Name: Verwendung von Phagenanzeige zur Entwicklung von Ubiquitin-Variantenmodulatoren für E3-Ligasen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-27T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Lernen Sie die Phagenanzeige zur Isolierung neuer Ubiquitin-Varianten als Modulatoren für E3-Ligasen. Diese Methode ermöglicht die Entwicklung spezifischer Bindemoleküle für therapeutische Anwendungen bei ubiquitinvermittelten Erkrankungen.

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Die Ubiquitin-Varianten-Technologie wurde im Labor von Dr. Sachdev Sidhu (University of Toronto) entwickelt. WZ ist derzeit CIFAR Azrieli Global Scholar im Humans & The Microbiome Program. Diese Forschung wurde durch NSERC Discovery Grants finanziert, die dem WZ verliehen wurden (RGPIN-2019-05721).

1. Vorbereitung des Reagenzes
<ol><li>PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung): Mischen Sie 50 ml 10x PBS-Lösung mit 450 ml hochreinem H2O. Sterilisieren Sie durch Filtration und lagern Sie es bei 4 ° C oder Raumtemperatur (~ 20-25 ° C).</li>
	<li>10% BSA (Rinderserumalbumin): Langsam 1 g BSA zu 7 ml ultrareinem H2O hinzufügen und mischen, bis es vollständig gelöst ist (keine Klumpen). Mit hochreinem H2O auffüllen, bis das Endvolumen 10 ml beträgt. Sterilisieren durch Filtration und lagern bei 4 °C.</li>
	<li>PB-Puffer (PBS ergänzt mit 1% BSA): Langsam 5 g BSA auf 400 ml hochreines H2O und 50 ml PBS geben und mischen, bis es vollständig gelöst ist (keine Klumpen). Mit hochreinem H2O auffüllen, bis das Endvolumen 500 ml beträgt. Sterilisieren durch Filtration und lagern bei 4 °C.</li>
	<li>PBT-Puffer (PBS ergänzt mit 1% BSA und 0,05% Tween 20): Langsam 5 g BSA auf 400 ml hochreines H2O und 50 ml PBS geben und mischen, bis es vollständig gelöst ist (keine Klumpen). Fügen Sie 250 μL Tween 20 hinzu. Mit hochreinem H2O auffüllen, bis das Endvolumen 500 ml beträgt. Sterilisieren durch Filtration und lagern bei 4 °C.</li>
	<li>PT-Puffer (PBS ergänzt mit 0,05% Tween 20): Mischen Sie 1 ml Tween 20 mit 400 ml PBS. Mit hochreinem H2O auffüllen, bis das Endvolumen 2 L beträgt. Sterilisieren Sie durch Filtration und lagern Sie es bei 4 °C oder Raumtemperatur (~20-25 °C).</li>
	<li>2YT Brühe: 16 g Trypton, 10 g Hefeextrakt und 5 g NaCl auf 800 ml hochreines H2O geben und bis zur vollständigen Auflösung mischen (keine Klumpen). Mit hochreinem H2O auffüllen, bis das Endvolumen 1 L beträgt. Autoklavieren und bei Raumtemperatur (~20-25 °C) lagern.</li>
	<li>LB / Carb-Platten: Fügen Sie 12,5 g vorgefertigte LB-Mischung und 7,5 g Agar zu 400 ml H2O hinzu. Füllen Sie mit hochreinem H2O auf, bis das endgültige Volumen 500 ml beträgt, und sterilisieren Sie es durch Autoklavieren. Stellen Sie sicher, dass Agar vollständig gelöst ist und warten Sie, bis es auf unter 60 °C abgekühlt ist. Fügen Sie 500 μL 100 mg ml Carbenicillin hinzu, mischen Sie gut und gießen Sie es in die Platte. Bei 4 °C lagern.</li>
	<li>LB/tet-Platten: 12,5 g vorgefertigte LB-Mischung und 7,5 g Agar auf 400 ml hochreines H2O geben. Mit hochreinem H2O auffüllen, bis das Endvolumen 500 ml beträgt, und durch Autoklavieren sterilisieren. Stellen Sie sicher, dass Agar vollständig gelöst ist und warten Sie, bis es auf unter 60 °C abgekühlt ist. Fügen Sie 500 μL 10 mg ml Tetracyclin hinzu, mischen Sie gut und gießen Sie es in die Platte. Bei 4 °C lagern.</li>
	<li>20% PEG (Polyethylenglykol)/2,5 M NaCl: 50 g PEG-8000 und 36,5 g NaCl auf 200 ml hochreines H2O geben. HINWEIS: Dies kann eine Weile dauern; Heizung kann helfen. Mit hochreinem H2O auffüllen, bis das Endvolumen 250 ml beträgt. Sterilisieren durch Filtration oder Autoklavieren.</li>
	<li>0,1 M HCl: Mischen Sie 20 mL 1 M HCl mit 180 mL ultrareinem H2O. Sterilisieren Sie durch Filtration und lagern Sie es bei Raumtemperatur (~ 20-25 ° C).</li>
	<li>1 M Tris (pH 11,0): 6,1 g Tris-Base auf 40 ml hochreines H2O geben. Mit HCl auf 11,0 einstellen und mischen, bis Tris vollständig gelöst ist. Mit hochreinem H2O auffüllen, bis das Endvolumen 50 ml beträgt. Sterilisieren durch Filtration und lagern bei Raumtemperatur (~20-25 °C).</li>
	<li>100 mg/ml (1000x) Carbenicillin: 2 g des Carbenicillin-Dinatriumsalzes auf 20 mL hochreines H2O geben. Sterilisieren durch Filtration und lagern bei -20 °C.</li>
	<li>50 mg/ml (1000x) Kanamycin: 1 g Kanamycinsulfat auf 20 ml hochreines H2O geben. Sterilisieren durch Filtration und lagern bei -20 °C.</li>
