Verwendung von Phagenanzeige zur Entwicklung von Ubiquitin-Variantenmodulatoren für E3-Ligasen
27. August 2021
Ubiquitinierung ist eine kritische posttranslationale Proteinmodifikation, deren Dysregulation mit zahlreichen menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht wurde. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Phagenanzeige verwendet werden kann, um neuartige Ubiquitin-Varianten zu isolieren, die die Aktivität von E3-Ligasen binden und modulieren können, die die Spezifität, Effizienz und Muster der Ubiquitinierung steuern.
Die Phagenanzeige hilft uns nicht nur, die Bindungseigenschaften klinisch wichtiger Enzyme zu untersuchen, sondern auch Modulatoren für diese Enzyme und die entsprechenden Erkrankungen zu entwickeln. Die Phagenanzeige kann verwendet werden, um neuartige Bindemittel für eine Vielzahl von Zielproteinen zu entwickeln, und ist auch einfacher durchzuführen als andere herkömmliche Anzeigemethoden. Diese Prozedur beinhaltete eine Menge sich wiederholender Aktionen, so dass der Schlüssel darin besteht, keinen Autopiloten zu erhalten und durchgehend konzentriert zu bleiben.
Beginnen Sie mit der Impfung von 30 Millilitern 2YT Tetracyclinbrühe mit 200 Mikrolitern der Samenkultur. Inkubieren Sie es für ungefähr drei Stunden bei 37 Grad Celsius mit 200 U / min Orbitalschütteln, bis sich die Bakterien in der mittleren Log-Phase befinden. Entsorgen Sie die Beschichtungslösung von der Platte in eine Spüle.
Trocknen Sie es vorsichtig mit Papiertüchern ab. Dann fügen Sie 200 Mikroliter PB-Puffer zu jeder beschichteten Vertiefung hinzu. Entsorgen Sie den PB-Puffer von der Platte und trocknen Sie ihn auf Papiertüchern.
Fügen Sie weitere 200 Mikroliter PB-Puffer zu jeder beschichteten Vertiefung der Platte hinzu. Inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für eine Stunde mit 300 U / min Orbitalschütteln. Tauen Sie die Phagenbibliothek auf Eis auf und verdünnen Sie sie dann auf das 100-fache der Bibliotheksvielfalt in PBS.
Fügen Sie die Polyethylenglykol-Natriumchloridlösung bei einem Fünftel des verdünnten Bibliotheksvolumens hinzu und inkubieren Sie die Lösung 30 Minuten lang auf Eis. Als nächstes zentrifugieren Sie die Lösung bei 11.000 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und zentrifugieren Sie ihn für weitere zwei Minuten, um den verbleibenden Überstand herunterzuziehen und das Phagenpellet zu konzentrieren.
Resuspendieren Sie das Phagenpellet vorsichtig in einem Milliliter PBT-Puffer pro zu analysierendem Zielprotein, typischerweise insgesamt vier. Fügen Sie 100 Mikroliter Phagenbibliothek zu jeder beschichteten Vertiefung in der Kontrollplatte hinzu. Inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für eine Stunde mit 300 U / min Orbitalschütteln.
Entsorgen Sie den PB-Puffer von der Zielplatte in die Spüle und trocknen Sie die Platte auf Papiertüchern. Übertragen Sie alle 100 Mikroliter der Phagenbibliothek in der Steuerplatte in jede beschichtete Vertiefung der Zielplatte. Inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für eine Stunde mit 300 U / min Orbitalschütteln.
Als nächstes entfernen Sie die Phagenbibliothek von der Platte und waschen Sie die beschichteten Vertiefungen viermal mit PT-Puffer. Drehen Sie die Platte um und klopfen Sie auf ein Papiertuch, um die letzten Puffertropfen zu entfernen. Fügen Sie 100 Mikroliter 0,1 molare Salzsäure zu jeder beschichteten Vertiefung hinzu, um den Phagen zu eluieren.
Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für fünf Minuten mit 300 U / min Orbitalschütteln. Danach neutralisieren Sie den pH-Wert, indem Sie 12,5 Mikroliter pH 11 ein molares Trishydrochlorid zu jeder beschichteten Vertiefung hinzufügen. Übertragen Sie den eluierten Phagen aus allen acht Vertiefungen in ein einziges 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.
Während des Transfers auf und ab pipettieren, um die Lösungen homogen zu machen und die gesamte Flüssigkeit aus den Vertiefungen abzusaugen. Dem eluierten Phagen 10% BSA zuführen, um die Endkonzentration auf 1% zu erhöhen Lagern Sie das Mikrozentrifugenröhrchen bei vier Grad Celsius. Dies ist die runde eins Ausgabe.
Bereiten Sie eine Samenkultur für die Kultivierung des Phageneintrags für die nächste Auswahlrunde vor, indem Sie fünf Milliliter 2YT Tetracyclin-Samenkultur mit einer isolierten E. coli-Kolonie aus einer Agarplatte impfen. Inkubieren Sie es über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 200 U / min Orbitalschütteln. Verdünnen Sie das Zielprotein in den Runden zwei und drei Röhrchen mit einer geeigneten Menge PBS.
Nehmen Sie die Hälfte des Inhalts der Runden zwei und drei Röhrchen und beschichten Sie vier Vertiefungen pro Zielprotein in einer 96-Well-Bindungsplatte für die nächste Runde. Als nächstes verwenden Sie die Hälfte des round one-Ausgangs, um drei Milliliter Mid-Log-Phasenzellen zu impfen. Inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten mit 200 U / min Orbitalschütteln.
M13KO7-Helferphagen in eine Endkonzentration von 10 Milliarden PFU pro Milliliter geben. Inkubieren Sie es erneut bei 37 Grad Celsius für eine Stunde mit 200 U / min Orbitalschütteln. Nach einer Stunde die gesamten drei Milliliter Kultur auf 30 Milliliter 2YT Carbenicillin-Kanamycin-Lösung übertragen.
Wachsen Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 200 U / min Orbitalschütteln. Die repräsentativen Ergebnisse für eine Ubiquitin-Variantenselektion gegen UBE4B sind hier dargestellt. UBVs wurden von der höchsten bis zur niedrigsten Frequenz bestellt.
Sequenzen stellen die diversifizierte Ubiquitinregion im UBV mit allen randomisierten Resten dar. Die relative Bindungsaffinität der Bindemittel zum Wildtyp-Zielprotein, zum mutierten Zielprotein sowie zu Off-Target-Proteinen wird mittels enzymgebundener Immunosorbent-Assays oder ELISA gemessen. Alle ELISA-Absorptionen wurden gegen 96 gemittelte BSA-ELISA-Scores und 96 gemittelte GST-ELISA-Scores normalisiert.
Dunkleres Grün stellt die stärkere relative Bindung dar. GST wurde als Kontrolle für unspezifische Bindung aufgenommen, da das Zielprotein GST-markiert ist. Die ELISA-Ergebnisse werden hier grafisch dargestellt.
Die x-Achse stellt die UBVs und die y-Achse die entsprechende normalisierte Absorption dar. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, dass Sie die Lösung nicht in der Platte entsorgen, nachdem Sie die Salzsäure hinzugefügt haben. Die Phagen sind nun in Lösung suspendiert und Sie möchten diese behalten, damit Sie nachträgliche Anreicherungs-Endanalysen oder beides durchführen können.
Nach diesem Verfahren sollte eine Sequenzierung durchgeführt werden, um die UBV-Frequenzen zu bestimmen. ELISAs und IC50-Assays können durchgeführt werden, um Bindungswirksamkeiten bzw. hemmende Wirksamkeiten zu bestimmen und auch um zu bestimmen, welche UBVs weiter charakterisiert werden sollen.
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Überblick
Dieser Artikel behandelt die Verwendung der Phagen-Display-Technik zur Isolierung neuartiger Ubiquitin-Varianten, die E3-Ligasen modulieren können, die an der Ubiquitinierung beteiligt sind. Die Ubiquitinierung ist eine entscheidende posttranslationale Modifikation, die mit verschiedenen menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht wird.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Biochemie
- Protein-Engineering
Hintergrund
- Die Ubiquitinierung ist wesentlich für die Regulierung des Proteinabbaus und zellulärer Prozesse.
