftende Bakterien, die das Lumen eines wilden C. tropicalis besiedeln. (A) Feldprobenbild von faulen Euterpe sp. (Familie: Arecaceae) Palmenfrüchten im Nouragues-Wald von Französisch-Guayana. (B) Nomarski-Bild des Stammes JU1848 mit Tausenden von langen, dünnen Bakterien, die im Lumen (lu) des Wirtsdarms (in) ein bürstenartiges Aussehen bilden. Die bakteriellen (ba) Schichten, die den Darm bedecken, sind mit Klammern ([) gekennzeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62937/62937fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62937/62937fig02.jpg"> Abbildung 2: Kontaminierendes mikrobielles Wachstum geht nach der Nematodenreinigung verloren. (A) Der Wildstamm JU1848 verbreitet merkliches mikrobielles Wachstum auf Standard-6-cm-NGM-Platten, die mit E. coli OP50-1-Bakterien ausgesät sind. (B) Nach der Reinigung zeigt eine Platte mit F1-Nachkommen aus einer einzigen Dauer nach 4 Tagen Inkubation bei 20 °C keine sichtbare mikrobielle Kontamination. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62937/62937fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62937/62937fig03.jpg"> Abbildung 3: Anhaftende Bakterien sind im Lumen des sezierten Darms zu sehen. Nomarski-Bild eines sauberen JU1848-Tieres, das enthauptet wurde, so dass der Darm ausläuft. Die kolonisierenden Bakterien (ba) sind mit einer Klammer ([) gekennzeichnet und werden im Lumen (lu) eines Teils des Darms (in) gesehen, das sich außerhalb des Nematodenkörpers befindet (nb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62937/62937fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>Konzentration</td>
			<td>Menge</td>
		</tr>
<tr>
<td>27F Primer (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>2,5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1492R Primer (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>2,5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sezierter Darm in Wasser</td>
			<td>N/A</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x PCR-Puffer</td>
			<td>10-fach</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taq Polymerase</td>
			<td>5 HE/μL</td>
			<td>0,5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wasser</td>
			<td>N/A</td>
			<td>35,5 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Proben-PCR-Protokoll unter Verwendung universeller bakterieller Primer und seziertem Darm.
Ergänzende Datei 1: MUSCLE-Alignment von bakteriellen 16S rDNA-Sequenzen, die aus der PCR von sechs sezerpierten JU1848-Därmen gewonnen wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62937/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Wilde Caenorhabditis-Nematoden sind mit vielen Mikroben assoziiert, oft im Darmlumen oder im Darm. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Anreicherung von nicht kultivierbaren Mikroben, die den Darm besiedeln, unter Ausnutzung der Widerstandsfähigkeit der Dauerkutikula.

Selektive Reinigung von wilden Caenorhabditis-Nematoden zur Anreicherung von Darmmikrobiombakterien