	<li>10 mg/ml (1000x) Tetracyclin: 0,2 g Tetracyclinhydrochlorid zu 20 mL 70% Ethanol zugeben. Mischen, bis es vollständig aufgelöst ist. Sterilisieren durch Filtration und lagern bei -20 °C.</li>
</ol>2. Proteinzubereitung
<ol><li>Bestimmen Sie die Konzentration des Zielproteinstocks in μM. Der bequemste Weg, die Proteinkonzentration zu beurteilen, besteht darin, die Absorption des Proteinbestands bei 280 nm zu messen. Wenn die Konzentration in mg/ml bekannt ist, wandeln Sie sie unter Verwendung des Molekulargewichts des Zielproteins in μM um. Eine Reihe von Methoden kann abhängig vom Protein von Interesse verwendet werden; Weitere Informationen finden Sie im Abschnitt Diskussion. HINWEIS: Wenn das Protein abgeschnitten (spezifische Proteindomäne/-motiv) oder markiert ist, denken Sie daran, diese Änderungen des Molekulargewichts bei der Umwandlung von mg/ml in μM zu berücksichtigen.</li>
	<li>Bereiten Sie drei Mikrozentrifugenröhrchen mit der Aufschrift "rund 1", "rund 2/3" und "rund 4/5" vor.<ol>
<li>Berechnen Sie das Proteinvolumen, das notwendig ist, um es auf 1 μM in 800 μL PBS zu verdünnen, und aliquotieren Sie dieses Volumen in die Röhrchen, ohne PBS hinzuzufügen. HINWEIS: Wenn die Menge des verfügbaren Zielproteins gering ist, kann die Konzentration auf nur 0,25 μM gesenkt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Vorbereitung auf die erste Auswahlrunde
<ol><li>Bereiten Sie eine Samenkultur vor, um den Phageneintrag für die zweite Auswahlrunde zu kultivieren.<ol>
<li>Impfen Sie 5 ml 2YT/tet mit einer gut isolierten Escherichia coli-Kolonie und inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C mit 200 U / min Orbitalschütteln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beschichten Sie den Teller für die erste Auswahlrunde.<ol>
<li>Verdünnen Sie das Zielprotein im "runden 1" Röhrchen mit der entsprechenden Menge pbS und aliquot 100 μL in acht Vertiefungen einer 96-Well-Bindungsplatte (d. h. der Zielplatte). HINWEIS: Die Phagenanzeige kann für vier verschiedene Proteine gleichzeitig auf einer einzigen Platte durchgeführt werden, indem die Vertiefungen in den Ecken der Platte beschichtet werden.</li>
		<li>Optionale Kontrolle: Wenn das Zielprotein markiert ist, z. B. mit GST oder MBP (Maltose Binding Protein), beschichten Sie acht Vertiefungen in einer anderen 96-Well-Bindungsplatte mit 100 μL einer 1 μM-Lösung, die das entsprechende Epitop-Tag enthält. Dies wird verwendet, um unerwünschte Phagen zu entfernen, die unspezifisch an das Tag binden.</li>
		<li>Platte(n) über Nacht bei 4 °C mit 200 U/min Orbitalschütteln schütteln.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Auswahlrunde
<ol><li>Bereiten Sie die Eingabe der zweiten Runde vor.<ol>
<li>Impfen Sie 30 ml 2YT/tet mit 200 μL der Samenkultur aus Schritt 3.1.</li>
		<li>Bei 37 °C mit 200 U/min Orbitalschütteln inkubieren, bis sich die Bakterien in der mittleren Log-Phase befinden (OD600<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62950/62950eq01v2.jpg"> 0,6 - 0,8). Dies dauert ungefähr drei Stunden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zielplatte blockieren.<ol>
<li>Entfernen Sie die Beschichtungslösung von der Platte oder von beiden Platten, wenn eine Steuerplatte hergestellt wurde, indem Sie sie umkehren und über eine Spüle schütteln. Tätscheln Sie trocken auf Papiertücher.</li>
		<li>Fügen Sie 300 μL PB-Puffer zu jeder beschichteten Vertiefung hinzu.</li>
		<li>Entfernen Sie den PB-Puffer wie in Schritt 4.2.1 und fügen Sie weitere 200 μL PB-Puffer hinzu.</li>
		<li>Bei Raumtemperatur (~20-25 °C) für 1 h mit 300 U/min Orbitalschütteln inkubieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die Phagenbibliothek vor.<ol>
<li>Tauen Sie die Phagenbibliothek auf Eis auf und verdünnen Sie sie auf das 100-fache der Bibliotheksvielfalt in PBS. Wenn beispielsweise die Bibliotheksvielfalt 1 x 1010 und die Bibliothekskonzentration 1 x 1013 beträgt, verdünnen Sie die Bibliothek so, dass die Konzentration 1 x 1012 beträgt. Verdünnen Sie die hier verwendeten Bibliotheken 10-fach in PBS, indem Sie 1 ml der Bibliothek mit 9 ml PBS kombinieren. HINWEIS: Die Vielfalt der Bibliothek sollte bei der Erstellung der Bibliothek festgestellt worden sein und kann nicht ohne weiteres beurteilt werden. Die Bibliothekskonzentration kann durch Impfung von E. coli-Zellen in der mittleren Log-Phase (OD600 0,6<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62950/62950eq01v2.jpg"> - 0,8) und Beschichtung auf LB / Carb bestimmt werden.</li>
