Live-Bildgebung des mitochondrialen Systems in kultivierten Astrozyten
November 16th, 2021
Dieser Artikel beschreibt die Methode zur mitochondrialen Zeitraffer-Bildgebung von Astrozytenkulturen, die mit dem MitoTimer-Biosensor ausgestattet sind, und die daraus resultierende multiparametrische Analyse der mitochondrialen Dynamik, Mobilität, Morphologie, Biogenese, Redoxzustand und Umsatz.
Dieses Protokoll maximiert die Leistungsfähigkeit der Mikroskopie als Methode zur Verfolgung der mitochondrialen Dynamik innerhalb einzelner Zellen über lange Erfassungszeiträume erheblich. Im Gegensatz zum Zeitraffer bei einer festen Gruppe von Zellen oder bei jeweils einer Zelle steuert die Normalisierung auf eine Baseline für jedes gemessene Kriterium in jeder Zelle die Heterogenität zwischen den Zellen. Mit einem Mikroskop, das mit einer automatisierten Plattform und einem angepassten viralen Vektor ausgestattet ist, können wir dieses Protokoll für jeden Zelltyp verwenden.
Beginnen Sie mit der Beschichtung von 20.000 bis 25.000 Zellen pro Quadratzentimeter in Multi-Well-Schalen und lagern Sie sie bei 37 Grad Celsius unter einer Atmosphäre, die 5% Kohlendioxid für den Rest des Experiments enthält. Nach acht Tagen in vitro 0,6 Pikogramm P24-Antigen pro Zelle des lentiviralen Vektors hinzufügen, der für den mitochondrialen Biosensor MitoTimer kodiert, der in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt ist. Führen Sie nach 11 Tagen in vitro zwei Wäschen mit vorgewärmtem sterilem PBS durch und fügen Sie frisches Astrozytenmedium ohne Phenolrot hinzu.
Beurteilen Sie das astrozytäre mitochondriale System mindestens drei bis fünf Tage nach den lentiviralen Infektionen mit LV-G1 MitoTimer. Wählen Sie fünf Astrozyten pro Vertiefung mit einem mitochondrialen Netzwerk, das ausreichende Mengen an LV-G1 MitoTimer mit einer 40-fachen Vergrößerung ausdrückt. Achten Sie darauf, Astrozyten flach und groß wie möglich auszuwählen und sich nicht in Zellhaufen zu befinden.
Erfassen Sie dann Fluoreszenzbilder mit sequentieller Anregung bei 490 Nanometern für den grünen Kanal und 550 Nanometern für den roten Kanal mit grünen und roten Fluoreszenzsignalen und mit einer Vergrößerung von 150 mal für jede Koordinate. Wählen Sie den ersten Frame für rote und grüne Kanäle für jede Bildsequenz aus, indem Sie auf ND Processing klicken und Frame auswählen. Führen Sie dann den roten und den grünen Kanal zusammen, indem Sie Conversions und Merge-Kanal auswählen.
Um die Bildschattierung zu korrigieren, wählen Sie Vorverarbeitung und dann automatische Schattierungskorrektur. Wenden Sie den Rolling Ball-Algorithmus an, indem Sie Pre-Processing und Rolling Ball auswählen. Um binäre Masken für jedes Mitochondrium zu generieren, wählen Sie Segmentierung und Schwellenwert.
Entfernen Sie alle Objekte, die durch den Rahmen abgeschnitten sind, indem Sie binäre Verarbeitung auswählen und den Rahmen berühren. Wählen Sie Messung und dann Objektbereich, EEQ-Durchmesser, Länge, Breite, Rauheit, Zirkularität oder Dehnung aus, um Oberfläche, Durchmesser, Länge, Breite, Rauheit, Zirkularität oder Dehnung zu messen. Stellen Sie eine Gruppe mit diesen Messungen zusammen und benennen Sie sie in MOFO-Daten um.
