DUCT: Doppelharzguss mit anschließender Mikro-Computertomographie zur 3D-Leberanalyse

Diese Methode ermöglicht es uns, die Architektur der Lebergefäß- und Gallensysteme in 3D zu analysieren, zu visualisieren und zu quantifizieren. Wir können jetzt die räumlichen Aspekte von Lebererkrankungen und Regeneration besser verstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie nicht auf die Existenz von Antikörpern oder Fluoreszenzbildgebung angewiesen ist.

Es ermöglicht auch eine direkte Visualisierung, welche Netzwerke richtig lumenisiert sind. Diese Methode eignet sich für die Analyse von röhrenförmigen Systemen, daher sind die Erforschung von Blutgefäßen, Gallengängen und Atemwegen ideale Bereiche. Wir haben DUCT verwendet, um die strukturellen Veränderungen im Zusammenhang mit der Gallenregeneration zu verstehen.

Bevor Sie Harz in das Gallensystem der Maus injizieren, beginnen Sie, den Darm und die Bauchspeicheldrüse auf die linke Seite der Maus zu bewegen, indem Sie ein mit PBS benetztes Wattestäbchen verwenden, um den gemeinsamen Gallengang und die Pfortader freizulegen. Dann machen Sie einen kleinen transversalen Schnitt in der unteren Hohlvene. Drehen Sie die ventrale Seite der Leber in Richtung Herz, um die viszerale Oberfläche und die Hilarregion freizulegen, und lokalisieren Sie den gemeinsamen Gallengang, der von der Hilarregion über die Bauchspeicheldrüse und in den Darm am Schließmuskel von Oddi verläuft.

Verwenden Sie die gerade Pinzette, um den umgebenden Gewebebereich von etwa fünf Millimetern vom gemeinsamen Gallengang zu entfernen. Dann, indem Sie einen Seidennahtfaden unter den gemeinsamen Gallengang legen, binden Sie einen losen Überhandknoten um den gemeinsamen Gallengang. Halten Sie die Federschere flach gegen den gemeinsamen Gallengang, um einen schrägen Schnitt in den gemeinsamen Gallengang an der Stelle zu machen, an der der gemeinsame Gallengang neben dem Schließmuskel von Oddi in die Bauchspeicheldrüse und den Darm gelangt.

Als nächstes mischen Sie einen Milliliter des gelben Harzes mit 50 Mikrolitern des MV-Härters und füllen sie eine Ein-Milliliter-Luer-Spritze mit der Harzhärtermischung. Verbinden Sie die gefüllte Spritze mit dem ersten Schlauchset und drücken Sie den Kolben, um den Schlauch zu füllen, bis die Harzhärtemittelmischung von der Spitze des Schlauches tropft. Verwenden Sie die Pinzette, um den Bereich um den gemeinsamen Gallengangsschnitt zu begradigen.

Vor dem Einführen des Schlauches in die Öffnung im gemeinsamen Gallengang mit der längsten Kante der abgeschrägten Spitze nach unten zur dorsalen Seite des Gallengangs. Ziehen Sie dann den Seidenfadenknoten fest, um den Schlauch im gemeinsamen Gallengang zu sichern. Nachdem Sie das Harz in den gemeinsamen Gallengang injiziert haben, beobachten Sie die Gallenblase und die einzelnen Leberlappen.

Massieren Sie die Leber mit einem PBS-benetzten Wattestäbchen, um das Harz gleichmäßig zu verteilen. Harzgefüllte Gallengänge Terminaläste werden an der Leberoberfläche schwach sichtbar sein. Hören Sie auf, das Harz zu injizieren, wenn Harzpunkte an der Oberfläche der Leber erscheinen oder wenn widerstanden wird.

Entfernen Sie dann den Schlauch, indem Sie ihn aus dem gemeinsamen Gallengang herausziehen und den Seidenknoten schnell mit einer Pinzette festziehen, um zu verhindern, dass das Harz austritt. Schneiden Sie die losen Enden der Seidennaht ab, damit sie die Injektion der Pfortader nicht beeinträchtigen. Bevor Sie das Harz in die Pfortader injizieren, entfernen Sie die Pfortader mit einer geraden Pinzette etwa zwei Zentimeter vor ihrem Eintritt in die Leber aus ihrem umgebenden Gewebe.

Legen Sie dann den Seidennahtfaden unter den geräumten Bereich der Pfortader, um einen losen Überhandknoten zu binden. Machen Sie in der Pfortader distal zur Leber einen Längsschnitt, bevor Sie den Knoten binden. Als nächstes bereiten Sie die grüne Harzhärtermischung in der Spritze vor und füllen Sie den Schlauch wie zuvor gezeigt mit der Mischung.

Verwenden Sie die Pinzette, um die Pfortader zu begradigen, indem Sie das umgebende Gewebe zur Schwanzseite ziehen, bevor Sie den Schlauch mit der längsten Kante der abgeschrägten Spitze in Richtung der Dorsalseite des Gefäßes einführen. Ziehen Sie den Seidenfaden fest, um den Schlauch in der Pfortader zu sichern. Nachdem Sie das Harz in die Pfortader injiziert haben, beobachten Sie, wie sich die Blutgefäße mit Harz füllen, und massieren Sie die Leber mit einem PBS-benetzten Wattestäbchen, um das Harz zu verteilen.

Wenn alle Blutgefäße gefüllt sind, ziehen Sie den Schlauch aus der Pfortader heraus und ziehen Sie den Seidenknoten schnell mit einer Pinzzange fest, um zu verhindern, dass das Harz austritt. Für die Mikrocomputertomographie oder den MicroCT-Scan der von der Maus zerlegten Leber legen Sie den rechten medialen Leberlappen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und füllen Sie das Röhrchen mit 1% Agarosegel auf etwa zwei Drittel des Gesamtvolumens des Röhrchens, um unerwünschte Probenbewegungen während der MicroCT-Messung zu minimieren. Montieren Sie das konische 15-Milliliter-Rohr mit der Probe auf der Rotationsstufe eines CT-Geräts.