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

Die Methode wurde entwickelt, um die Anreicherung und Identifizierung einer neuartigen Mikrobe von Interesse zu erleichtern, die in wilden Caenorhabditis-Nematoden gefunden wird, was eine weitere Untersuchung der Wirtsmikrobeninteraktionen ermöglicht. Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass sie es den Forschern ermöglicht, sich für nicht kultivierbare Krankheitserreger und Mikrobiombakterien direkt im Darm von wilden Nematoden anzureichern. Beginnen Sie mit der Gewinnung des wilden Caenorhabditis-Stammes von Nematoden mit einer unkulturierbaren Mikrobe von Interesse und züchten Sie die Würmer auf einem Standard-Nematoden-Wachstumsmedium oder NGM-Platten, die OP51 Escherichia coli als Nahrungsquelle enthalten.Die Nematoden vier bis fünf Tage bei 20 Grad Celsius inkubieren, bis alle OP51 Escherichia coli verbraucht sind und der Großteil der Würmer das Dauerstadium erreicht hat. Um die Nematoden im Dauer-Stadium zu waschen, fügen Sie fünf Milliliter M9-Minimalsalzmedien zu einer sechs Zentimeter großen Platte mit ausgehungerten Würmern hinzu und verwenden Sie eine sterile Glaspipette und -zwiebel, um die M9-Medien und Würmer von der Platte zu pipettieren und sie in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu übertragen. Drehen Sie die Würmer bei 1.000 mal G für 30 Sekunden bei Raumtemperatur herunter, entfernen Sie dann den M9-Überstand über dem Pellet der Würmer mit einer sterilen 15-Milliliter-Pipette, ohne die lebenden Würmer zu stören, indem Sie etwa 50 Mikroliter M9 über den Würmern belassen.Fügen Sie in dasselbe Zentrifugenröhrchen 10 Milliliter des M9-Mediums hinzu, das 0,05% Triton X-100 enthält, und ziehen Sie die Kappe des Röhrchens ausreichend fest, bevor Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur auf einen Nutator legen, um die externen Mikroben zu entfernen. Nach 20 Minuten Inkubation auf dem Nutator die Würmer bei 1.000 mal G für 30 Sekunden bei Raumtemperatur herunterdrehen, dann den M9-Überstand wie demonstriert entfernen und verwerfen und den Waschvorgang dreimal mit dem M9-Medium wiederholen, das 0,05% Triton X-100 enthält. Als nächstes inkubieren Sie die Tube mit Nematoden über Nacht auf einem Nutator bei Raumtemperatur, indem Sie das frisch zubereitete Antibiotikum und die SDS-Lösung hinzufügen.Nach der Behandlung mit Antibiotikum die Würmer im Röhrchen bei 1.000 mal G für eine Minute bei Raumtemperatur herunterdrehen. Entfernen Sie den Überstand, bevor Sie 10 Milliliter M9 mit 0,05% Triton X-100 hinzufügen, und ziehen Sie die Kappe ausreichend fest, um das Röhrchen auf einem Nutator für 20 Minuten bei Raumtemperatur zu inkubieren. Sobald Sie fertig sind, drehen Sie die Würmer bei 1.000 mal G für eine Minute herunter und wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal.Nach der vierten Wäsche mit dem M9, der 0,05% Triton X-100 enthält, lassen Sie das Wurmpellet ungestört in 100 Mikrolitern der Lösung und entsorgen Sie den Rest. 100 Mikroliter des Überstandes und des Pellets in die Mitte einer 10 Zentimeter langen NGM-Platte geben, die mit OP51 Escherichia coli ausgesät wurde. Lassen Sie die Platte ungestört trocknen, während die Dauers 5 bis 10 Minuten aus der Mitte und durch den OP51-Rasen kriechen.Nehmen Sie vorsichtig eine einzelne Dauer auf und legen Sie sie auf eine sechs Zentimeter lange NGM-Platte, die mit OP51 besät ist. Auf die gleiche Weise werden mindestens 10 Dauers in einzelne sechs Zentimeter große NGM-Platten mit OP51 ausgesät. Inkubieren Sie die Platten für vier bis fünf Tage bei 20 Grad Celsius, bis Dauers gewachsen sind und die nachfolgenden Generation F1s das Erwachsenenstadium erreicht haben, und überprüfen Sie dann visuell auf Verunreinigungen auf allen Platten.