		<li>Fügen Sie 1/5 Volumen PEG/NaCl hinzu. Fügen Sie beispielsweise für 10 ml der zuvor verdünnten Bibliothek 2 ml PEG/NaCl hinzu.</li>
		<li>30 Min auf Eis inkubieren.</li>
		<li>Zentrifugiere bei 11.000 x g für 30 min bei 4 °C, verwerfe den Überstand und rezentriere für 2 min, um den verbleibenden Überstand abzureißen. HINWEIS: Legen Sie das Rohr beim zweiten Mal in die gleiche Ausrichtung in den Rotor, als es das erste Mal war, um das Pellet an der gleichen Stelle zu halten, so dass es leichter zu sehen ist.</li>
		<li>Resuspenieren Sie das Phagenpellet vorsichtig in 1 ml PBT pro Protein. Für vier Proteine resuspendieren Sie das Pellet in 4 ml PBT. HINWEIS: Versuchen Sie, das Pellet nicht zu berühren und keine Luftblasen einzuführen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zeigen Sie den Phagen dem Zielprotein (den Zielproteinen) an.<ol>
<li>Optionale Steuerung: Fügen Sie 100 μL Phagenbibliothek zu jeder beschichteten Vertiefung in der Steuerplatte hinzu. Bei Raumtemperatur (~20-25 °C) für 1 h mit 300 U/min Orbitalschütteln inkubieren und die Bibliothek von der Steuerplatte auf die Zielplatte übertragen. Überspringen Sie Schritt 4.4.2.</li>
		<li>Entfernen Sie den PB-Puffer von der Zielplatte wie in Schritt 4.2.1 und fügen Sie 100 μL der Phagenbibliothek zu jeder beschichteten Vertiefung hinzu.</li>
		<li>Bei Raumtemperatur (~20-25 °C) für 1 h mit 300 U/min Orbitalschütteln inkubieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elute runde einphage.<ol>
<li>Entfernen Sie die Phagenbibliothek und waschen Sie die beschichteten Vertiefungen viermal mit PT-Puffer. Drehen Sie den Teller um und klopfen Sie auf ein Papiertuch, um die letzten Tropfen zu entfernen. HINWEIS: Wenn mehrere Zielproteine auf einer Platte beschichtet sind, versuchen Sie, den Fluss aller nachfolgenden Lösungen zwischen den Vertiefungen zu minimieren.</li>
		<li>Fügen Sie 100 μL 0,1 M HCl zu jeder beschichteten Vertiefung hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 min mit 300 U / min Orbitalschütteln.</li>
		<li>Neutralisieren Sie den pH-Wert, indem Sie 12,5 μL 1 M Tris-HCl (pH 11) zu jeder beschichteten Vertiefung hinzufügen.</li>
		<li>Bündeln Sie den eluierten Phagen aus allen 8 Vertiefungen in einem einzigen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Während des Transfers auf und ab pipettieren, um die Lösungen homogen zu machen und die gesamte Flüssigkeit aus den Vertiefungen abzusaugen.</li>
		<li>10% BSA zum gepoolten eluierten Phagen bis zu einer Endkonzentration von 1% geben. Für ein typisches rundes Elutionsvolumen von 950 μL fügen Sie 95 μL 10% BSA hinzu. Bei 4 °C lagern. Dies ist die runde eins Ausgabe.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Vorbereitung auf nachfolgende Auswahlrunden
<ol><li>Bereiten Sie eine Samenkultur vor, um den Phageneintrag für die nächste Auswahlrunde wie in Schritt 3.1 zu kultivieren.</li>
	<li>Beschichten Sie die Platte für die dritte Auswahlrunde wie in Schritt 3.2 mit den unten aufgeführten Änderungen.<ol>
<li>Beschichten Sie nur vier Vertiefungen pro Protein in einer 96-Well-Bindungsplatte. Verwenden Sie die Hälfte des Inhalts der "runden 2/3" oder "runden 4/5" Rohre für die entsprechende Runde. Verdünnen Sie den Inhalt dieser Röhrchen nach Bedarf, um zu vermeiden, dass sich Proteine aus der Lösung absetzen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die Phageneingabe für die nächste Auswahlrunde vor.<ol>
<li>Verwenden Sie die Hälfte des Round-One-Ausgangs aus Schritt 4.5.5, um 3 ml Mid-Log-Phasenzellen aus Schritt 4.1 zu impfen. Für einen typischen Round-One-Ausgang impfen Sie mit 500 μL des Ausgangs.</li>
		<li>Bei 37 °C für 30 min mit 200 U/min Orbitalschütteln inkubieren.</li>
		<li>M13K07 Helferphagen in eine Endkonzentration von 1 x 1010 PFU/ml geben.</li>
		<li>Bei 37 °C für 1 h mit 200 U/min Orbitalschütteln inkubieren.</li>
		<li>Übertragen Sie die gesamten 3 ml Kultur auf 30 ml 2YT / Carb / kan. Über Nacht bei 37 °C mit 200 U/min Orbitalschütteln wachsen.</li>
		<li>Am nächsten Tag wird die Kultur in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und bei 11.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, um die Zellen auszufällen.</li>
		<li>Den Überstand in ein neues 50-ml-Zentrifugenröhrchen umfüllen und mit 8 ml PEG/NaCl mischen und 10 min auf Eis inkubieren.</li>