Lassen Sie das Rohr mindestens eine Stunde lang thermisch an die Messkammer anpassen. Wenn die Probe thermisch angepasst ist, zentrieren Sie sie im Sichtfeld oder Sichtfeld und optimieren Sie dann die Entfernungen der Quellprobe und des Probendetektors oder SSD und SDD, um eine ausreichende Voxelauflösung zu erreichen. Sobald die Parameter eingestellt sind, starten Sie eine CT-Messung.

Verwenden Sie eine spezielle tomographische Rekonstruktionssoftware, um die CT-Daten zu rekonstruieren. Um die CT-Daten zu analysieren, laden Sie die Dateien, indem Sie Datei, Import und Befehl auswählen. Verwenden Sie die Oberflächenbestimmungsfunktion auf der Oberseite, um das Harz in den Daten mithilfe der globalen Schwellenwerte zu segmentieren.

Bestimmen Sie im Dialogfenster den Schwellenwert mit der Histogrammauswertung, indem Sie die Position der roten Isowertlinie so einstellen, dass nur die harzgefüllten Behälter segmentiert werden. Wählen Sie im linken Bereich das Modul ROI aus Volumen oder CAD oder Mesh erstellen aus, um eine Region von Interesse oder einen ROI der mit Harz gefüllten Behälter zu erstellen. Verwenden Sie im Dialogfenster die Option ROIs aus Volumenkörper erstellen, um den Namen des verarbeiteten Volumes auszuwählen und zu bestätigen.

Eliminieren Sie fehlerhafte Segmentierungen von Rauschclustern im Hintergrundbereich dieses ROI. Markieren Sie den ROI im rechten Bereich, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken und den Split ROI des Moduls auswählen. Stellen Sie im Dialogfenster den Voxel-Parameter minimale Lautstärke ein, um alle Rauschpartikel auszuschließen.

Der Parameterwert ist experiment- und datenabhängig und für jede zu analysierende Probe optimiert. Verwenden Sie auf der linken Seite das Glättungsmodul, um glatte, kontinuierliche und feste Kanalmasken ohne Artefakte zu erstellen, wie das Vorhandensein von Luftblasen oder Harzleckagen in den Harzkosten ROI. Erstellen Sie einen separaten ROI wie zuvor beschrieben für das System, das mit dem absorbierenderen Harz gefüllt ist, wie das gelbe Harz, das für die übliche Gallenganginjektion mit höheren Intensitätswerten in den CT-Daten verwendet wird.

Markieren und maskieren Sie den neuen ROI, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken, bevor Sie ROIs subtrahieren und dann den neuen ROI vom ROI der Harzmaske subtrahieren, um einen neuen ROI für das verbleibende Rohrsystem zu erstellen. Exportieren Sie die resultierenden ROIs für beide Rohrsysteme in verschiedenen Formaten basierend auf Bedienerreferenzen für die anschließende Verarbeitung in unterschiedlicher Software. Verarbeiten Sie die resultierenden ROIs in einer Volumengrafiksoftware weiter, um die endgültige Visualisierung in Form eines Bildes oder eines Videos zu exportieren.

In dieser Studie wurde eine erfolgreiche Doppelharzinjektion mit gut gefüllten intrahepatischen Gallengängen und Pfortadergefäßen erreicht. Die repräsentative Analyse veranschaulicht das Ergebnis der segmentierten Daten einer gut injizierten Leber für eine P15-Maus und eine erwachsene Maus, bei der Harz in den Seitenästen sichtbar ist. Im typischen Beispiel einer erfolglosen Injektion führte eine körperliche Schädigung der Leber während des chirurgischen Eingriffs dazu, dass das Harz austrat.

Auch die vorzeitige Aushärtung des Harzes in der Nadel oder der Spitze des Schlauches vor der Injektion und die unzureichende transkardiale Perfusion verursachten eine Systemunterfüllung. Die geringfügige Harzleckage konnte während der MicroCT-Datensegmentierung manuell korrigiert werden. Hoher Injektionsdruck könnte Gefäße oder Kanäle reißen und das Gefäß oder die Kanalarchitektur irreversibel beschädigen.

Darüber hinaus waren die Blasen ein weiteres sehr häufiges Injektionsartefakt, das zur spärlichen Füllung der röhrenförmigen Netzwerke führte. Bei der Verwendung von frisch geöffnetem Harz wurde ein deutlicher Unterschied im Kontrast zwischen den gelben harzeinjizgespritzten Gallengängen und den mit grünem Harz injizierten Pfortadern beobachtet. Nach dreimonatiger Lagerung reichte der Kontrast aus, um die Pfortader vom Gallengang zu unterscheiden.

Die Ausfällung wirkte sich jedoch auf die Vermischung der beiden Harze aus, was als heterogene Opazität in der gefüllten Pfortader sichtbar war. Als das Harz älter als sechs Monate war, verschlechterte sich der Kontrast bis zu einem Punkt, an dem es nicht möglich war, den gelb injizierten Gallengang allein aufgrund ihres Kontrastes von der grün injizierten Pfortader zu unterscheiden. Es ist wichtig, einen schrägen Schnitt in den gemeinsamen Gallengang zu machen.

Andernfalls wird es sehr schwierig sein, den Schlauch einzuführen. Die DUCT-Technik beleuchtet neue architektonische Mechanismen der Gallenregeneration in einem klinisch relevanten Modell mit ausgeprägten Merkmalen in den Hilar- und Peripherielappenregionen.