Verwendung von Phagenanzeige zur Entwicklung von Ubiquitin-Variantenmodulatoren für E3-Ligasen

Die Phagenanzeige hilft uns nicht nur, die Bindungseigenschaften klinisch wichtiger Enzyme zu untersuchen, sondern auch Modulatoren für diese Enzyme und die entsprechenden Erkrankungen zu entwickeln. Die Phagenanzeige kann verwendet werden, um neuartige Bindemittel für eine Vielzahl von Zielproteinen zu entwickeln, und ist auch einfacher durchzuführen als andere herkömmliche Anzeigemethoden. Diese Prozedur beinhaltete eine Menge sich wiederholender Aktionen, so dass der Schlüssel darin besteht, keinen Autopiloten zu erhalten und durchgehend konzentriert zu bleiben.

Beginnen Sie mit der Impfung von 30 Millilitern 2YT Tetracyclinbrühe mit 200 Mikrolitern der Samenkultur. Inkubieren Sie es für ungefähr drei Stunden bei 37 Grad Celsius mit 200 U / min Orbitalschütteln, bis sich die Bakterien in der mittleren Log-Phase befinden. Entsorgen Sie die Beschichtungslösung von der Platte in eine Spüle.

Trocknen Sie es vorsichtig mit Papiertüchern ab. Dann fügen Sie 200 Mikroliter PB-Puffer zu jeder beschichteten Vertiefung hinzu. Entsorgen Sie den PB-Puffer von der Platte und trocknen Sie ihn auf Papiertüchern.

Fügen Sie weitere 200 Mikroliter PB-Puffer zu jeder beschichteten Vertiefung der Platte hinzu. Inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für eine Stunde mit 300 U / min Orbitalschütteln. Tauen Sie die Phagenbibliothek auf Eis auf und verdünnen Sie sie dann auf das 100-fache der Bibliotheksvielfalt in PBS.

Fügen Sie die Polyethylenglykol-Natriumchloridlösung bei einem Fünftel des verdünnten Bibliotheksvolumens hinzu und inkubieren Sie die Lösung 30 Minuten lang auf Eis. Als nächstes zentrifugieren Sie die Lösung bei 11.000 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und zentrifugieren Sie ihn für weitere zwei Minuten, um den verbleibenden Überstand herunterzuziehen und das Phagenpellet zu konzentrieren.

Resuspendieren Sie das Phagenpellet vorsichtig in einem Milliliter PBT-Puffer pro zu analysierendem Zielprotein, typischerweise insgesamt vier. Fügen Sie 100 Mikroliter Phagenbibliothek zu jeder beschichteten Vertiefung in der Kontrollplatte hinzu. Inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für eine Stunde mit 300 U / min Orbitalschütteln.

Entsorgen Sie den PB-Puffer von der Zielplatte in die Spüle und trocknen Sie die Platte auf Papiertüchern. Übertragen Sie alle 100 Mikroliter der Phagenbibliothek in der Steuerplatte in jede beschichtete Vertiefung der Zielplatte. Inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für eine Stunde mit 300 U / min Orbitalschütteln.

Als nächstes entfernen Sie die Phagenbibliothek von der Platte und waschen Sie die beschichteten Vertiefungen viermal mit PT-Puffer. Drehen Sie die Platte um und klopfen Sie auf ein Papiertuch, um die letzten Puffertropfen zu entfernen. Fügen Sie 100 Mikroliter 0,1 molare Salzsäure zu jeder beschichteten Vertiefung hinzu, um den Phagen zu eluieren.

Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für fünf Minuten mit 300 U / min Orbitalschütteln. Danach neutralisieren Sie den pH-Wert, indem Sie 12,5 Mikroliter pH 11 ein molares Trishydrochlorid zu jeder beschichteten Vertiefung hinzufügen. Übertragen Sie den eluierten Phagen aus allen acht Vertiefungen in ein einziges 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Während des Transfers auf und ab pipettieren, um die Lösungen homogen zu machen und die gesamte Flüssigkeit aus den Vertiefungen abzusaugen. Dem eluierten Phagen 10% BSA zuführen, um die Endkonzentration auf 1% zu erhöhen Lagern Sie das Mikrozentrifugenröhrchen bei vier Grad Celsius. Dies ist die runde eins Ausgabe.

Bereiten Sie eine Samenkultur für die Kultivierung des Phageneintrags für die nächste Auswahlrunde vor, indem Sie fünf Milliliter 2YT Tetracyclin-Samenkultur mit einer isolierten E. coli-Kolonie aus einer Agarplatte impfen. Inkubieren Sie es über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 200 U / min Orbitalschütteln. Verdünnen Sie das Zielprotein in den Runden zwei und drei Röhrchen mit einer geeigneten Menge PBS.

Nehmen Sie die Hälfte des Inhalts der Runden zwei und drei Röhrchen und beschichten Sie vier Vertiefungen pro Zielprotein in einer 96-Well-Bindungsplatte für die nächste Runde. Als nächstes verwenden Sie die Hälfte des round one-Ausgangs, um drei Milliliter Mid-Log-Phasenzellen zu impfen. Inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten mit 200 U / min Orbitalschütteln.

M13KO7-Helferphagen in eine Endkonzentration von 10 Milliarden PFU pro Milliliter geben. Inkubieren Sie es erneut bei 37 Grad Celsius für eine Stunde mit 200 U / min Orbitalschütteln. Nach einer Stunde die gesamten drei Milliliter Kultur auf 30 Milliliter 2YT Carbenicillin-Kanamycin-Lösung übertragen.

Wachsen Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 200 U / min Orbitalschütteln. Die repräsentativen Ergebnisse für eine Ubiquitin-Variantenselektion gegen UBE4B sind hier dargestellt. UBVs wurden von der höchsten bis zur niedrigsten Frequenz bestellt.

Sequenzen stellen die diversifizierte Ubiquitinregion im UBV mit allen randomisierten Resten dar. Die relative Bindungsaffinität der Bindemittel zum Wildtyp-Zielprotein, zum mutierten Zielprotein sowie zu Off-Target-Proteinen wird mittels enzymgebundener Immunosorbent-Assays oder ELISA gemessen. Alle ELISA-Absorptionen wurden gegen 96 gemittelte BSA-ELISA-Scores und 96 gemittelte GST-ELISA-Scores normalisiert.

Dunkleres Grün stellt die stärkere relative Bindung dar. GST wurde als Kontrolle für unspezifische Bindung aufgenommen, da das Zielprotein GST-markiert ist. Die ELISA-Ergebnisse werden hier grafisch dargestellt.

Die x-Achse stellt die UBVs und die y-Achse die entsprechende normalisierte Absorption dar. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, dass Sie die Lösung nicht in der Platte entsorgen, nachdem Sie die Salzsäure hinzugefügt haben. Die Phagen sind nun in Lösung suspendiert und Sie möchten diese behalten, damit Sie nachträgliche Anreicherungs-Endanalysen oder beides durchführen können.

Nach diesem Verfahren sollte eine Sequenzierung durchgeführt werden, um die UBV-Frequenzen zu bestimmen. ELISAs und IC50-Assays können durchgeführt werden, um Bindungswirksamkeiten bzw. hemmende Wirksamkeiten zu bestimmen und auch um zu bestimmen, welche UBVs weiter charakterisiert werden sollen.