		<li>Zentrifugiere bei 11.000 x g für 10 min bei 4 °C, verwerfen den Überstand und zentrifugieren erneut für 2 min. HINWEIS: Legen Sie das Rohr beim zweiten Mal in die gleiche Ausrichtung in den Rotor, als es das erste Mal war, um das Pellet an der gleichen Stelle zu halten, so dass es leichter zu sehen ist.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Phagenpellet in 800 μL PBT, so dass es vollständig homogen ist und keine Klumpen sichtbar sind.</li>
		<li>Die Phagenlösung in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen überführen und bei 16.200 x g für 4 min bei 4 °C auf Pelletablagerungen zentrifugieren.</li>
		<li>Übertragen Sie den Überstand auf ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Dies ist der Input für die nächste Auswahlrunde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Optional: Titer der Ein- und Ausgangslösungen.<ol>
<li>Verwenden Sie 500 μL einer E. coli-Samenkultur , um 5 ml 2YT/tet zu impfen und bei 37 °C mit 200 U / min orbitalem Schütteln zu inkubieren, bis sich die Bakterien in der mittleren Log-Phase befinden (OD600<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62950/62950eq01v2.jpg"> 0,6 - 0,8). Dies dauert ca. 1 h.</li>
		<li>Verdünnen Sie Phagen-Input/Output-Lösungen auf 10-3 - 10-5 in PBS und fügen Sie 10 μL jeder Verdünnung zu 90 μL kultivierter Zellen hinzu. HINWEIS: Verwenden Sie sofort verdünnte Phagenlösungen, da Phagen im Laufe der Zeit an die Tube adsorbieren und Transformationen falsch negative Ergebnisse erzeugen können.</li>
		<li>Bei 37 °C für 20 min mit 200 U/min Orbitalschütteln inkubieren.</li>
		<li>Platte 5 μL auf separaten LB/Carb-Platten. HINWEIS: Die plattierte Menge ist variabel und hängt von früheren Ergebnissen / persönlichen Vorlieben ab.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Nachfolgende Auswahlrunden
<ol><li>Führen Sie alle nachfolgenden Runden zusammen mit der Vorbereitung durch, wie in den Schritten 3 bzw. 4 ausgeführt, mit den unten aufgeführten Unterschieden.<ol>
<li>Verwenden Sie die in der vorherigen Runde erzeugte Eingabe als Phagenquelle anstelle einer Bibliothek. Beschichten Sie 4 Vertiefungen pro Zielprotein mit 100 μL des Phageneintrags aus der vorherigen Runde. Verbleibende Phageneingänge bei 4 °C lagern.</li>
		<li>Machen Sie den Waschschritt in 4.5.1 mit jeder Auswahlrunde strenger. Runde eins erfordert 4 Mal Waschen, Runde zwei erfordert 6 Mal, Runde drei erfordert 8 Mal und Runde vier und Fünf erfordern beide 10 Mal Waschen.</li>
		<li>Reduzieren Sie einige Volumina im Vergleich zu denen, die in Runde eins verwendet werden, da nachfolgende Runden nur vier statt acht Vertiefungen beschichten. Zum Beispiel werden in Schritt 4.5.5 nur 45 μL von 10% BSA zum Phagenausgang hinzugefügt, und in Schritt 5.3.1 werden nur 250 μL des Phagenausgangs zur Impfung von Zellen verwendet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Nachauswahlbearbeitung und Phagenisolierung
<ol><li>Titeren Sie die Ein- und Ausgangslösungen für die Runden vier und fünf.<ol>
<li>Wenn nicht bereits in Schritt 5.4 ausgeführt, befolgen Sie die gleichen Schritte, um die Runden vier und fünf Phagenausgänge zu titern, wobei idealerweise ein Bereich von 30-300 Kolonien über einige Platten erzeugt wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kultivieren und isolieren Sie Phagen.<ol>
<li>Aliquot 450 μL 2YT/Carb/M13K07 in jede Tube einer 96 Mini Tuben Kulturbox.</li>
		<li>Wählen Sie gut isolierte Kolonien aus einer der Platten aus Schritt 7.1, um jedes Röhrchen zu impfen. HINWEIS: Verwenden Sie die obere Hälfte des Feldes für die Ausgabe der vierten Runde und die untere Hälfte für die Ausgabe der fünften Runde.</li>
		<li>Über Nacht bei 37 °C mit 200 U/min Orbitalschütteln inkubieren.</li>
		<li>Zentrifuge bei 1.200 x g für 10 min bei 4 °C.</li>
		<li>Übertragen Sie so viel Überstand wie möglich in eine neue 96 Mini-Röhrenkulturbox, ohne das Zellpellet zu stören, und entsorgen Sie das alte. Bei 4 °C lagern.</li>
		<li>Übertragen Sie aus der neuen Box 100 μL von jedem Röhrchen auf eine 96 Well non-binding Platte, die 100 μL 50% Glycerin in allen Vertiefungen enthält. Gut mischen und bei -80 °C als Backup-Bestand lagern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Wie in Schritt 2.1 (Proteinpräparation) erwähnt, kann eine Vielzahl von Methoden verwendet werden, um die Proteinkonzentration zu bewerten, und jede hat einzigartige Vor- und Nachteile, basierend auf dem spezifischen Zielprotein, das für die Phagenanzeige verwendet wird. Eine Quelle detaillierter Beschreibungen und Protokolle für gängige Methoden wurde bereits bereitgestellt11.
Die Verwendung des Phagen, der von einer vorherigen Phagenrunde zurückgehalten wird, als Eing...