Überprüfen Sie für jede saubere Platte die Ausbreitung der interessierenden Mikrobe über Nomarski oder Fluoreszenzmikroskopie, abhängig vom interessierenden Phänotyp. Um die Würmer zu verhungern und die Anzahl der OP51-Bakterien zu reduzieren, inkubieren Sie die Nematoden bei 20 Grad Celsius für drei bis vier Tage. Fügen Sie fünf Milliliter des M9-Mediums auf die Platte der kürzlich ausgehungerten Würmer und übertragen Sie dann die M9-Medien und Würmer in ein steriles 15-Millimeter-Zentrifugenröhrchen, um bei Raumtemperatur 30 Sekunden lang mit 1.000 mal G herunterzufahren.Entfernen Sie den Überstand, bevor Sie die Würmer fünfmal mit 10 Millilitern des M9 mit 0,05% Triton X-100 auf einem Nutator für 20 Minuten waschen. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche den Überstand, ohne das Pellet in 100 Mikrolitern der Lösung zu stören, und geben Sie die M9 und die Würmer auf eine ungesetzte sechs Zentimeter lange NGM-Platte. Lassen Sie die Platte trocknen, während die Würmer 20 Minuten lang herumkriechen, um OP51 aus der Nagelhaut und dem Darm zu entfernen.Wenn die Platte trocken ist, wiederholen Sie den Vorgang, indem Sie 250 Mikroliter des M9 hinzufügen und die Würmer auf eine neue ungesetzte sechs Zentimeter lange NGM-Platte übertragen, damit die Würmer kriechen können, während die Platte trocknet. Nach 20 Minuten 250 Mikroliter des M9 auf die Platte geben und 100 Mikroliter des M9 zusammen mit Würmern auf ein sauberes Uhrglas übertragen, dann enthaupten Sie die Nematoden mit einer 26-Gauge-Spritzennadel, während Sie den Wurm mit einer weiteren 26-Gauge-Spritzennadel festhalten. Einmal enthauptet, werden der Darm, eine körnige Masse und die transparente Gonade auf natürliche Weise vom Nematodenkörper abgewendet, dann ein Stück des freiliegenden Darms abschneiden und einen einzelnen sezierten Darm in ein 0,5 Milliliter PCR-Röhrchen mit 10 Mikrolitern sterilem Wasser übertragen.Wiederholen Sie den Vorgang, um Därme von mindestens fünf verschiedenen Tieren in PCR-Röhrchen zu sammeln. Die PCR-Röhren bei minus 80 Grad Celsius für mindestens fünf Minuten einfrieren. Tauen Sie die Darmproben auf, bevor Sie mit der PCR und der Sequenzierung zur Identifizierung fortfahren.Es wurde festgestellt, dass ein wilder Caenorhabditis tropicalis-Stamm JU1848 dünne Mikroben aufweist, die das Darmlumen direktional besiedeln. Der Wildstamm JU1848 vermehrte auffälliges mikrobielles Wachstum auf Standard-Sechs-Zentimeter-NGM-Platten, die mit Escherichia coli OP51-Bakterien ausgesät waren. Nach der Reinigung zeigte eine Platte mit F1-Nachkommen aus einer einzigen Dauer nach vier tagen Inkubation keine sichtbare mikrobielle Kontamination.Auf dem Nomarski-Bild eines enthaupteten JU1848-Tieres waren die kolonisierenden Bakterien im Lumen eines Darmstücks außerhalb des Nematodenkörpers sichtbar. Einige Caenorhabditis-Arten können eine niedrigere SDS-Konzentration erfordern, um den Dauertod zu verhindern. Um einen sauberen Nematodenstamm zu vermehren, wählen Sie Dauers, die am weitesten von der Mitte gekrochen sind, da das Krabbeln hilft, überlebende Verunreinigungen zu entfernen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Taylor, M. N., et.al. Verwendung von Einzelwurmdaten zur Quantifizierung der Heterogenität bei Caenorhabditis elegans-bakteriellen Interaktionen. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt die Exposition von keimfreien, altersangepassten Caenorhabditis elegans-Würmern gegenüber einem Bakterienstamm zur Darmbesiedlung. Sie erklärt die selektive Entfernung von nicht anhaftenden und externen Bakterien, wobei nur lebensfähige Bakterien, die am Darmepithel haften, zur Quantifizierung übrig...