Wählen Sie dann Messung und dann mittlere Intensität aus, um die mittleren grünen und roten Intensitäten zu messen. Und Verhältnis, um das Verhältnis von Rot zu Grün zu messen. Gruppieren Sie nun composer mit diesen Messungen und benennen Sie sie in Verhältnisdaten um.
Exportieren Sie schließlich die Tabelle in eine CSV-Datei, indem Sie Referenz und Tabelle in CSV auswählen, und speichern Sie dann das GA 3-Analyseskript, indem Sie Speichern unter auswählen.Beginnen Sie, indem Sie das Tracking-Modul in NIS öffnen und Ansicht, Analyse und Nachverfolgung auswählen. Klicken Sie auf Neuen ROI definieren. Wählen Sie mit dem automatischen Erkennungstool 25 bis 50 Mitochondrien auf dem ersten Bild der Bildsequenz aus und klicken Sie dann auf Automatisch erkannte ROIs-Analyse verfolgen.
Löschen Sie ggf. die falschen ROI-Tracks und exportieren Sie die Tabelle in eine CSV-Datei. Protokollieren Sie die Transformation der Messungen vor der Verarbeitung manuell. Normalisieren Sie für jede Analyse und jeden Zeitrahmen manuell die resultierenden Daten durch den Mittelwert, der in der Referenzerfassung erhalten wurde.
Führen Sie dann eine statistische Analyse durch, indem Sie eine bidirektionale Übereinstimmung mit einem Nova durchführen. Die Primärkultur von Astrozyten, die mit LV-G1 MitoTimer infiziert waren, zeigte reduzierte ausgewogene und oxidierte mitochondriale Netzwerke mit unterschiedlichen Fragmentierungsgraden. Vor der Wasserstoffperoxidbehandlung zeigten Astrozyten, die LV-G1 MitoTimer exprimierten, eine heterogene mitochondriale Größe in verschiedenen grünen und roten Fluoreszenzintensitäten.
Die mitochondriale Morphologie von Astrozytenkulturen wurde nach sechsstündiger Inkubation mit Wasserstoffperoxid fragmentiert. Es war noch offensichtlicher 12 Stunden nach der Behandlung ohne ihre Durchmesser mit seitdem Sphäroizitätsreduktion. In Bezug auf Redoxzustand und Umsatz stieg drei Stunden nach einer Wasserstoffperoxidbehandlung der Anteil der grünen Mitochondrien in Astrozyten an.
Bezüglich der Dynamik und Mobilität drei Stunden nach der Behandlung. Alle Kriterien wurden vorübergehend erhöht. Diese Technik eignet sich für viele verschiedene Fragestellungen.
Zum Beispiel untersuchen wir im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen die estrozytäre Toxizität verschiedener Moleküle, die im Gehirn sezerniert werden.
Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine Methode für die mitochondriale Zeitraffer-Bildgebung in Astrozytenkulturen unter Verwendung des MitoTimer-Biosensors. Er untersucht mitochondriale Dynamiken, einschließlich Mobilität, Morphologie, Biogenese, Redox-Zustand und Turnover aufgrund verschiedener Behandlungen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Bildgebungstechniken
Hintergrund
- Astrozyten spielen eine entscheidende Rolle für die Gehirnfunktion und -gesundheit.
- Mitochondriale Dynamiken sind für den zellulären Stoffwechsel und die Signalübertragung wesentlich.
- Die Untersuchung dieser Dynamiken liefert Einblicke in neurodegenerative Erkrankungen.
- Die Verfolgung einzelner Zellen im Zeitverlauf ermöglicht eine detailliertere Analyse.
Zweck der Studie
- Ein zuverlässiges Protokoll zur Analyse des mitochondrialen Verhaltens in Astrozyten zu etablieren.
- Mitochondriale Eigenschaften vor und nach der Behandlung mit Wasserstoffperoxid zu vergleichen.
- Die Anwendbarkeit der Technik für verschiedene Forschungsfragen hervorzuheben.
Verwendete Methoden
- Diese Studie verwendet eine Zellkultur-Plattform für die Astrozyten-Bildgebung.