Das Verständnis der molekularen Details von Protein-Protein-Interaktionen ist entscheidend für die Abgrenzung der Signaltransduktionsmechanismen biologischer Prozesse, insbesondere solcher, die zu klinisch wichtigen Krankheiten beitragen. In den letzten Jahren wurde die Phagenanzeige als praktische und zugängliche Methode zur Isolierung von Proteinen/Peptiden mit deutlich verbesserter Bindung an ein gewünschtes Zielprotein1,2,3,4 eingesetzt, das wiederum als intrazelluläre Sonden für Protein-Protein-Interaktionen verwendet werden kann.
Die Ubiquitinierung ist eine Kaskade enzymatischer Aktivitäten (E1-aktivierendes Enzym → E2-konjugierendes Enzym → E3-Ligasen), die Ubiquitin (Ub) kovalent an Proteinsubstrate konjugieren, um sie für den Abbau oder die Vermittlung von Zellsignaländerungen anzusprechen. Darüber hinaus katalysieren Deubiquitinasen die Entfernung von Ubiquitin aus Proteinen. Daher gibt es in Zellen Tausende von Ub-abhängigen Protein-Protein-Interaktionen, von denen die überwiegende Mehrheit eine gemeinsame Oberfläche mit geringer Affinität, aber hoher Spezifität erkennt, um schwache Wechselwirkungen durch große und vielfältige Oberflächen zu ermöglichen.
Ernst et al. führten Mutationen in bekannte Bindungsregionen von Ub ein, um zu sehen, ob sie die Bindungsaffinität für ein Protein von Interesse verbessern und gleichzeitig eine hohe Selektivität beibehalten könnten5. Es wurde eine kombinatorische Bibliothek von über 10 Milliarden (7,5 x 1010) Ub-Varianten (UbVs) mit Mutationen an Positionen über die Ub-Oberfläche entwickelt, die die bekannten Ub-Protein-Interaktionen vermitteln. Diese Bibliothek bestand aus Phagenmiden, die das M13-Bakteriophagen-pIII-Mantelprotein exprimieren, das zu diversifizierten UbVs fusioniert wurde. Daher können einzelne UbVs über das Mantelprotein bei der Expression auf der Phagenoberfläche dargestellt werden. Während des Auswahlprozesses werden Phagen, die UbVs mit erheblichen Bindungsinteraktionen mit dem Zielprotein aufweisen, in nachfolgenden Runden der Phagenanzeige zurückgehalten und angereichert, während Phagen mit UbVs, die schlecht an das Zielprotein binden, weggewaschen und aus dem Phagenpool entfernt werden. Die zurückgehaltenen Phagenpartikel enthalten das Phagemid, das ihrem angezeigten UbV entspricht, so dass sie nach der Isolierung sequenziert und weiter charakterisiert werden können.
Mit dieser Protein-Engineering-Strategie wurden UbV-Inhibitoren für humane Deubiquitinasen5 und virale Proteasen6 entwickelt. Wichtig ist, dass wir hemmende UbVs für menschliche E3-Ligasen der HECT-Familie erzeugt haben, indem wir die E2-Bindungsstelle entführt und UbVs aktiviert haben, die einen Ub-bindenden Exositen auf der HECT-Domäne besetzen7. Wir können auch monomere E3 der RING-Familie hemmen, indem wir auf die E2-Bindungsstelle abzielen und eine UbV-Dimerisierung induzieren, um den homodimeren RING E3s8 zu aktivieren. Bei Ring E3s mit mehreren Untereinheiten können UbVs eine Hemmung erreichen, indem sie auf die RING-Untereinheit abzielen (z. B. für APC/C-Komplex9) oder die Komplexbildung stören (z. B. für SCF E3s10). Insgesamt können UbVs genutzt werden, um Protein-Protein-Interaktionen im Ub-Proteasom-System (UPS) systematisch zu untersuchen, so dass wir biochemische Mechanismen von USV-Enzymen besser entschlüsseln und funktionelle Stellen für therapeutische Interventionen identifizieren und validieren können.
Das folgende Protokoll beschreibt, wie eine zuvor generierte Phagen-displayte UbV-Bibliothek verwendet wird, um auf ein Protein von Interesse abzuzielen, und wie die UbV-Bindemittel, die mit dem Zielprotein interagieren, durch aufeinanderfolgende Runden der Phagenanzeige angereichert werden.