Bewertung der bakteriellen Besiedlung im Darm bei keimfreien C. elegans

Quelle: Morgan, E. et al. Selektive Reinigung wilder Caenorhabditis-Nematoden zur Anreicherung von Darmmikrobiombakterien. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Isolierung von interessanten Darmbakterien aus wilden Caenorhabditis-Würmern . Die Würmer werden zunächst ausgehungert und gewaschen, um die restlichen Nahrungsbakterien von ihrer Oberfläche und dem Darmlumen zu entfernen und gleichzeitig die Zielmikroben zu erhalten. Nach Oberflächenreinigung und mehreren...

Selektive Reinigung von Caenorhabditis-Würmern zur Anreicherung der Darmmikrobiota

Hier präsentieren wir Ihnen den Fadenwurm Caenorhabditis Elegans als eine vielseitige Grundmodell, mikrobielle Wechselwirkungen zu studieren.

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans - ein vielseitig In Vivo Modell zur Host-Mikroben-Interaktionen

Dieses Protokoll skizziert eine Methode zur effizienten Extraktion lebender Nematoden aus natürlichen Substraten im Feld.

Schnelle Isolierung wilder Nematoden durch Baermann Funnel

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um groß angelegte ökologische Untersuchungen von sich selbst lebenden Caenorhabditis-Nematoden durchzuführen. Der Hauptvorteil dieser Methode ist die effiziente Organisation und Analyse von ökologischen und molekularen Daten, die mit den aus der Natur gesammelten Nematoden verbunden sind.

Ein hochgradig skalierbarer Ansatz zur Durchführung ökologischer Untersuchungen von selbstsüchtigen Caenorhabditis-Nematoden

Darmmikroben, einschließlich extrazellulärer Bakterien und intrazellulärer Krankheitserreger wie dem Orsay-Virus und Mikrosporidien (Pilze), sind oft mit wilden Caenorhabditis-Nematoden assoziiert. Dieser Artikel stellt ein Protokoll zum Nachweis und zur Quantifizierung von Mikroben vor, die C. elegans-Nematoden besiedeln und/oder infizieren, und zur Messung der Erregerlast nach kontrollierten Infektionen im Labor.

RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zur Visualisierung mikrobieller Besiedlung und Infektion im Darm von Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll beschreibt eine 96-Well-Störung einzelner bakteriell besiedelter Caenorhabditis elegans nach Kältelähmung und Oberflächenbleiche, um externe Bakterien zu entfernen. Die resultierende Suspension ist auf Agarplatten plattiert, um eine genaue Quantifizierung der Keimbelastung in einer großen Anzahl einzelner Würmer mit mittlerem Durchsatz zu ermöglichen.

Verwendung von Einzelwurmdaten zur Quantifizierung der Heterogenität bei Caenorhabditis elegans-bakteriellen Interaktionen

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Isolierung von Darm aus adulten Caenorhabditis elegans-Nematodenwürmern von Hand zur Eingabe in Genomik, Proteomik, Mikrobiom oder anderen Assays.

Handdissektion von Caenorhabditis elegans Darm

Caenorhabditis elegans ist eine der wichtigsten Modellarten in der Biologie, aber fast alle Forschungen werden in Abwesenheit ihrer natürlich assoziierten Mikroben durchgeführt. Die hier beschriebenen Methoden werden dazu beitragen, die Vielfalt assoziierter Mikroben als Grundlage für zukünftige funktionelle C. elegans-Forschung besser zu verstehen.

Isolierung und Charakterisierung der natürlichen Mikrobiota des Modellnematoden Caenorhabditis elegans

Kompost-Mikrokosmen bringen die mikrobielle Vielfalt der Natur ins Labor, um die Mikrobiomforschung bei Caenorhabditis elegans zu erleichtern. Hier sind Protokolle für den Aufbau von Mikrokosmos-Experimenten, wobei die Experimente die Fähigkeit demonstrieren, die mikrobielle Vielfalt der Umwelt zu modulieren, um die Beziehungen zwischen der mikrobiellen Vielfalt der Umwelt und der Zusammensetzung des Mikrobioms des Wurmdarms zu untersuchen.

Kompostmikrokosmen als mikrobiell vielfältige, naturähnliche Umgebungen für die Mikrobiomforschung bei Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans ist ein leistungsfähiges Modell, um die molekularen Determinanten zu untersuchen, die Wirt-Mikrobiom-Interaktionen steuern. Wir präsentieren eine Hochdurchsatz-Pipeline, die die Ebenen der Darmmikrobiom-Kolonisierung einzelner Tiere zusammen mit Schlüsselaspekten der Physiologie von C. elegans profiliert.

Anwendung der Flow-Vermimetrie zur Quantifizierung und Analyse des Darmmikrobioms von Caenorhabditis elegans

Erfahren Sie eine Methode zur Anreicherung nicht kultivierbarer Darmmikrobiombakterien aus wilden Caenorhabditis-Nematoden. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Wirt-Mikrobe-Interaktionen.

Selektive Reinigung von wilden Caenorhabditis-Nematoden zur Anreicherung von Darmmikrobiombakterien

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