- Eine Fehlregulation der Ubiquitinierung wird mit zahlreichen Krankheiten in Verbindung gebracht.
- Die Phagen-Display-Technik ist eine leistungsstarke Methode zur Entdeckung von Proteininteraktionen.
- Diese Methode ermöglicht die Entwicklung spezifischer Modulatoren für Enzyme.
Zweck der Studie
- Neuartige Ubiquitin-Varianten mittels Phagen-Display zu isolieren.
- Verständnis dafür zu gewinnen, wie diese Varianten die E3-Ligase-Aktivität beeinflussen können.
- Die Auswirkungen der Ubiquitin-Modulation in Krankheitskontexten zu untersuchen.
Verwendete Methoden
- Impfung bakterieller Kulturen in 2YT-Tetracyclin-Bouillon.
- Inkubation bei 37 Grad Celsius mit orbitalem Schütteln.
- Verwendung von Phagen-Display-Techniken für Bindungsassays.
- Isolierung und Charakterisierung von Ubiquitin-Varianten.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung neuartiger Ubiquitin-Varianten.
- Nachgewiesene Bindungseigenschaften an E3-Ligasen.
- Potenzial dieser Varianten zur Modulation von Ubiquitinierungsmustern.
- Erkenntnisse über die Rolle der Ubiquitinierung in Krankheitsmechanismen.
Schlussfolgerungen
- Phagen-Display ist eine effektive Methode zur Entdeckung von Ubiquitin-Varianten.
- Die Modulation der E3-Ligase-Aktivität könnte therapeutische Implikationen haben.
- Weitere Forschung ist erforderlich, um die klinischen Anwendungen dieser Erkenntnisse zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Phage display-driven engineering of ubiquitin variants (UbVs) enables precise modulation of E3 ligases, a critical inflection point for target validation in ubiquitin-proteasome system research. This approach enhances predictive confidence in early discovery by generating high-affinity, specific binders for mechanistic de-risking and functional interrogation of E3 ligase biology. The resulting UbVs support portfolio triage and prioritization by providing robust tools for downstream assay development and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of E3 ligase function using engineered UbVs with improved affinity and specificity.
- Supports biological de-risking by isolating variants that discriminate between wildtype and mutant or off-target proteins.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and mechanistic studies through iterative selection and enrichment.
Screening & Assay Development
- Provides validated UbVs for use in ELISA and IC50 assays to quantify binding and inhibitory efficacy.
- Enables reproducible, quantitative assessment of UbV-target interactions across multiple rounds of selection.
- Supports assay standardization and scalability for reliable compound evaluation and screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered UbVs with disease-relevant E3 ligases for translational biomarker studies when supported by downstream characterization.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling further functional and inhibitory profiling of selected UbVs.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by providing specific molecular tools for pathway interrogation.
Pipeline & Workflow Integration
This phage display platform integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and quantitative assay development for E3 ligase modulators.
- Discovery Biology: Iterative selection and enrichment clarify E3 ligase binding pathways and validate target engagement.
- Screening: ELISA and IC50 assays with UbVs deliver reproducible, quantitative outputs for downstream evaluation.
- Analytics: Sequencing and absorbance normalization enable robust comparison of UbV binding profiles and selection frequencies.
- Translational Research: Characterized UbVs can be advanced for further disease-relevant studies as supported by binding and inhibition data.
- Enterprise Reuse: The phage display workflow is adaptable for diverse E3 ligases and other protein targets, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in E3 ligase target validation.
- Operational Value: Standardizes binder selection and assay development for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of validated targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of E3 ligase modulators across discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in phage display, protein engineering, and quantitative binding assays.
- Demands access to bacterial culture, phage handling, and ELISA instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of selection, washing, and analytical protocols.
- Adaptable to various E3 ligases and target proteins with appropriate library design.
- Dependent on rigorous washing and selection to avoid enrichment of weak or promiscuous binders.