<table><tbody><tr><td>Axygen Mini Tube System (0,65 ml, steril, 96/Rack, 10 Racks/Packung)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-198</td><td>Kultivierung der Phagenausgänge nach der Phagenausstellung.</td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrierte Nährmedien: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-17-3</td><td>Vorbereitung von Platten für das Titern.</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA), Fraktion V</td><td>BioShop Canada</td><td>ALB001</td><td>Pufferkomponente.</td></tr><tr><td>Carbenicillin-Dinatriumsalz 89,0-100,5% wasserfreies</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C1389-5G</td><td>Kultivierung von Phagenmid-infizierten Zellen.</td></tr><tr><td>Kompakter digitaler Mikrotiterplatten-Schüttler</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-676-337</td><td>Schütteln von Platten während der Inkubation mit der Phagenbibliothek.</td></tr><tr><td>Corning Microplate Aluminium Dichtungsband</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-684</td><td>Versiegelung von Phagenglycerin-Aktien.</td></tr><tr><td>Dehydratisierter Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-01-0</td><td>Vorbereitung der Platten für das Titern.</td></tr><tr><td>DS-11 Spektralphotometer/Fluorometer</td><td>DeNovix</td><td>DS-11 FX+</td><td>Messung der Proteinkonzentration.</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One CellStar 96-Well, unbehandelte Mikroplatte mit U-förmigem Boden</td><td>Fisher Scientific</td><td>7000133</td><td>Lagerung von Phagenglycerin-Beständen.</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>Phagen-Elution.</td></tr><tr><td>Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemisch kompetent E. coli</td><td>Fisher Scientific</td><td>C854003</td><td>Bakterienstamm für Phageninfektionen.</td></tr><tr><td>Kanamycinsulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ1792406</td><td>Kultivierung von M13K07-Helfer-Phagen-infizierten Zellen.</td></tr><tr><td>M13KO7 Helfer Phage</td><td>New England Biolabs</td><td>&nbsp; N0315S</td><td>Phagemidenpackung und -sekretion zulassen.</td></tr><tr><td>MaxQ 4000 Tisch-Orbitalschüttler</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-676-076</td><td>Bakterielle Zellkultur.</td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp 96 Well Mikroplatte, flacher Boden</td><td>Life Technologies</td><td>44-2404-21</td><td>Immobilisierende Proteine.</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 10X Lösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td>Pufferkomponente/Phagen-Resuspensionsmedium.</td></tr><tr><td>Polyesterfolien für ELISA und Inkubation</td><td>VWR</td><td>60941-120</td><td>Abdecken der Mikrotiterplatten während der Inkubation.</td></tr><tr><td>Polyethylenglykol 8000 (PEG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-1</td><td>Phagenfällung.</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S3014</td><td>Phagenfällung.</td></tr><tr><td>Sterile Kulturröhrchen aus Kunststoff: Transluzentes Polypropylen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-1D</td><td>Kultivierung von Phageneingängen.</td></tr><tr><td>Tetracyclinhydrochlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td>Kultivierung von E. coli OmniMax-Zellen.</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1525</td><td>Neutralisierende eluierte Phagenlösung.</td></tr><tr><td>Trypton-Pulver</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-2</td><td>Komponente des Zellwachstumsmediums.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337500</td><td>Pufferkomponente.</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td>Komponente des Zellwachstumsmediums.</td></tr></tbody></table>