- Astrozyten werden mit einem lentiviralen Vektor infiziert, der für MitoTimer kodiert.
- Das Fluoreszenz-Bildgebungsprotokoll umfasst das Erfassen von Signalen bei spezifischen Wellenlängen.
- Wichtige Zeitpläne umfassen 8 Tage in vitro für die Transduktion und Bewertungen in verschiedenen Intervallen nach der Behandlung.
Hauptergebnisse
- Eine Verringerung der mitochondrialen Integrität wurde nach oxidativem Stress beobachtet.
- Heterogenität in der mitochondrialen Größe und dem Redox-Zustand wurde vor und nach der Behandlung mit Wasserstoffperoxid festgestellt.
- Dynamische Verhaltensweisen wie Mobilität und Morphologie zeigten unterschiedliche Reaktionen auf die Behandlung.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie demonstriert effektiv eine Methode zur Quantifizierung mitochondrialer Dynamiken in Astrozyten.
- Die Ergebnisse bieten Einblicke in die Rolle des oxidativen Stresses für die Gesundheit von Astrozyten.
- Solche Methoden könnten entscheidend für das Verständnis neurodegenerativer Mechanismen sein.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This method enables longitudinal tracking of mitochondrial dynamics in astrocytes, supporting target validation in neurodegenerative disease models by linking oxidative stress to measurable changes in mitochondrial morphology and redox state. It provides quantitative, single-cell resolution data that enhances predictive confidence in early discovery by de-risking mechanistic hypotheses about glial contributions to pathology. The approach is applicable to screening mitochondrial modulators in disease-relevant systems, offering translational continuity from in vitro findings to preclinical validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying mitochondrial fragmentation and redox shifts in astrocytes under oxidative stress.
- Operational Value: Enables functional target validation through longitudinal imaging of mitochondrial mobility and biogenesis in live cells.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that normalize mitochondrial dynamics in disease-relevant glial models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized mitochondrial morphology and intensity metrics for high-content screening of neuroprotective agents.
- Quantitative Outputs: Provides red-to-green ratio and morphological parameters (area, length, circularity) as reproducible endpoints for compound screening.
- Scalability: Compatible with automated microscopy platforms for multi-well imaging and batch analysis of mitochondrial responses.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models astrocytic mitochondrial dysfunction implicated in neurodegeneration, enabling mechanistic de-risking of targets.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase imaging with preclinical validation by tracking mitochondrial turnover and redox state over time.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria based on normalization of mitochondrial networks following treatment.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing mechanistic readouts that inform compound selection and optimization in neurodegenerative disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking mitochondrial morphology changes to oxidative stress in astrocytes.
- Screening: Enables assay readiness through standardized mitochondrial biosensor expression and imaging parameters.
- Analytics: Delivers quantitative measurements (mean intensity, ratio, object morphology) for comparing experimental conditions across timepoints.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling redox state and turnover changes relevant to neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying mitochondrial dynamics across multiple cell types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in glial mitochondrial responses to stress.
- Operational Value: Ensures reproducibility via baseline normalization and automated image processing workflows.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through phenotypic screening in astrocytes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by identifying compounds that rescue mitochondrial network integrity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, lentiviral transduction, and mitochondrial biosensor validation.
- Dependent on automated microscopy platforms with sequential excitation and environmental control.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition and analysis protocols for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for different astrocyte sources or disease models.
- Limited by the need for prolonged culture periods and precise timing post-infection for optimal biosensor expression.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Rat Hippocampal Astrocyte Primary Culture
1:25
Long-Term Monitoring of the Mitochondrial System
2:13
Analysis of Individual Mitochondrial Morphology and LV-G1-MitoTimer Ratio
3:54
Analysis of Mitochondrial Motility
4:28
Data Transformation, Normalization, and Statistical Analysis
4:51
Results: Analysis of the Effects of H2O2 on the Mitochondrial System of Astrocytes
5:53
Conclusion