verwendung von phagenanzeige zur entwicklung von ubiquitin-variantenmodulatoren für e3-ligasen

Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

Ubiquitin ist ein kleines 8,6 kDa-Protein, das ein Kernbestandteil des Ubiquitin-Proteasom-Systems ist. Folglich kann es an eine Vielzahl von Proteinen mit hoher Spezifität, aber geringer Affinität binden. Durch phagenanzeige können Ubiquitinvarianten (UbVs) so konstruiert werden, dass sie eine verbesserte Affinität gegenüber Wildtyp-Ubiquitin aufweisen und die Bindungsspezifität an Zielproteine beibehalten. Die Phagenanzeige verwendet eine Phagemidenbibliothek, wobei das pIII-Mantelprotein eines filamentösen M13-Bakteriophagen (ausgewählt, weil es äußerlich auf der Phagenoberfläche angezeigt wird) mit UbVs verschmolzen wird. Spezifische Reste von menschlichem Wildtyp-Ubiquitin sind weich und randomisiert (d.h. es gibt eine Verzerrung hin zur nativen Wildtypsequenz), um UbVs zu erzeugen, so dass schädliche Veränderungen in der Proteinkonformation vermieden werden und gleichzeitig die Vielfalt eingeführt wird, die für die Förderung neuartiger Interaktionen mit dem Zielprotein erforderlich ist. Während des Phagenanzeigeprozesses werden diese UbVs exprimiert und auf Phagenmantelproteinen angezeigt und gegen ein Protein von Interesse geschwenkt. UbVs, die günstige Bindungswechselwirkungen mit dem Zielprotein aufweisen, bleiben erhalten, während schlechte Bindemittel weggespült und aus dem Bibliothekspool entfernt werden. Die zurückgehaltenen UbVs, die an das Phagenpartikel gebunden sind, das das entsprechende Phagemid des UbV enthält, werden eluiert, amplifiziert und konzentriert, so dass sie in einer weiteren Runde der Phagenanzeige gegen dasselbe Zielprotein geschwenkt werden können. Typischerweise werden bis zu fünf Runden Phagendarstellung durchgeführt, in denen ein starker Selektionsdruck gegen UbVs ausgeübt wird, die schwach und / oder promiskuitiv binden, so dass diejenigen mit höheren Affinitäten konzentriert und angereichert werden. Letztendlich werden UbVs, die eine höhere Spezifität und/oder Affinität für das Zielprotein aufweisen als ihre Wildtyp-Pendants, isoliert und können durch weitere Experimente charakterisiert werden.

Bindemittel, die aus der Phagenanzeige hergestellt werden, können auf vielfältige Weise verifiziert und analysiert werden. Es wird empfohlen, zuerst mit der Sequenzierung des Phagen mit Primern fortzufahren, die das diversifizierte Insert in der Phagemidenbibliothek flankieren. Ein ideales Phagen-Display-Experiment zeigt eine klare Verzerrung zu mehreren Sequenzen (Abbildung 1). Andere Sequenzen werden ebenfalls vorhanden sein, jedoch mit einer niedrigeren Anzahl, die eher als Hintergrundger...

Ubiquitinierung ist eine kritische posttranslationale Proteinmodifikation, deren Dysregulation mit zahlreichen menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht wurde. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Phagenanzeige verwendet werden kann, um neuartige Ubiquitin-Varianten zu isolieren, die die Aktivität von E3-Ligasen binden und modulieren können, die die Spezifität, Effizienz und Muster der Ubiquitinierung steuern.

Verwendung von Phagenanzeige zur Entwicklung von Ubiquitin-Variantenmodulatoren für E3-Ligasen

Ubiquitin is a small 8.6 kDa protein that is a core component of the ubiquitin-proteasome system. Consequently, it can bind to a diverse array of proteins ...

Die Phagenanzeige hilft uns nicht nur, die Bindungseigenschaften klinisch wichtiger Enzyme zu untersuchen, sondern auch Modulatoren für diese Enzyme und die entsprechenden Erkrankungen zu entwickeln. Die Phagenanzeige kann verwendet werden, um neuartige Bindemittel für eine Vielzahl von Zielproteinen zu entwickeln, und ist auch einfacher durchzuführen als andere herkömmliche Anzeigemethoden. Diese Prozedur beinhaltete eine Menge sich wiederholender Aktionen, so dass der Schlüssel darin besteht, keinen Autopiloten zu erhalten und durchgehend konzentriert zu bleiben.Beginnen Sie mit der Impfung von 30 Millilitern 2YT Tetracyclinbrühe mit 200 Mikrolitern der Samenkultur. Inkubieren Sie es für ungefähr drei Stunden bei 37 Grad Celsius mit 200 U / min Orbitalschütteln, bis sich die Bakterien in der mittleren Log-Phase befinden. Entsorgen Sie die Beschichtungslösung von der Platte in eine Spüle.Trocknen Sie es vorsichtig mit Papiertüchern ab. Dann fügen Sie 200 Mikroliter PB-Puffer zu jeder beschichteten Vertiefung hinzu. Entsorgen Sie den PB-Puffer von der Platte und trocknen Sie ihn auf Papiertüchern.Fügen Sie weitere 200 Mikroliter PB-Puffer zu jeder beschichteten Vertiefung der Platt

using-phage-display-to-develop-ubiquitin-variant-modulators-for-e3

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Ubiquitinierung ist ein wichtiger posttranslationale Modifikation durch eine Gruppe von drei Enzymen durchgeführt. Mutationen von Genen in dieser Modifikation beteiligt sind mit vielen verschiedenen menschlichen Krankheiten assoziiert. Hier beschreiben wir Protokolle, um Protein-Ubiquitinierung in kultivierten Zellen...

Detektion von Protein Ubiquitination

In diesem Video demonstrieren wir die Phagen-Display-Technik, um vorgefertigte Phagen zu isolieren, die Proteine mit hoher Affinität zum Zielprotein exprimieren.

Verwendung des Phagen-Displays zur Auswahl von Proteinen mit hoher Affinität zu einem Zielprotein

Phagen-Display ist eine leistungsfähige Technik, Proteine ​​oder Proteineinheiten, die mit einem immobilisierten Molekül von Interesse in Wechselwirkung zu erfassen. Sobald eine Entscheidung über die Art der Phagen-cDNA-Bibliothek zu erstellen und zu Bildschirm gemacht worden ist, das hier beschriebene Protokoll ermöglicht eine effiziente Affinitätsselektion, die zu Identifizierung der Interaktionspartner.

Ein Protokoll für die Phagen-Display-und Affinity Auswahl mit rekombinantem Protein-Köder

Hier stellen wir eine Methode zur Auswahl neuartiger Varianten der E. coli-Biotin-Proteinligase BirA vor, die ein bestimmtes Zielpeptid biotinylatiert. Das Protokoll beschreibt die Konstruktion eines Plasmids zur bakteriellen Darstellung des Zielpeptids, die Erzeugung einer BirA-Bibliothek, die Auswahl und Charakterisierung von BirA-Varianten.

Bakterielles Peptid-Display zur Auswahl neuartiger Biotinylatierungsenzyme

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Ubiquitin (Ub) und Ubiquitin-Likes (Ubls) spezifische Proteome zu etablieren, um Änderungen dieser Art von post-translationalen Modifikationen (PTMs) zu identifizieren, die mit einer bestimmten Erkrankung wie einer Behandlung oder einem Phänotyp verbunden sind.

Profilierung von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen abhängigen posttranslationalen Änderungen und Identifizierung signifikanter Änderungen

Ziel dieses Manuskripts ist es, einen Überblick über die umfassenden biochemischen und funktionellen Studien der RING-Typ E3 Ubiquitin Ligasen zu präsentieren. Diese mehrstufige Pipeline mit detaillierten Protokollen validiert eine enzymatische Aktivität des getesteten Proteins und zeigt, wie die Aktivität mit der Funktion verknüpft werden kann.

Funktionelle Charakterisierung von RING-Typ E3 Ubiquitin Ligases In Vitro und In Planta

Die vorliegende Studie liefert detaillierte In-vitro-Ubiquitylierungs-Assay-Protokolle für die Analyse der katalytischen Aktivität der E3-Ubiquitin-Ligase.  Rekombinante Proteine wurden mit prokaryotischen Systemen wie der Escherichia coli-Kultur exprimiert.

In vitro Analyse der E3-Ubiquitin-Ligase-Funktion

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für einen Ubiquitylierungsassay eines spezifischen Substrats und einer E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzellen. HEK293T-Zelllinien wurden zur Proteinüberexpression verwendet, das polyubiquitylierte Substrat wurde durch Immunpräzipitation von Zelllysaten gereinigt und in SDS-PAGE aufgelöst. Immunoblotting wurde verwendet, um diese posttranslationale Modifikation zu visualisieren.

Evaluierung der Substratubiquitylierung mittels E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzelllysaten

Das hier verwendete Experiment zeigt eine Methode des molekularen Andockens in Kombination mit Sondentechnologien, um die Interaktion zwischen kleinen Molekülen der traditionellen chinesischen Medizin und Proteinzielen vorherzusagen und zu validieren.

Screening von Wirkstoffen der traditionellen chinesischen Medizin zur Hemmung der UCHL3-Aktivität basierend auf molekularer Docking- und Deubiquitinierungsenzymsondentechnologie

Ubiquitination ist ein entscheidender Regulator der intrazellulären Proteinfunktionen. Hier beschreiben wir zwei Zelllysemethoden zur Erkennung der Substratprotein-Ubiquitinationswerte in Säugetierzellen und vergleichen deren Wirksamkeit bei der Analyse von Ubiquitinationsniveaus. Die Proteinüberexpression in HEK293T Zellen wurde durch vorübergehende Transfektion induziert, und ubiquitinierte Proteine wurden durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen.

Vergleichende Strategien zur Nachweisung der Uquitination in Säugetierzelllysaten unter Verwendung von SMAD2/SMURF2 als Modell

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Ubiquitinierung von Streptococcus pneumoniae mit Säugetierzelllysat oder einem reinen Ubiquitin-Enzymkomplex, gefolgt von einer Behandlung mit gereinigtem VCP/p97-UFD1-NPLOC4-Proteinkomplex, um dessen bakteriolytische Aktivität zu bewerten, was die Untersuchung ubiquitinabhängiger Immuneffektoren ermöglicht.

In-vitro Rekonstitution der bakteriellen Ubiquitination und VCP/p97-vermittelte Elimination

Lernen Sie die Phagenanzeige zur Isolierung neuer Ubiquitin-Varianten als Modulatoren für E3-Ligasen. Diese Methode ermöglicht die Entwicklung spezifischer Bindemoleküle für therapeutische Anwendungen bei ubiquitinvermittelten Erkrankungen.

Verwendung von Phagenanzeige zur Entwicklung von Ubiquitin-Variantenmodulatoren für E3-Ligasen

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